阅读说明：本技术 一种利用杨木酶法制备高浓度单糖溶液的方法 (Method for preparing high-concentration monosaccharide solution by using poplar enzyme method ) 是由 张军华 文沛瑶 徐勇 贾丽丽 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用杨木酶法制备高浓度单糖溶液的方法,将杨木与乙酸-双氧水溶液混合,进行预处理反应；将所述预处理反应完毕的预处理液与杨木进行固液分离,将预处理后的杨木滤渣和碱液混合,进行碱预处理；将所述碱预处理后的处理液和杨木碱处理滤渣进行固液分离,将碱处理滤渣水洗至中性,得到预处理原料；将所述预处理的原料、柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶混合,进行酶解。该方法采用两步预处理脱除了杨木中大量的木质素和乙酰基,提高了杨木中葡聚糖的含量和酶水解效率,实现了利用杨木制备高浓度单糖溶液。该方法具有酶解液单糖浓度高、酶解效率高、试剂可回收、操作简单等特点,适于杨木生物转化制备生物能源和高值化学品。(The invention relates to a method for preparing a high-concentration monosaccharide solution by using a poplar enzyme method, which comprises the steps of mixing poplar with an acetic acid-dioxygen aqueous solution, and carrying out a pretreatment reaction; carrying out solid-liquid separation on the pretreated liquid after the pretreatment reaction and the poplar, mixing the pretreated poplar filter residue with alkali liquor, and carrying out alkali pretreatment; carrying out solid-liquid separation on the treating fluid after the alkali pretreatment and the poplar alkali treatment filter residue, and washing the alkali treatment filter residue to be neutral to obtain a pretreatment raw material; and mixing the pretreated raw materials, a sodium citrate buffer solution and cellulase for enzymolysis. The method adopts two-step pretreatment to remove a large amount of lignin and acetyl in poplar, improves the content of glucan in poplar and the enzymatic hydrolysis efficiency, and realizes the preparation of high-concentration monosaccharide solution by using poplar. The method has the characteristics of high monosaccharide concentration of the enzymolysis liquid, high enzymolysis efficiency, recoverable reagent, simple operation and the like, and is suitable for preparing biological energy and high-value chemicals by poplar biotransformation.)

一种利用杨木酶法制备高浓度单糖溶液的方法

技术领域

本发明属于林业生物质生物降解和转化技术领域，具体涉及杨木酶解制备高浓度单糖溶液的方法。

背景技术

在生物质生物转化过程中，采用高底物浓度酶解可得到高浓度的糖液，利用其发酵制备生物能源和化学品可降低后续发酵和纯化的成本，对生物质高值化利用有着重要意义。

杨木生长速度快，生长周期短，环境适应性强，种植面积十分广泛，是生产生物能源和生物质化学品的重要原料。

由于杨木抗降解屏障强，木质素含量高，其酶解过程中存在着酶解得率低、酶剂量大等问题，因此，酶解过程中采用高浓度的杨木制备高浓度的单糖酶解液十分困难。例如，Tian D等人在2017，Biotechnol Biofuels.10:157中采用两步法预处理杨木，然后每克干物质添加高达32mg纤维素酶解时，杨木的葡萄糖得率仅为70％。Zhang等人报道中(Bioresource Technology,2009,100(23)：5890-5897)，在使用了一种特殊的搅拌装置下，在预处理杨木的酶解底物浓度为20％时，经酶解后其纤维素转化率低于85％，其葡萄糖浓度最高为158mg/mL。Chandra等人(Bioresource Technology,2016,199：135-141)对10％底物浓度的预处理杨木进行了酶解，在纤维素酶的添加量为20mg蛋白/g底物下，杨木的酶解得率仅为80％，其中葡萄糖浓度低于61mg/mL，木糖浓度低于3mg/mL，单糖浓度低于64mg/mL。Hu等人(Bioresource Technology，2015,186:149–153)采用蒸汽爆破预处理杨木进行了20％的底物浓度酶解，其使用的复配纤维素酶添加量高达60mg蛋白/g底物，然而杨木的酶解液葡萄浓度低于142mg/mL(葡萄糖得率低于85％)，木糖浓度低于19mg/mL，总单糖得率低于164mg/mL。由此可见，传统的预处理方式所处理的杨木在酶水解过程中普遍存在着酶解得率不高、酶解液单糖浓度偏低等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用杨木制备高浓度单糖溶液的方法。本发明提供的乙酸-双氧水和氢氧化钠先后处理杨木可极大的提高杨木酶解得率和酶解液中的单糖浓度；所制备的杨木酶解液单糖浓达250mg/mL以上。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案；

本发明提供了一种利用杨木酶法制备高浓度单糖溶液的方法，包括以下步骤：

(1)将杨木与乙酸-双氧水溶液混合，进行预处理反应；

(2)将所述预处理反应完毕的预处理液与杨木进行固液分离，将预处理后的杨木滤渣和碱液混合，碱预处理；

(3)将所述碱预处理后的处理液和杨木碱处理滤渣进行固液分离，将碱处理滤渣水洗至中性，得到预处理原料；

(4)将所述预处理的原料、柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶混合，进行酶解。

优选的，步骤(4)所述预处理原料的重量与柠檬酸钠缓冲液体积比为150～250mg：1mL；所述柠檬酸钠缓冲液的pH为5.0～6.0。

优选的，步骤(4)所述纤维素酶的用量为每克预处理原料添加酶活20～40FPU的纤维素酶。

优选的，步骤(2)所述碱液的质量浓度为0.1～0.5％。

优选的，步骤(2)所述预处理滤渣质量和碱液的体积比为1g：8～10mL。

优选的，步骤(2)所述碱预处理的温度为60～80℃，时间为1～2h。

优选的，步骤(1)所述乙酸-双氧水溶液中乙酸双氧水的体积百分含量为60％。

优选的，步骤(1)所述杨木的质量和乙酸-双氧水溶液的体积比为1g：8～10mL。

本发明上述杨木酶解方法得到的高浓度单糖溶液，其特征在于，所述高浓度单糖溶液的浓度高于140g/mL

本发明利用乙酸-双氧水和碱能够提高杨木的可降解性能，除去其中的大量木质素和乙酰基，极大地提高了杨木的葡聚糖组分，在此基础上，纤维素酶能够进一步对其进行酶解，提高酶解溶液中单糖的浓度。实施例表明，本发明提供的杨木预处理和酶水解方式可使酶解液单糖浓达250mg/mL以上，能够极大地提高杨木酶解液中的单糖的浓度和杨木的酶解效率。

具体实施方式

本发明提供了一种利用杨木制备高浓度单糖溶液的方法，包括以下步骤：

(1)将杨木与乙酸-双氧水溶液混合，进行预处理反应；

(2)将所述预处理反应完毕的预处理液与杨木进行固液分离，将预处理后的杨木滤渣和碱液混合，碱预处理；

(3)将所述碱预处理后的处理液和杨木碱处理滤渣进行固液分离，将碱处理滤渣水洗至中性，得到预处理原料；

(4)将所述预处理的原料、柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶混合，进行酶解。

本发明将杨木与乙酸-双氧水溶液混合，进行预处理反应。在本发明中，所述杨木的质量和乙酸-双氧水溶液的体积比优选为1g：8～10mL；所述乙酸-双氧水溶液中乙酸双氧水的体积百分数优选为60％。乙酸-双氧水处理能除去其中的大量木质素，提高杨木的可降解性能，实现对杨木的预处理。本发明对乙酸-双氧水溶液的来源没有特殊限定，可以自行制备。当采用自行制备的方式时，所述乙酸-双氧水溶液的制备优选为：质量分数为99％的乙酸和质量分数为30％的双氧水等体积混合，用水稀释混合液，加入硫酸催化后制得的乙酸-双氧水溶液。硫酸能够催化乙酸和双氧水生成过氧乙酸，使得溶液变成更强的氧化性混合溶液。杨木的乙酸-双氧水预处理能够移除杨木中大量的木质素组分并极大的保留其多糖组成。

乙酸-双氧水预处理杨木后，本发明将所述预处理反应完毕的预处理液与杨木进行固液分离，将预处理后的杨木滤渣和碱液混合，碱预处理。在本发明中，所述预处理滤渣的质量和碱液的体积比优选为1g：8～10mL；所述碱液的质量浓度优选为0.1～0.5％，更优选为0.2～0.4％；本发明采用该浓度的碱液能够避免浓度过低酶解过程中不足以移除大量的乙酰基，还能避免过量碱液所造成的大量木质素和多糖组分移除不利于水解的情况，同时还能有效降低多糖组分的损失。碱液能除去其中的乙酰基，可提高杨木的酶解效率。本发明对碱液中溶质的种类没有特殊限定，优选包括氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙中的一种或多种；所述碱预处理后优选包括冷却至室温，所述碱预处理的温度优选为60～80℃，更优选为60～75℃，在本发明的实施例中，所述碱预处理的温度具体为60℃；时间优选为1～2h。所述碱预处理优选在密封的反应釜中进行，所述反应釜内衬的材质优选为聚四氟乙烯，内衬为聚四氟乙烯的反应釜不含金属等还原性材质，耐腐蚀，不易引起爆炸。适宜的碱预处理温度和时间使得碱处理过程中杨木的乙酰基在被移除的同时又保留了大量的多糖组成和少量必要的木质素组成，乙酸-双氧水预处理后的杨木碱预处理后能够极大的移除杨木中残留的乙酰基团，提高纤维素酶对杨木的可及性从而促进杨木的水解。

碱处理完毕后，本发明将所述碱预处理后的处理液和杨木碱处理滤渣进行固液分离，将碱处理滤渣水洗至中性，得到预处理原料。本发明将滤渣水洗至中性能够移除原料中残留的碱液减少其对后续水解的干扰。

得到预处理原料后，本发明将所述预处理的原料、柠檬酸钠缓冲液和纤维素酶混合，进行酶解。在本发明中，所述预处理原料的质量与柠檬酸钠缓冲液体积比为150～250mg：1mL，更优选为200～250mg：1mL；所述柠檬酸钠缓冲液的pH为5-6。所述纤维素酶的用量优选为每克滤渣添加20～40FPU的纤维素酶。在本发明中，所述酶解的温度优选为50℃；所述酶解的时间优选为168h。本发明对纤维素酶的来源没有特殊限定，采用本领域常规纤维素酶即可。原料洗至中性后添加纤维素酶，柠檬酸钠缓冲液能够缓冲水解过程在的有机酸释放，保证水解pH稳定在酶的最佳活性。

本发明所述高浓度单糖溶液的浓度优选高于140mg/mL，进一步优选为150～250mg/mL，易于后续的高浓度产品转化，大大减少了后期转化过程中的蒸馏和纯化成本。

下面结合实施例对本发明提供的一种利用杨木酶法制备高浓度单糖溶液的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)乙酸-双氧水处理

称取绝干重为10克的杨木，按照料液比1：10加入体积浓度60％的乙酸-双氧水溶液(乙酸-双氧水溶液为99％质量浓度的乙酸与30％质量浓度的双氧水按照体积比为1：1，用水稀释所配乙酸-双氧水溶液至原体积的60％(v/v)按照所稀释的乙酸双氧水溶液体系加入100mM的硫酸催化，制备得到的溶液)，在80℃温度下，加热预处理2h。预处理后，冷却，得到反应液。

(2)碱处理

利用离心机进行固液分离，取滤渣用水洗涤至中性，称取乙酸-双氧水溶液预处理后的绝干固体滤渣10g，按照料液比1g:10mL加入质量分数0.1％的氢氧化钠溶液，60℃的水浴锅中碱预处理1h。冷却，利用离心机进行固液分离，将碱处理滤渣洗涤至中性，得到预处理原料，用于纤维素酶解。

(3)纤维素酶解

称取15克预处理原料于锥形瓶中，加入20FPU/g DM(干物质)纤维素酶，然后加入pH等于5.0的柠檬酸钠缓冲液调节底物中杨木质量浓度达到150mg/mL，所述预处理原料的重量与柠檬酸钠缓冲液体积的比为150mg：1mL，摇匀置于恒温摇床中50℃下酶解168h后，在沸水浴中煮沸10min使酶失活，冷却至室温，得到单糖溶液。

单糖酶解率的检测方法：将单糖溶液离心，对上清液采用高效液相色谱检测单糖，根据下述公式计算预处理原料单糖酶解率：

葡萄糖得率(％)＝酶解所得葡萄糖含量×0.9/底物中纤维素含量×100

木糖得率(％)＝酶解所得木糖含量×0.88/底物中木聚糖含量×100

公式中底物中的纤维素和木聚糖含量依据美国国家可再生能源实验室方法测定；

计算得出酶解中葡萄糖得率为96.6％，木糖得率为98.6％，葡萄糖浓度为126.1mg/mL，木糖浓度为26.3mg/mL，单糖总浓度为152.4mg/mL。

实施例2

预处理方法和反应条件与实施例1相同，区别之处在于所述预处理原料的重量与柠檬酸钠缓冲液体积的比为250mg：1mL，最终酶解葡萄糖得率为96.1％，木糖得率为98.1％，葡萄糖浓度为209.2mg/mL木糖浓度为43.7mg/mL，单糖总浓度为252.9mg/mL。

实施例3

预处理方法和反应条件与实施例1相同，区别之处在于杨木与乙酸-双氧水预处理液的料液比为1g:8mL，最终酶解葡萄糖得率为91.7％，木糖得率为93.4％，葡萄糖浓度为120.4mg/mL木糖浓度为25.3mg/mL，单糖总浓度为145.7mg/mL。

实施例4

预处理方法和反应条件与实施例1相同，区别之处在于碱处理的料液比为1:8，最终酶解葡萄糖得率为91.7％，木糖得率为93.4％，葡萄糖浓度为120.0mg/mL木糖浓度为25.2mg/mL，单糖总浓度为147.2mg/mL。

实施例5

预处理方法和反应条件与实施例1相同，区别之处在于碱处理的温度为80℃，最终酶解葡萄糖得率为95.6％，木糖得率为95.0％，葡萄糖浓度为130.1mg/mL木糖浓度为25.3mg/mL，单糖总浓度为155.4mg/mL。

实施例6

预处理方法和反应条件与实施例1相同，区别之处在于碱处理的氢氧化钠溶液浓度为0.5％，最终酶解葡萄糖得率为96.6％，木糖得率为92.9％，葡萄糖浓度为132.6mg/mL木糖浓度为24.0mg/mL，单糖总浓度为156.6mg/mL。

对比例1

乙酸-双氧双氧水预处理方法和酶水解条件与实施例1相同，区别之处在于没有使用碱处理，最终酶水解葡萄糖得率为76.7％，木糖得率为80.0％，葡萄糖浓度为87.0mg/mL木糖浓度为28.0mg/mL，单糖总浓度为115.0mg/mL。

对比例2

酶水解条件与实施例1相同，区别之处在于没有使用乙酸-双氧水和碱处理，最终酶水解葡萄糖得率为11.8％，木糖得率为38.0％，葡萄糖浓度为9.0mg/mL木糖浓度为10.0mg/mL，单糖总浓度为19.0mg/mL。

由以上实施例可知，本发明提供了本发明提供的杨木酶解方法能够极大地提高杨木酶解液中的葡聚糖的含量和杨木的酶解效率；所得杨木酶解液单糖浓度可达250mg/mL。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。