阅读说明：本技术 OsLAC20基因在提高水稻产量中的应用 (Application of OsLAC20 gene in improving rice yield ) 是由 何瑞瑞 张玉婵 杨宇薇 杨露 陈月琴 于 2020-04-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了OsLAC20基因在增加水稻结实率、提高水稻产量中的应用。本发明研究发现,水稻中OsLAC20基因的敲除会显著性增加水稻的结实率,增大水稻的籽粒和穗型,表明OsLAC20基因是水稻结实率和产量的负调控基因。因此,对OsLAC20的表达调控可用于培育高产水稻,为培育高结实率或高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法。(The invention discloses application of OsLAC20 gene in increasing rice setting rate and rice yield. The research of the invention finds that the knockout of the OsLAC20 gene in the rice can obviously increase the maturing rate of the rice and increase the kernel and spike type of the rice, and the OsLAC20 gene is a negative regulation gene of the maturing rate and the yield of the rice. Therefore, the expression regulation of OsLAC20 can be used for cultivating high-yield rice, and a novel, simple and effective method is provided for cultivating high-maturing-rate or high-yield rice.)

OsLAC20基因在提高水稻产量中的应用

技术领域

本发明涉及植物育种技术领域，更具体地，涉及OsLAC20基因在提高水稻产量中的应用。

背景技术

粮食问题是当今世界所面临的几个难题之一。寻找影响水稻产量相关特性的基因一直以来都是提高粮食产量的研究重点。目前已经发现了不少影响水稻产量的基因，对提高水稻产量提供了理论基础。但为了解决不断增长的人口与逐渐减少的耕地面积的矛盾，发现更多调节水稻产量的基因仍是急需解决的大问题。

水稻产量是一个复杂的农艺性状，它主要受单位面积有效穗数、每穗粒数及千粒重三个要素决定。其中每穗粒数还受到结实率的影响。因此，寻找调控结实率、千粒重和穗型等产量性状的基因不仅是重要的基础研究，也对生产有重要的指导意义。目前已经有一些相关的蛋白编码基因被鉴定出来。例如，PTB1是调控水稻结实率的基因，它通过影响花粉管生长而正调控结实率；GSD1则通过影响胞间连丝电导率而调控水稻结实率；THIS1则既影响结实率也影响水稻株行。Ghd7和Ghd8同时控制水稻每穗粒数。Ghd7编码一个CCT结构域蛋白，Ghd8编码一个CCAAT-box binding蛋白复合体的一个亚基。DEP1是控制穗型和穗粒数的一个关键基因，C端缺失的dep1突变蛋白能够促进细胞分裂，导致穗粒数增加，进而显著提高水稻产量。GW2是较早克隆到的一个控制粒宽同时也控制粒重的主效QTL，编码一个E3泛素连接酶，推测GW2通过参与对细胞分裂相关的蛋白的泛素化降解过程，进而影响水稻籽粒颖壳的发育和胚乳的发育过程，调控水稻籽粒大小。GS3是一个控制水稻粒长和粒重的主效QTL，而对水稻粒宽和粒厚影响较小。但是，目前关于OsLAC20基因在水稻产量中的应用，还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，OsLAC20基因在提高水稻产量中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明研究发现，水稻中OsLAC20基因的敲除会显著性增加水稻的结实率，增大水稻的籽粒和穗型，表明OsLAC20基因是水稻结实率和产量的负调控基因。因此，对OsLAC20的表达调控可用于培育高产水稻，为培育高结实率或高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法。

因此，本发明请求保护OsLAC20基因的如下用途：

OsLAC20基因在提高水稻产量中的应用。

OsLAC20基因在增加水稻结实率中的应用。

OsLAC20基因在增大水稻的籽粒和穗型中的应用。

OsLAC20基因在培育高结实率、高产水稻中的应用。

本发明还提供OsLAC20基因在培育高结实率和/或高产水稻中的应用。

上述高产是指籽粒更大、每穗粒数更多、千粒重更重和/或每穗有效粒数更多。

其中，所述OsLAC20基因的序列公开如下：水稻基因组数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，OsLAC20的基因编号是：LOC_Os11g42220，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种培育高结实率和/或高产水稻的方法，具体是在水稻中敲除OsLAC20基因，或沉默和/或抑制OsLAC20基因的表达，从而得到高结实率和/或高产水稻。

优选地，所述敲除OsLAC20基因的方法可以为CRISPR-Cas9技术。

作为一种可选择的具体实施方案，本发明提供了一种培育高结实率和/或高产水稻的方法，即利用CRISPR-Cas9技术敲除水稻中OsLAC20基因构建水稻突变株的方法，包括如下步骤：

S1.构建OsLAC20敲除质粒；

S2.OsLAC20敲除质粒转化水稻愈伤组织；

S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化。

其中，步骤S1所述构建OsLAC20敲除质粒的方法如下：

用在线软件CRISPR-P(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)在OsLAC20上设计两个靶位点。通过引物5’-gccgACACCCGTCAAGGATGTAC-3’和3’-ACACCCGTCAAGGATGTACgttt-5’；以及引物5’-gttgCCCACTATCACATGATCG-3’和3’-GCCCACTATCACATGATCGgttt-5’构建两个靶位点的sgRNA表达盒；将表达盒连入以双元载体pCAMBIA-1300为骨架的pYLCRISPR/Cas9载体并转化大肠杆菌，完成OsLAC20敲除质粒的构建。

本发明对上述突变株进行详细的产量相关表型分析后发现，用CRISPR-Cas9技术敲除粒长显著大于野生型，并且每穗千粒重都也明显高于野生型。这说明OsLAC20影响产量相关指标。因此通过上述技术敲除OsLAC20可以达到增加产量的效果，可以通过遗传手段完全消除转基因痕迹，非常适宜于投入生产使用。

综上所述可以得出结论：OsLAC20基因是水稻产量的负调控基因，用各种手段对OsLAC20基因的敲除或者敲低均可以作为培育高产水稻的一种全新的技术手段，可显著提高水稻的产量。尤其是CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20基因时可通过简单的遗传手段筛除转基因痕迹，而不影响对水稻产量的提升效果，安全有效，可大规模推广使用，且不会对环境造成污染，食用安全。因此对OsLAC20的表达调控可用于培育高产水稻。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了OsLAC20基因在提高水稻产量中的应用。本发明研究发现用CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20可以显著提高增大谷粒大小与千粒重，表明OsLAC20基因是水稻产量的负调控基因，OsLAC20的表达调控可用于培育高产水稻，为培育高结实率或高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法。同时明通过分子生物学技术培育高产水稻，尤其是通过CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20可以通过遗传手段完全消除转基因痕迹，不但水稻的产量高，而且不会对环境造成污染，食用安全。

附图说明

图1为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株的基因型检测。

图2为野生型与突变株全株的比较，其中，左边为野生型，右边为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20的突变株。

图3为野生型与突变株的穗大小比较，其中，左边为野生型，右边为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20的突变株。

图4为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株的种子粒长比较。其中，上排为野生型，下排为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20的突变株。

图5为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株的种子粒宽比较。其中，上排为野生型，下排为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20的突变株。

图6为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株的千粒重的统计比较。灰色柱子表示野生型，黑色柱子表示CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1OsLAC20敲除水稻突变株的构建

1、OsLAC20敲除质粒的构建

用在线软件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)在OsLAC20上设计两个靶位点。通过引物5’-gccgACACCCGTCAAGGATGTAC-3’(SEQ ID NO：2)和3’-ACACCCGTCAAGGATGTACgttt-5’(SEQ ID NO：3)及引物5’-gttgCCCACTATCACATGATCG-3’(SEQID NO：4)和3’-GCCCACTATCACATGATCGgttt-5’(SEQ ID NO：5)构建两个靶位点的sgRNA表达盒。

将表达盒连入以双元载体pCAMBIA-1300为骨架的pYLCRISPR/Cas9载体并转化大肠杆菌，完成OsLAC20敲除质粒的构建。

这里的试验操作采用本领域的常规技术。实验中所涉及的载体、试剂等均为市售。

2、OsLAC20敲除质粒转化水稻愈伤组织

将上述构建的表达质粒转化根癌农杆菌(市售)，所述转化方法为本领域常规操作，然后将该转化有OsLAC20敲除质粒的根癌农杆菌菌种，在含有利福平，卡那霉素和潮霉素的YEP培养基(10g酵母膏，10g蛋白胨，5g NaCl，15g琼脂)上进行划线培养，28℃黑暗培养2～3天后挑取单菌落涂布于含有相同抗生素的YEP培养基上，28℃黑暗培养2天，刮取适量菌体悬浮于含有100μM乙酰丁香酮的液体共培养基中，使之稀释至OD₅₅₀为0.3左右，28℃摇床(140rpm)培养40分钟，即制备得到根癌农杆菌浸染液，可用于侵染。

取水稻的成熟种子剥去颖壳，用75％酒精浸泡1分钟后用无菌水清洗多次，然后用1％次氯酸钠处理两次，每次20分钟，期间摇动多次，无菌水清洗多次后用无菌滤纸吸干水分，接到诱导培养基(N6大量，B5微量，B5有机，铁盐，2mg/L 2,4-D，30g/L蔗糖，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，3.0g/L植物凝胶)上，将诱导出的胚性愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上继续培养，每隔2～3个星期再挑取生长状态好的愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上进行继代培养。

挑取淡黄色、颗粒状、结构致密、生长状态好的愈伤组织到无菌三角瓶中适当干燥处理后，加入上述制备好的根癌农杆菌侵染液侵染20分钟，期间适当摇动几次。侵染后将愈伤组织放在加有无菌滤纸的培养皿中，风干1～2小时。然后把愈伤组织接到加有一层滤纸的共培养基上，再风干半小时左右后，置于26℃黑暗培养2～3天。

3、转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化

取出共培养后的愈伤组织放在加有三层滤纸的无菌培养皿中，干燥1天左右，再接到筛选培养基上，置于26℃黑暗培养14～21天。共筛选两次。挑取生长状态好的抗性愈伤组织接到预分化培养基上，26℃光照培养。21天后，把生长状态好及出现绿点的抗性愈伤组织接到分化培养基上，使愈伤组织进行再生。待抗性愈伤组织分化出的小苗长到4～6cm时，将其转到生根培养基上，继续在26℃光照培养。待小苗长至10～12cm，叶片宽大、颜色深绿且根系生长健全后，洗掉培养基及其基部附着的愈伤组织，在室外进行盆栽种植，即得到转基因水稻上述筛选培养基的配方为：N6培养基大量+MS培养基微量+B5培养基少量+1g/L水解酪蛋白+1g/L脯氨酸+2mg/L(2，4-D)+30g/L蔗糖+潮霉素50mg/L+头孢500mg/L+4g/L植物凝胶，筛选培养基的终PH＝5.8。

上述预分化培养基的配方为：MS培养基+1g/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖+1mg/L(2，4-D)+头孢500mg/L+潮霉素50mg/L+4g/L植物凝胶，预分化培养基的终pH＝5.8。

上述分化培养基的配方为：MS培养基+2mg/L(6-BA)+0.5mg/L萘乙酸+1mg/L激动素+30g/L蔗糖+3％山梨醇+4g/L植物凝胶，分化培养基的终pH＝5.8。

上述生根培养基的配方为1/2MS培养基。

本实施例中所采用的MS培养基、1/2MS培养基和N6培养基等的配方均采用本领域的常规配方。上述各培养基配方中所涉及的试剂均为市售。

4、CRISPR/Cas9突变株的鉴定

根据MSU库中基因组DNA的序列在敲除靶点的上下游约100～200bp的位置设计检验引物。提取突变株叶片或其他组织中的DNA为模板，用outer引物经过高保真酶PCR扩增获得DNA片段，然后产物凝胶电泳后切胶回收，用设计好的inner引物送公司测序。测序结果通过网站分析敲除效果：http://dsdecode.scgene.com/home/。

实施例2突变株水稻中OsLAC20突变株水稻种植和表型分析

(1)CRISPER-Cas9敲除突变株使用两条染色体上OsLAC20均失活的突变株。水稻种子用水萌发，在平盘上种植一周后，转种于大田中长至谷粒成熟。其中，种子大小，千粒重比较使用完全成熟并烘干后的种子。所有统计数据均为多于30棵的水稻苗的平均值。

(2)CRISPER-Cas9敲除OsLAC20突变株分析结果：如附图1～6所示，CRISPER-Cas9敲除OsLAC20突变株可以增加水稻的生长速度，显著提高水稻的产量，增大谷粒的大小与千粒重。

图1为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株的基因型检测，结果表明移码突变。

图2为野生型与突变株全株的比较，其中，左边为野生型，右边为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20的突变株，表明CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20的突变株比WT植株高大。

图3为野生型与突变株的穗大小比较，其中，左边为野生型，右边为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20的突变株，表明敲除OsLAC20的突变株穗型比WT大很多。

图4为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株的种子粒长比较。其中，上排为野生型，下排为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20的突变株，表明敲除OsLAC20突变株的种子粒长比WT长很多。

图5为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株的种子粒宽比较。其中，上排为野生型，下排为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20的突变株，表明敲除OsLAC20突变株的种子粒宽比WT宽很多。

图6为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株的千粒重的统计比较。灰色柱子表示野生型，黑色柱子表示CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株。表明CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC20突变株千粒重比WT重很多。

序列表

<120> OsLAC20基因在提高水稻产量中的应用

<141> 2020-04-09

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1743

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggtggcct ctctcctttg caccgtcgcc gttgcggttc tcgccgtggc agcggtcggc 60

ggcgaggcgg gggtggtgga gcacaccttc gtggtgcacg agatgaacgt gacgcacttg 120

tgcaacacga ccaagatctt tgtggtgaat gggcagttac cgggcccgac ggtggacgtg 180

acagagggtg acacagtggt catccacgtc gtcaacaaaa taccacatgg gcttaccatc 240

cactggcacg gtgttcgcca attgaggagc tgctgggccg atggggcagg cttcatcacc 300

gagtgcccca tcccgcctgg cagtgagcgc acctaccgct tcaatgttac cgaccaagtc 360

ggcacgctgt ggtggcacgc ccacgtcacc tgcctccgct ccaccatcaa cggcgcattc 420

atcatccgtc cccgcgatgg gaagtacccc ttcccgacac ccgtcaagga tgtaccgatc 480

atcataggtg aatggtggga gctcgacctc gttgagctgg acaggaggat gagggatggc 540

aacttcgacg acaacccgtt gtcggctacg atcaacggga agcttggcga ccttagcaac 600

tgctccggca tagtggagga gagctttgtt ctcaacgtga agcatgggga gagctacctt 660

ctccgggtca tcaacactgc attcttctcc gaatactatt tcaaggtcgc cggccacacg 720

ttcacggtgg ttggcgctga tggcaactac ctgacgccgt tcaagacaga catggtcacc 780

gttgcccccg gcgaggccat tgacgtgctc atggtcgccg acgccccacc agcccactat 840

cacatgatcg cgttggctaa ccaaccaccg gagccagacc cacagatccc gaagtacatc 900

tctcgtggcc tcgtccgcta caccggtgtc gatgccaaca acaatggcct accggtccca 960

atgccgatca tgcctaacca acacaacacc atgccatcct actacttcca tgccaatctt 1020

actggcctca tgcatccgaa gcatcgtcgt gtgcccatgc acgtcgacga gcgtatcttc 1080

atcatccttg ggcttggtac catctgtcgt ggtcggaaca ccacctgcaa gcggcagcgc 1140

agcctggaga ccatcgaggt ggccaccatg aacaatgtct ccttcaccca cccaaacacc 1200

actgcgctcc tcgagcgcta ctacgacggc actccagaag gcgtttacac ggaggacttc 1260

cccgttcggc caccacggcc atacaactac accaaccctg ctctcatccc tcctggccct 1320

ctcgaagagg tgctggagcc aacattcaag gcgaccaagc tgaaacggtt caagtataac 1380

acatcagtgg agatcatctt ccaaagcagc acgttgttga tgagtgactc caaccccatg 1440

cacctccatg gctatgacgt cttcctcctt gcgcaggggc ttggcagctt caacgccaag 1500

agggacatca ggaagttcaa ctaccacaac cctcagctca ggaacaccat attggttccc 1560

cgcggtggtt gggccgccgt ccgcttcatc acagacaatc cagggatgtg gtacttgcac 1620

tgtcactttg agttccacat cattatgggc atggcgacgg cgttcatcgt ggaggatggg 1680

ccaacaccgg agacgagcct gcctccaccg ccgccggagt tcaagagatg tgatgcctct 1740

tga 1801