阅读说明：本技术 黄瓜CsHMGB基因在降低农药残留量以及缓解农药毒性上的应用 (Application of cucumber CsHMGB gene in reducing pesticide residue and relieving pesticide toxicity ) 是由 辛明 秦智伟 李胜男 周秀艳 王蕾 于 2020-05-20 设计创作，主要内容包括：黄瓜CsHMGB基因在降低农药残留量以及缓解农药毒性上的应用,涉及CsHMGB基因在农业领域的应用。本发明从遗传学角度出发,在植物体内代谢农药,提高黄瓜安全品质,实现减少农药残留的同时避免了环境污染等问题。沉默CsHMGB的黄瓜株系霜霉威残留量增加而过量表达CsHMGB的黄瓜株系霜霉威残留量下降。霜霉威胁迫后黄瓜受到ROS的干扰,过量表达的CsHMGB可以提高抗氧化酶SOD、POD、CAT等的活性,且提高ASA-GSH循环能力。过量表达的CsHMGB诱导解毒类基因,谷胱甘肽家族和膜转运蛋白ABC家族的部分基因上调表达。CsHMGB可通过抗氧化酶系统缓解霜霉威的毒害。(An application of a cucumber CsHMGB gene in reducing pesticide residue and relieving pesticide toxicity relates to an application of the CsHMGB gene in the agricultural field. From the genetic aspect, the invention metabolizes pesticides in plants, improves the safety quality of cucumbers, reduces pesticide residues and avoids the problems of environmental pollution and the like. The amount of propamocarb in cucumber lines silent on CsHMGB was increased and that in cucumber lines overexpressing CsHMGB was decreased. After the cucumber is stressed by the propamocarb, the cucumber is interfered by ROS, and the over-expressed CsHMGB can improve the activities of antioxidant enzymes SOD, POD, CAT and the like and improve the circulating capacity of ASA-GSH. The over-expressed CsHMGB induces the up-regulation expression of partial genes of detoxification genes, glutathione family and membrane transporter ABC family. CsHMGB can alleviate the toxicity of propamocarb through an antioxidase system.)

黄瓜CsHMGB基因在降低农药残留量以及缓解农药毒性上的 应用

技术领域

本发明涉及CsHMGB基因在农业领域的应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus)是中国设施蔬菜生产中的主要栽培作物之一，种植面积广泛。由于温室大棚内特殊的气候条件和连年种植，黄瓜极易受到病虫害的侵袭，黄瓜霜霉病是一种毁灭性病害。

霜霉威是一种新型、高效、广谱的氨基甲酸酯类杀菌剂，可有效防止瓜类霜霉病，是防治黄瓜霜霉病的常用农药之一，但由于其存在一定的挥发性和内吸性，施用后极易在黄瓜果实内蓄积形成农药残留其余将沉降到土壤或扩散到大气中，一方面造成黄瓜农药残留，影响品质，引发食品安全问题；另一方面造成环境污染，危害人类健康。目前，降低果蔬中农药残留的有效途径为减少农药投入和加速农药在植物体内代谢，但是外源物质增加了生产成本，甚至造成二次污染。

发明内容

本发明从遗传学角度出发，在植物体内代谢农药，提高黄瓜安全品质，实现减少农药残留的同时避免了环境污染等问题。

黄瓜CsHMGB基因在降低农药残留量以及缓解农药毒性上的应用。

黄瓜CsHMGB基因全长624bp，编码207个氨基酸，与甜瓜和苦瓜在同一个进化分支上，同源性最高；沉默CsHMGB的黄瓜株系霜霉威残留量增加而过量表达CsHMGB的黄瓜株系霜霉威残留量下降。霜霉威胁迫后黄瓜受到ROS的干扰，过量表达的CsHMGB可以提高抗氧化酶SOD、POD、CAT等的活性，且提高ASA-GSH循环能力。过量表达的CsHMGB诱导解毒类基因，谷胱甘肽家族和膜转运蛋白ABC家族的部分基因上调表达。CsHMGB可通过抗氧化酶系统缓解霜霉威的毒害。

附图说明

图1为实施例1中D0351黄瓜品系受到霜霉威信号的诱导，CsHMGB在不同组织部位的表达量。

图2为实施例1中D9320黄瓜品系受到霜霉威信号的诱导，CsHMGB在不同组织部位的表达量。

图3为实施例1中D0351黄瓜品系受霜霉威胁迫与对照不同时间内CsHMGB的表达量对比图。

图4为实施例1中D9320黄瓜品系受霜霉威胁迫与对照不同时间内CsHMGB的表达量对比图。

图5为实施例1中转入载体的拟南芥原生质体激光共聚焦显微镜观察图。

图6为实施例1中转入载体的烟草叶片表皮细胞激光共聚焦显微镜观察图。

图7为实施例2中接种TRV2-PDS的黄瓜植株叶片出现白化现象的情况。

图8为实施例2中接种TRV2-HMGB的3组黄瓜株系与TRV2空载对照和野生型对照的CsHMGB表达量对比图。

图9为实施例2中接种TRV2-HMGB的3组黄瓜株系与TRV2空载对照和野生型对照的霜霉威残留量对比图。

图10为实施例2中喷施400pm霜霉威的T1代黄瓜果皮霜霉威残留量时间曲线图。

图11为实施例2中喷施1mM霜霉威的T1代黄瓜果皮霜霉威残留量时间曲线图。

图12为实施例2中霜霉威胁迫后黄瓜体内的O^2-含量对比图。

图13为实施例2中霜霉威胁迫后黄瓜体内的H₂O₂含量对比图。

图14为实施例2中霜霉威胁迫后黄瓜体内的MDA含量对比图。

图15为实施例2中霜霉威胁迫后黄瓜体内的抗氧化酶活性对比组图。

图16为实施例2中霜霉威胁迫后黄瓜体内的ASA-GSH循环对比组图。

图17为实施例2中霜霉威胁迫后黄瓜体内的解毒类基因的表达量对比组图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式黄瓜CsHMGB基因在降低农药残留量以及缓解农药毒性上的应用。

本实施方式中所述农药为霜霉威。

本实施方式设计特异性引物(CsHMGB-F:5′ATGGAAATTATGGAACACAACAG-3′，CsHMGB-R:5′-TCAAGAGATGAAATCTAGAGAGTCA-3′)进行PCR扩增。

PCR体系：上游引物(20μmol·L^-1)0.5μL，下游引物(20μmol·L^-1)0.5μL，10×PCRBuffer 2μL(含20mmol·L^-1Mg²⁺)，dNTPs(10mmol·L^-1)2μL，Taq酶(2U)0.2μL，加ddH₂O至20μL。

PCR程序：94℃3min；94℃1min、54℃1min、72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

使用在线NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库，通过BLAST比对分析并获得与CsHMGB同源的序列。利用MEGA7软件进行系统发生树分析，系统进化树的构建采用泊松模型(Poisson model)的邻位法(neighbor joining,NJ)和根据Bootstrap重抽样1000次进行置信度分析，使用DNAMAN(http://www.lynnon.com/)软件进行结构域序列多重比对分析。获得本实施方式所述黄瓜CsHMGB基因(其CDS序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。)

以果实cDNA为模板，PCR扩增序列全长，测序后CsHMGB的序列与黄瓜基因组数据库中的CsaV3_5G021890完全一致，全长624bp，表明成功克隆该基因。共编码207个氨基酸，序列分析显示363bp 5′未翻译区(UTR)、188bp 3′UTR、外显子和7个内含子。分析CsHMGB与甜瓜、辣椒、水稻、拟南芥等物种的HMG家族基因的亲缘关系，邻接建树法构建系统发生树。结果表明，CsHMGB与甜瓜(CmHMGB7)、辣椒(Cp HMGB7)、和苦瓜(Mn HMGB7)在同一进化分支上同源性较高，CsHMGB与苦瓜，甜瓜，辣椒等具有高度保守的同源序列，同源性在80％以上。

以下实施例中如无特别说明均为常规方法。

实施例1

本实施例中选用黄瓜低霜霉威残留品系‘D0351’(0.014mg/kg)和黄瓜高霜霉威残留品系‘D9320’(0.171mg/kg)作为供试材料(‘D0351’和‘D9320’由东北农业大学黄瓜课题组提供)。2017年秋，供试材料在东北农业大学园艺试验站进行培养，采用常规垄作架式栽培方法，统一管理。于第十节位瓜成熟(始收期，定植后34天)对植株喷施400倍的霜霉威盐酸盐溶液，以喷水作为对照，喷施到叶缘和果实滴液为度。并分别于3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h、72h、96h和120h取果实的上、中、下三个部分的果皮及2mm厚样品进行混合，液氮速冻，-80℃保存备用。

霜霉威残留测量方法：称取样品12.5g，向样品中加入25ml的乙腈，匀质2min，静置0.5h。将震摇后的乙腈提取到含有3g NaCl的离心管，涡旋1min，直接离心。取上清5ml，于60℃水浴，将乙腈蒸干，蒸干后用2.5ml丙酮溶解，过有机相滤膜(0.22，2个套用)后装小瓶(500～1000μl)备用。将上述装小瓶的各个溶液均稀释50倍后再装一批小瓶，待测。过完滤膜的溶液要澄清，无颗粒，可将过完滤膜的溶液静止数分钟后观察是否浑浊，若有颗粒需要再次过膜，直到澄清。用气质联用仪Agilent 7890B-5977A进行检测。

提取“D0351”和“D9320”黄瓜根、茎、叶、雌花、雄花等组织的总RNA，根据迪宁反转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT-Kit说明书将RNA反转录成cDNA。PCR反应体系为SYBRGreen PCR Master Mix 10μL，上游引物(10μmol·L^-1)0.5μL，下游引物(10μmol·L^-1)0.5μL，cDNA模板2μL，加ddH₂O至20μL。在BIO-RAD iQ5荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，反应条件为95℃3min；95℃10s、60℃30s、72℃30s，40个循环；72℃延伸步骤收集荧光信号，每个样品设置4个技术性重复，3个生物学重复。参照基因为CsEF1α^[，目的基因的相对表达量采用2^-ΔΔCT相对定量分析方法来计算。采用Turkey检验方法进行单因素方差分析，并是以0.05水平上为标准进行差异显著性分析；用三次重复的平均值和标准误差数据进行作图。

霜霉威胁迫下CsHMGB在D0351和D9320黄瓜品系的不同组织部位中均有表达，但表达模式有所不同。在D0351黄瓜品系中，受到霜霉威信号的诱导，CsHMGB在果皮、叶片、雌花中表达量明显升高，分别为对照的6.43倍、3.01倍、1.85倍；而根、茎、雄花和果肉也呈现上调表达的趋势，但是差异不显著；在雄花和根中表达量较低；不同组织部位的表达量为果皮>叶片>雌花>茎>果肉>根>雄花(如图1所示)。在D9320黄瓜品系中，CsHMGB的表达量在果实中最高，但是与对照的差异不明显，其次是叶片，在雄花和茎中的表大量较低，不同组织部位的表达量为果皮>叶片>雌花>根>茎>果肉>雄花(如图2所示)。采用RT-PCR分析霜霉威胁迫下黄瓜D0351和D9320果皮中CsHMGB基因不同时间达模式。在D0351黄瓜品系中，霜霉威胁迫后CsHMGB的表达量迅速升高，显著高于对照，3h时为对照的3.23倍，随后的48h时内CsHMGB的表达量也在增加，6h、12h、24h、48h分别为对照的1.42倍、2.06倍、4.43倍和2.36倍，之后的72～120h内CsHMGB的表达量明显下降，比48h下降约48.32％，且与对照的表达量差异不显著(如图3所示)。而在D9320中，CsHMGB基因表达模式明显不同，在3～12h内表达量变化并不大，与对照的差异也不明显，随后的24～120h内表达量逐渐下降(如图4所示)。说明CsHMGB在D0351中受霜霉威胁迫特异上调表达，而在D9320中不存在此特异性以上结果说明，CsHMGB主要在果皮和叶片中表达，在D0351品系中积极响应霜霉威信号。

瞬时35S:CsHMGB-GFP表达载体构建：在已经设计好的CsHMGB全长克隆引物两端加上酶切位点序列，上下游酶切位点分别为Xba I和Bgl II，下游引物去掉终止密码子。以CsHMGB克隆全长质粒为模板进行PCR扩增，连接到T载体上，将测序正确的全长编码序列(无终止密码子)质粒与pSuper-1300载体酶切后同时进行胶回收(参照试剂盒说明书)，再用T4-DNA连接酶25℃过夜连接将胶回收产物进行连接、转化大肠杆菌后进行摇菌。最后将PCR鉴定出的含有目的片段的阳性单克隆菌液进行测序，进而获得构建成功的瞬时35S:CsHMGB-GFP表达载体。空载体pSuper-1300作为阴性对照。

瞬时表达载体的表达：将瞬时表达载体35S:CsHMGB-GFP与空载体pSuper-1300转化到拟南芥原生质体和烟草叶片表皮细胞中(具体方法可参照YOO等的方法)，利用激光共聚焦显微镜(Leica，德国)观察融合蛋白表达情况，激发波长为488nm，发射波长为530nm。拟南芥原生质体定位结果显示，在转入35S：GFP空载体的整个细胞中可见明亮的绿色荧光，而在转入35S：CsHMGB-GFP融合表达载体绿色荧光只富集在细胞核中(如图5所示)。烟草叶片表皮细胞定位也显示35S：CsHMGB-GFP蛋白定位于细胞核(如图6所示)。

实施例2

使用克隆全长引物CsHMGBF、CsHMGBR，以CsHMGB开放阅读框质粒为模板，利用Taq酶进行PCR，获得3’末端带A的突出端。进一步通过T4连接酶(参照说明书)将CsHMGB与pCXSN-1250载体连接，构建过表达载体pCXSN-CsHMGB(+)。

采用冻融法将构建好的正义、反义表达载体和空载体分别转入到根癌农杆菌LBA4404中。采用Wang等优化的农杆菌介导的黄瓜遗传转化技术，侵染“感病黄瓜品系L18”黄瓜子叶节，经过共培养、不定芽的诱导分化、不定芽的伸长和生根和再生植株的驯化，获得抗性单株。选择浓度为1mg/L草丁膦进行抗性植株筛选，获得抗性单株。以pCXSN载体上的序列为引物，PCR及qPCR技术对转基因植株进行分子鉴定，鉴定的T₀单株收种。

生理生化指标检测方法：

取黄瓜叶片0.5g鲜样，加入1ml磷酸缓冲液(0.05mol/L、PH＝7.8)冰浴研磨，研磨后再加入1ml缓冲液，倒入离心管中，再用2ml缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡低温(0～4℃)离心20min(10500rpm)离心后冷藏保存。

POD：采用愈创木酚法。取上清液20μL加入比色杯中(对照加20μL磷酸缓冲液)加3ml反应液，立刻读取470nm下的OD值并计时，每隔1min读一次(0、1、2、3min的OD值)。公式：POD总活性(△OD470·min^-1·g^-1FW)＝(△OD470·V)/(a·W·t){V＝4ml、a＝0.02ml、W＝0.5g、t＝1min}；POD比活力(△OD470·min^-1·g^-1Pr)＝总活性/蛋白质浓度。反应液：0.1mol/L、PH＝6.0磷缓200ml，加入愈创木酚112μL，与磁力搅拌器上加热溶解，加入30％H₂O₂ 19μL存于冰箱中。

SOD：采用NBT法。取型号相同的试管，加50μL上清液(2支对照试管中各加磷缓50μL)，分别加3ml反应液，其中一支对照管置于暗处，其余各管于4000lx日光下反应20～30min(要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长)。反应结束后，以不照光的对照管做空白，于560nm下比色测定吸光度值。公式：以抑制NBT光还原50％所需酶量为酶活性单位(U)，SOD总活性(units·g^-1FW)＝((ACK-AE)·V)/(0.5ACK·W·Vt)[ACK为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V样品液总体积＝4ml、Vt为测定时样品用量＝0.05ml、W测定时样品重量＝0.5g、蛋白质含量单位为mg/gFW]。SOD比活力(units·mg^-1Pr)＝总活性/蛋白质含量。反应液：水：磷缓：Met：NBT：EDTA-Na₂：核黄素＝5:30:6:6:6:6。

MDA:取上清液1mL(对照加1ml水)，加2mL 0.67％TBA(硫代巴比妥酸——避光)，封口沸水浴15min，迅速冷却(用冷水冲泡)，倒入指形管中，4000rpm下离心20min，取上清液于600nm、532nm、450nm下比色。MDA含量(μmol/g FW)＝C×V/W＝0.1548(OD₅₃₂-OD₆₀₀)-0.01344OD₄₅₀(W＝0.5g；V＝4ml)0.67％TBA：0.67gTBA，加少量1mol/LNaOH溶液(100mL——3.99971gNaOH)，再加10％三氯乙酸定容至100mL。

GST：GST活性的测定参考汪季涛，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

植物烯去饱和酶(PDS)基因的沉默导致光漂白，是一种控制VIGS效率的方法，已在烟草、番茄和葫芦科作物上应用。本实施例中分别将TRV2、TRV2-PDS、和TRV2-HMGB与PTRV1混合后通过农杆菌浸润的方式注射到D0351品系黄瓜的子叶上，在人工气候培养箱中种植，两片真叶时，叶片和茎部注射霜霉病菌液，接种TRV2-PDS的黄瓜植株叶片陆续出现白化现象(如图7所示)，各组喷施霜霉威，进行400ppm和1mM霜霉威处理，于第十节位瓜成熟(始收期，定植后34天)对植株喷施400倍的霜霉威盐酸盐溶液，以喷水作为对照，喷施到叶缘和果实滴液为度。并分别于3h，6h，9h，12h，24h，36h，48h，72h，96h，120h取果实的上、中、下三个部分的果皮和2mm厚样品进行混合，液氮速冻，-80℃保存备用。以野生型植株喷施霜霉威和蒸馏水作为对照，处理后3h，6h，9h，12h，24h，36h，48h，72h，96h，120h时取样，用于霜霉威残留量检测分析；处理后0、2、4、6、8、10d取样，用于生理生化指标检测。当白化率达到90％时，RT-PCR方法检验接种TRV2-HMGB的CsHMGB基因表达量，接种TRV2-HMGB的3组黄瓜株系，CsHMGB表达量明显低于TRV2空载对照和野生型，表达量仅为对照的42.43、43.16和45.02％(如图8所示)，说明CsHMGB基因已被瞬时沉默。测定实验组和对照组的叶片中霜霉威残留量发现，野生型和TRV2的平均残留量分别为3.02mg/kg和2.85mg/kg，而CsHMGB基因沉默的株系残留量显著高于野生型，分别为野生型的1.67倍、1.75倍和1.72倍(残留量5.06mg/kg、5.34mg/kg、5.22mg/kg(如图9所示)。说明CsHMGB基因的瞬时沉默会导致霜霉威残留量增加。

构建植物过量表达载体pCXSN-CsHMGB(+)，采用农杆菌介导法转化D9320黄瓜品系，RT-PCR鉴定后最终获得15棵阳性转基因植株，自交授粉后收获T₁代黄瓜。检测确定稳定遗传的T₁单株，待其3叶一心期，将其定植于桶中，置于人工气候室中培养。环境条件控制为：光照16h和黑暗8h以及昼夜温为28/18℃的环境，平均湿度为75％。黄瓜遗传转化获得的转基因T₁代植株OX2、OX3、OX5播种育苗，并进行400ppm和1mm霜霉威处理，于第十节位瓜成熟(始收期，定植后34天)对植株喷施400倍的霜霉威盐酸盐溶液，以喷水作为对照，喷施到叶缘和果实滴液为度。并分别于3h，6h，9h，12h，24h，36h，48h，72h，96h，120h取果实的上、中、下三个部分的果皮和2mm厚样品进行混合，液氮速冻，-80℃保存备用。以野生型植株喷施霜霉威和蒸馏水作为对照，处理后3h，

6h，9h，12h，24h，36h，48h，72h，96h，120h时取样，用于霜霉威残留量检测分析；处理后0、2、4、6、8、10d取样，用于生理生化指标检测。

野生型黄瓜株系和过表达株系OX-HMGB2、OX-HMGB3、OX-HMGB5的霜霉威残留量呈现出先上升后下降的趋势，在3～48h内，霜霉威残留量逐渐升高，48h残留量达到最大值，3～48h残留量逐渐增加，48h时霜霉威残留量最大，野生型为4.526mg/kg，而过表达株OX-HMGB2、OX-HMGB3、OX-HMGB5系残留量为3.7mg/kg、3.64mg/kg、3.53mg/kg平均值比野生型低19.8％。48h后霜霉威的残留量开始下降，可能是农药的半衰期导致，

96h～120h时霜霉威残留量接近于平稳，此时过表达株系的霜霉威残留量平均值仍比野生型低20.95％(如图10所示)。喷施1mM霜霉威的黄瓜代黄瓜果皮中的霜霉威残留量变化趋势和400ppm相似(如图11所示)，实验结果说明过量表达的CsHMGB可以降低黄瓜果皮中的霜霉威残留量。

植物受到农药等有毒胁迫时，会导致ROS的过多积累，改变细胞内氧化还原平衡，引起氧化胁迫，导致生物大分子如蛋白质，脂质等的损伤，甚至细胞死亡，严重影响植物生长发育。霜霉威胁迫后，黄瓜体内的O^2-和H₂O₂含量均迅速增加，特别是在胁迫后的4d，含量达到最大，随后开始下降，而过量表达CsHMGB黄瓜株系中O^2-和H₂O₂均显著低于非转基因对照(如图12～13所示)，进一步测定黄瓜中的丙二醛(MDA)含量，发现过量表达CsHMGB黄瓜株系中MDA的含量显著低于野生型对照(如图14所示)。实验结果说明，霜霉威胁迫可以导致黄瓜体内ROS的积累，过量表达CsHMGB有助于清除ROS，抵御ROS胁迫。

为了维持ROS的正常水平，植物受到ROS的伤害时，会迅速的启动抗氧化系统，将体内形成过氧化物转换为毒害较低或无害的物质，以抵御外界的毒害。本实施例中测定SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性。黄瓜受到霜霉威胁迫后SOD、POD、CAT等过氧化酶都呈现出上升的趋势。SOD是清除植物体内自由基的首要物质，霜霉威胁迫后，黄瓜果实中的SOD酶活性显著增加，而过表达株系的SOD酶活性呈现出先上升后下降的趋势，但是仍显著高于对照，POD酶活性在霜霉威胁迫的2～10d出现持续上升的趋势，且过表达株系酶活性均高于野生型对照。APX是叶绿体中清除H₂O₂的关键酶，霜霉威胁迫后过量表达CsHMGB株系的APX活性与SOD酶活性呈现相似的变化趋势；CAT广泛的存在植物叶绿体，线粒体中为机体提供了抗氧化机理，霜霉威胁迫后，过量表达CsHMGB株系黄瓜果实中的CAT活性在2～4d时显著高于对照，随后CAT活性趋于稳定。GPX是谷胱甘肽系统中的重要催化酶，通过催化谷胱甘肽(GSH)还原氢过氧化物，霜霉威胁迫后2～6d，过量表达CsHMGB株系GPX活性显著高于对照，随后GPX活性降低。总之，霜霉威胁迫后过量表达CsHMGB株系抗氧化酶系统中的关键酶酶活性在初期均显著增强，说明霜霉威胁迫后CsHMGB可以激活抗氧化酶系统，从而抵御ROS的干扰。(如图15所示)

ASA-GSH循环是植物体内重要的抗氧化系统，也是植物体内清除ROS的重要途径。本实施例中测定ASA-GSH循环中的关键酶活性和含量。如图16所示可见，受到霜霉威胁迫后黄瓜ASA含量在2～6d时下降，低于野生型对照，而DHA的含量在上升，说明霜霉威胁迫促使ASA向DHA的转化，从而导致黄瓜抗氧化能力下降，而转基因黄瓜的ASA和DHA在2～10d均显著高于野生型对照，ASA整体变化差异不大，DHA先升高后下降，ASA和DHA的总量也在上升，加速了DHA向ASA的转化，抗氧化能力提高，说明过量表达CsHMGB株系增强了黄瓜抗氧化的能力。MDHAR和DHAR对于抗坏血酸的再生具有重要作用，本实施例中转基因植株的MDHAR和DHAR酶活性均显著高于非转基因野生型对照植株，说明抗坏血酸的循环途径在增强，植株的抗氧化能力增强。此外，霜霉胁迫后GSSG和GSH的总含量虽然也在增加，但是GSH/GSSG的值却在下降，说明黄瓜植株受到了ROS等的胁迫，而转基因过量表达植株在2～10d中的GSH和GSSG总量均高于野生型对照，且GSH/GSSG的值也在高于野生型对照，进一步说明谷胱甘肽系统的氧化还原状态在曾强，从而抵御霜霉威胁迫。同样的，2～10d中转基因过量表达植株GST和GR的酶活性也显著高于野生型对照。综上，过量表达CsHMGB黄瓜株系增强ASA-GSH循环，提高植株的抗氧化能力。

实施例3

本实施例利用qRT-PCR分析了CsHMGB转基因黄瓜植株和非转基因植株中的表达。谷胱甘肽家族中的CsGPX、CsGSH2、CsGST1在转基因黄瓜株系OX2、OX3、OX5中均出现上调表达，其中OX2株系CsGPX表达量增加最为显著，为非转基因对照的5.4倍(如图17所示)；CsGST1和CsGSH2的表达量分别为野生型的13.45倍和8.89倍；细胞色素CsP450基因也出现上调表达；转运蛋白CsABCA19和CsPDR同样上调表达，OX2株系中CsABCA19和CsPDR的表达量分别为野生型的5.86倍和15.6倍；实验结果说明过量表达的CsHMGB蛋白可以增加解毒类基因的表达。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 黄瓜CsHMGB基因在降低农药残留量以及缓解农药毒性上的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 624

<212> DNA

<213> 黄瓜(Cucumis sativus)

<400> 1

atggccggcg gaggatcctc caagtcccgg aagagagtgg aggctactcc tgctgacgtc 60

gccgctactg gtccttcgct tgtgagggcc aaagacggca gtgcttttgc tagatgtgac 120

gagtgcggta aaagtgttcc ggtggcctta atcagcatgc acagttgcag cctcgacgcc 180

aaaattagaa tgaatttaga gtctcagact gttgaaaagc aaacacaatc caaaaagcca 240

gctgaaaaga aaagatcagc atcatctgaa cctaagacta agaaatcccg aactgagaag 300

aaagggaaga aggacaaaga tccaaatgcc cccaaacgcc ctcctacagc tttctttatc 360

ttcatggatg acttcagaaa gtcatataaa gaagccaatc ctgattccaa gggcgttaag 420

gaggttgcaa aggagggtgg tgagaaatgg aagtcaatga ctgatgaaga gaagaagcct 480

taccaagata aagctgccga gctaaaagcg gaatatgaga aggcattgga aagtcgaaat 540

gctgagaatg aagatgatga aaaagagaca gaagagacgg aagagattga agaggaggtt 600

gaaggaataa cggaagaaga gtaa 624