阅读说明：本技术 一种抑霉唑半抗原ym-a、人工抗原、重链抗体及其制备方法和应用 (Imazalil hapten YM-A, artificial antigen, heavy chain antibody, and preparation method and application thereof ) 是由 沈玉栋 张咏仪 徐振林 王弘 杨金易 孙远明 肖治理 雷红涛 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑霉唑半抗原YM-A、人工抗原、重链抗体及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种抑霉唑半抗原YM-A,其结构式如式(I)所示：<Image he="345" wi="700" file="DDA0002471762610000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>该抑霉唑半抗原YM-A与待测物抑霉唑的骨架结构重叠度高,有效地提高了抑霉唑半抗原YM-A的免疫原性；进一步利用该抑霉唑半抗原YM-A与乳铁蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫羊驼,将免疫效果好的羊驼血清交替使用Protein A和Protein G亲和层析柱进行分离,成功制备得到了抑霉唑重链抗体；并利用该重链抗体建立了一种基于重链抗体检测抑霉唑分析方法,对抑霉唑的最低检测限为12.39ng/mL,IC<Sub>50</Sub>为122.18ng/mL,线性范围为29.41～507.63ng/mL；且该抑霉唑半抗原YM-A、人工抗原和重链抗体的制备方法简单易行、成本低,应用前景广泛。(The invention discloses an imazalil hapten YM-A, an artificial antigen, a heavy chain antibody, a preparation method and application thereof. The invention firstly provides an imazalil hapten YM-A, the structural formula of which is shown in the formula (I): the skeleton structure overlapping degree of the imazalil hapten YM-A and the imazalil to be detected is high, and the method is effectiveThe immunogenicity of the imazalil hapten YM-A is improved; further using an artificial antigen obtained by coupling the imazalil hapten YM-A and lactoferrin as an immunogen to immunize alpaca, and separating alpaca serum with good immune effect by alternately using Protein A and Protein G affinity chromatography columns to successfully prepare an imazalil heavy chain antibody; and an analysis method for detecting imazalil based on the heavy chain antibody is established by using the heavy chain antibody, the minimum detection limit of the imazalil is 12.39ng/mL, IC 50 122.18ng/mL, and the linear range is 29.41-507.63 ng/mL; and the preparation methods of the imazalil hapten YM-A, the artificial antigen and the heavy chain antibody are simple and easy, low in cost and wide in application prospect.)

一种抑霉唑半抗原YM-A、人工抗原、重链抗体及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于生物技术技术领域。更具体地，涉及一种抑霉唑半抗原YM-A、人工抗原、重链抗体及其制备方法和应用。

背景技术

抑霉唑又称烯菌灵，是一种内吸性杀菌剂，对果蔬中常见的青霉病、绿霉病等有很好的防治作用，被广泛应用于采收后的各种水果和蔬菜的防腐保鲜。研究发现，人体若长期摄入抑霉唑会引起内分泌系统功能紊乱，神经系统及肝脏也会受到影响。由于抑霉唑的滥用，我国对抑霉唑在食品中的残留量要求越来越严格，最新国标GB 2763—2019相对于国标GB 2763-2016新增8个品种检测。

抑霉唑的检测要求越来越苛刻，因此，需要一种快速、灵敏、高效的检测方法来实现抑霉唑的快速检测。目前，抑霉唑的农药残留检测方法包括气相色谱-质谱法、液相色谱质谱联用法、酶联免疫吸附检测法、以及其他定量检测方法；其中，气相色谱-质谱法、液相色谱质谱联用法等仪器分析方法其样本前处理及测定过程繁琐，费用高、需要专业人员操作，不适于大量样本筛查；而酶联免疫吸附检测法具有灵敏度高、特异性强、仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，是近年来常用的农残检测方法。酶联免疫吸附检测法基于抗原、抗体之间特异性识别，实现对检测样品中目标物的定性、定量分析，其关键在于制备出高特异性和高灵敏度的抗体，建立该方法的首要条件是设计合成有效的半抗原及完全抗原。

目前，周映霞等公开了一种抑霉唑半抗原HIA，成功制备得到了抑霉唑人工抗原，并通过免疫动物获得了效价为1:6400的鼠多抗，采用间接竞争ELISA法测定抗体的IC₅₀值为1.76μg/mL(杀菌剂抑霉唑人工抗原的合成和鉴定，2010)。虽然该抗体能够识别抑霉唑，但是其识别灵敏度低；并且该半抗原HIA的制备是利用抑霉唑类似物的羟基取代反应，经过取代，水解两步反应得到，制备过程复杂、步骤繁琐。因此，提供一种步骤简便、检测灵敏度高和特异性强的抑霉唑检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有抑霉唑检测方法的缺陷和不足，提供一种抑霉唑半抗原YM-A、人工抗原、重链抗体及其制备方法和应用。本发明制备出的抑霉唑半抗原YM-A的合成方法更加简单，直接利用抑霉唑分子结构式进行修饰改造，在分子结构式上的碳碳双键氧化成醛基之后，连入带有一段碳链的羧基，直接一步反应使其具有活性基团-羧基。

本发明的第一个目的是提供一种抑霉唑半抗原YM-A。

本发明的第二个目的是提供所述抑霉唑半抗原YM-A的制备方法。

本发明的第三个目的是提供所述抑霉唑半抗原YM-A在制备抑霉唑人工抗原中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种抑霉唑人工抗原。

本发明的第五个目的是提供一种检测抑霉唑的免疫原与包被原的组合。

本发明的第六个目的是提供所述抑霉唑半抗原YM-A、抑霉唑人工抗原或所述免疫原与包被原的组合在检测抑霉唑或制备抑霉唑检测试剂盒中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种抑霉唑重链抗体。

本发明的第八个目的是提供一种检测抑霉唑的方法。

本发明的第九个目的是提供一种抑霉唑检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种抑霉唑半抗原YM-A，其结构式如式(I)所示：

所述抑霉唑半抗原YM-A与抑霉唑分子骨架结构重叠度高，有利于进行免疫诱导，有效地提高了抑霉唑半抗原YM-A的免疫原性。

本发明还提供了所述抑霉唑半抗原YM-A的制备方法，其特征在于，利用高碘酸钠与高锰酸钾将抑霉唑的烯丙基双键氧化为醛丙基后，再与羧甲基羟胺半盐酸盐进行肟化缩合衍生反应，回流，萃取，取有机相干燥浓缩，浓缩物经硅胶柱层析纯化获得浅黄色固体，即为所述抑霉唑半抗原YM-A。

本发明采用高碘酸钠与高锰酸钾的共同作用下对抑霉唑进行氧化反应，将抑霉唑的烯丙基双键氧化为醛丙基。

优选地，所述氧化反应的温度为20℃～30℃。

更优选地，所述氧化反应的温度为20℃。

优选地，所述肟化缩合衍生反应的温度为58℃～62℃。

更优选地，所述肟化缩合衍生反应的温度为60℃。

优选地，所述萃取的萃取剂为乙酸乙酯和饱和NaCl。

所述抑霉唑半抗原YM-A在制备抑霉唑人工抗原中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种抑霉唑人工抗原，其结构式如式(II)所示：

其中，Protein为乳铁蛋白或卵清白蛋白。

所述抑霉唑半抗原YM-A与载体蛋白(Protein)偶联时，抑霉唑半抗原YM-A的特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，为得到特异性高、质量高的纳米抗体奠定了基础。

本发明还提供了一种检测抑霉唑的免疫原与包被原的组合，所述免疫原为所述抑霉唑半抗原YM-A与乳铁蛋白的偶联物，所述包被原为所述抑霉唑半抗原YM-A与卵清白蛋白的偶联物。

优选地，所述抑霉唑半抗原YM-A与乳铁蛋白偶联的摩尔比为1：58～62。

更优选地，所述抑霉唑半抗原YM-A与乳铁蛋白偶联的摩尔比为1：60。

优选地，所述抑霉唑半抗原YM-A与卵清白蛋白偶联的摩尔比为1：78～82。

更优选地，所述抑霉唑半抗原YM-A与卵清白蛋白偶联的摩尔比为1：80。

所述抑霉唑半抗原YM-A、抑霉唑人工抗原或所述免疫原与包被原的组合在检测抑霉唑或制备抑霉唑检测试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种抑霉唑重链抗体，其制备方法为：用所述抑霉唑半抗原YM-A与乳铁蛋白的偶联物对羊驼进行免疫后，将羊驼血清交替使用Protein A和Protein G亲和层析柱进行分离，洗脱，即得所述抑霉唑重链抗体。

本发明还提供了一种检测抑霉唑的方法，以所述抑霉唑半抗原YM-A与卵清白蛋白的偶联物作为包被原，以所述抑霉唑重链抗体作为检测抗体，采用间接竞争ELISA法进行检测。

本发明还提供了一种抑霉唑检测试剂盒，包含所述免疫原与包被原的组合。

本发明具有以下有益效果：

本发明首先提供了一种抑霉唑半抗原YM-A，该抑霉唑半抗原YM-A与待测物抑霉唑的骨架结构重叠度高，有效地提高了抑霉唑半抗原YM-A的免疫原性；进一步利用该抑霉唑半抗原YM-A与乳铁蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫羊驼，通过血清分离得到能够特异性识别抑霉唑的驼源重链抗体；

本发明提供的抑霉唑半抗原YM-A、人工抗原以及重链抗体的制备方法简单易行，制备得到的抑霉唑半抗原YM-A、抑霉唑完全抗原可有效地刺激被免疫动物产生灵敏度高、特异性强的重链抗体，利用其所建立的检测抑霉唑的方法的最低检测限为12.39ng/mL，IC₅₀为122.18ng/mL，线性范围为29.41～507.63ng/mL，具有简便快速、特异性强、灵敏度高的特点，在抑霉唑的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

附图说明

图1是抑霉唑半抗原YM-A、乳铁蛋白LF和抑霉唑人工抗原的紫外全波长扫描结果图。

图2是抑霉唑半抗原YM-A、卵清白蛋白OVA和抑霉唑人工抗原的紫外全波长扫描结果图。

图3是SDS-PAGE对羊驼血清中的三个亚型的鉴定结果图。

图4是基于重链抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1抑霉唑半抗原YM-A的制备

一种抑霉唑半抗原YM-A的制备方法，包括以下步骤：

将1mol抑霉唑溶解于50mL的二氧六环溶液中，加入0.5mol KMnO₄和NaIO4在20℃磁力搅拌进行氧化反应，回流4h后，将反应物分层，有机层通过减压蒸馏除溶剂后，浓缩物经硅胶柱层析纯化得到反应产物A；将100mg的反应产物A加入75mg羧甲基羟胺半盐酸盐在60℃油浴磁力搅拌下进行肟化缩合衍生反应，回流过夜(24h)后，将反应产物用乙酸乙酯和饱和NaCl萃取，液-液分层，滤液通过减压蒸馏除溶剂后，取有机相干燥浓缩，浓缩物经硅胶柱层析纯化获得浅黄色固体，即得抑霉唑半抗原YM-A，其结构式如式(I)所示：

实施例2抑霉唑人工抗原的制备

1、实验方法

一种抑霉唑人工抗原的制备方法，包括以下步骤：

将实施例1制备得到的抑霉唑半抗原YM-A，通过活泼酯法偶联卵清白蛋白OVA(albumin)和乳铁蛋白LF(lactoferrin)，将抑霉唑半抗原YM-A溶于DMF中，添加1.5eq NHS和EDC于溶液中在4℃反应过夜，记为A液；将A液逐滴加入到载体蛋白的PBS缓冲溶液中，于4℃下继续反应8h；将反应液于4℃下透析3天，每天换两次透析液，共透析6次，收集透析袋中的溶液(免疫原溶液)，即得抑霉唑人工抗原(抑霉唑完全抗原YM-A-LF和抑霉唑完全抗原YM-A-OVA)，并利用紫外分光光度计对实施例1制备得到的抑霉唑半抗原YM-A、载体蛋白(乳铁蛋白LF、卵清白蛋白OVA)和抑霉唑人工抗原进行紫外全波长扫描，验证该抑霉唑人工抗原的合成是否成功。

2、实验结果

抑霉唑半抗原YM-A、乳铁蛋白LF和抑霉唑人工抗原的紫外全波长扫描结果如图1所示，抑霉唑半抗原YM-A、卵清白蛋白OVA和抑霉唑人工抗原的紫外全波长扫描结果如图2所示，可以看出，乳铁蛋白LF和卵清白蛋白OVA分别在210nm左右出现了显著的吸收峰，抑霉唑半抗原YM-A在270nm左右出现了一定的吸收峰，而抑霉唑人工抗原同时具有抑霉唑半抗原YM-A和载体蛋白的吸收特征和在最大吸收峰均有偏移；说明本发明成功合成了抑霉唑人工抗原，其抑霉唑人工抗原的结构式如式(II)所示：

其中，Protein为乳铁蛋白或卵清白蛋白。

实施例3抑霉唑人工抗原的鉴定

1、实验方法

用健康的羊驼作为实验动物，以实施例2制备得到的抑霉唑完全抗原YM-A-LF作为免疫原，在羊驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mL(其中含有0.5mg免疫原)。首次免疫用0.5mL完全弗氏佐剂与抗原乳化后用于免疫，4周后用0.5mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后加强免疫，之后每间隔2周加强免疫一次。免疫前取10mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的血液10mL进行血清效价以及竞争反应检测，判断抑霉唑完全抗原YM-A-LF是否具有免疫原性。

以实施例2制备得到的抑霉唑完全抗原YM-A-OVA作为包被原，取上述采集的的羊驼血清为检测抗体，采用间接竞争ELISA法测定羊驼血清的抗血清效价与抑制率。具体步骤如下：

1)包板

将抑霉唑完全抗原YM-A-OVA用0.05M碳酸盐buffer(pH9.6)稀释至1μg/mL，按100μL/well，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤2次，每孔加入120μL 5％脱脂牛奶，37℃封闭3h；弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用，得到包好的酶标板。

2)血清效价与抑制检测

将步骤1)包好的酶标板，每孔分别加入50μL稀释好的1000ng/mL药物(抑霉唑)、50μL PBS、50μL按梯度倍数稀释(1K、3K、9K、27K、81K、243K、729K)的血清，做2组平行。37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗Alpaca(GoatAnti-Alpaca IgG H&L)二抗(用PBS按1:5000稀释)，37℃孵育30min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸光值。

2、实验结果

免疫羊驼所获得的抗血清的抑制检测结果如表1所示，可以看出，在450nm处的吸光值随着血清稀释倍数的增加呈现逐渐下降的规律，将吸光值为1定为羊驼血清效价，效价为243K。免疫羊驼所获得的抗血清对抑霉唑有抑制作用，随着免疫的加强，其抑制效果更为明显，但是在第四次免疫后，其免疫效果有所下降。

表1免疫羊驼所获得抗血清的抑制检测结果

以上结果说明：本发明制备得到的抑霉唑人工抗原具有良好的免疫原性，得到的羊驼血清能够用于后续抑霉唑重链抗体的制备，以及抑霉唑免疫检测方法的建立。

实施例4抑霉唑重链抗体的制备

1、实验方法

根据以上实施例3的实验结果可知，第四次免疫羊驼所获得的抗血清的免疫效果最佳，因此将第四次免疫羊驼所获得的抗血清用于抑霉唑重链抗体的制备。将第四次免疫羊驼所获得的抗血清交替使用Protein A和Protein G亲和层析柱，对其进行盲纯。具体步骤如下：

1)配制溶液

平衡缓冲液：20mM PB(配方：4.13g/LNaH₂PO₄·2H₂O+21.85g/LNa₂HPO₄·12H₂O+5.58g/L KCl，pH 7.0)-用于平衡纯化柱，洗涤杂蛋白；

洗脱液IgG1：0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)-用于洗脱Protein G中的IgG1；

洗脱液IgG2：0.15M NaCl-醋酸盐溶液(pH 4.5)-用于洗脱Protein A中的IgG2；

洗脱液IgG3：0.15M NaCl-醋酸盐溶液(pH 3.5)-用于洗脱Protein G中的IgG3；

中和液：1mol/L Tris-用于中和洗脱液。

2)稀释血清，平衡填料

Protein G亲和层析柱和Protein A亲和层析柱先用平衡缓冲液平衡，将稀释好的羊驼血清先后上样至Protein G亲和层析柱和Protein A亲和层析柱，10mL平衡缓冲液冲洗Protein G，A填料柱；

Protein G先用8mL 0.15M NaCl-醋酸盐溶液(pH 3.5)洗脱蛋白，用1.5mL离心管收集，每管200uL，边收集边用1mol/L Tris进行中和(可用pH试纸测收集液pH)，得到的蛋白为IgG3；

同时Protein A用8mL 0.15M NaCl-醋酸盐溶液(pH 4.5)洗脱蛋白，用1.5mL离心管收集，每管200uL，边收集边用1mol/L Tris进行中和(可用pH试纸测收集液pH)，得到的蛋白为IgG2；

之后用8mL0.1 M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)冲洗Protein G，A填料柱，使残留的蛋白充分洗脱，边收集边用1mol/L Tris进行中和，Protein G得到的蛋白为IgG1。

用nanodrop测定洗脱液蛋白浓度，用SDS-PAGE鉴定羊驼血清中的三个亚型，通过SDS-PAGE鉴定得到的蛋白是否正确及纯度是否符合要求，选择浓度较高、蛋白较纯的IgG2和IgG3的洗脱液进行ELISA鉴定。

3)填料的再生

用完的Protein A和Protein G分别用5倍柱体积的0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.7)、平衡缓冲液、一级水、20％乙醇洗涤，并在20％乙醇、4℃环境下保存。

2、实验结果

SDS-PAGE对羊驼血清中的三个亚型的鉴定结果如图3所示，可以看出，血清的条带较杂，IgG1有2个条带，分别在50kD和25kD附近；IgG2只有一个条带，在46kD附近；IgG3只有一个条带，在43kD附近；该鉴定结果符合IgG三个亚型的分子量大小和结构。

以上结果说明：本发明制备得到了3种不同分子量的IgG抗体，分别为43KD(重链)的IgG3，50KD(重链)和25KD(轻链)的IgG1以及46KD(重链)的IgG2，成功制备出抑霉唑重链抗体IgG3和IgG2。

实施例5抑霉唑重链抗体的间接竞争ELISA法鉴定

1、实验方法

以实施例2制备得到的抑霉唑完全抗原YM-A-OVA作为包被原，取实施例4制备得到的两个亚型的抑霉唑重链抗体作为检测抗体，采用间接竞争ELISA法测定羊驼血清的抗血清效价与抑制率。具体步骤如下：

1)包板

将抑霉唑完全抗原YM-A-OVA用0.05M碳酸盐buffer(pH9.6)稀释至1μg/mL，按100μL/well，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤2次，每孔加入120μL 5％脱脂牛奶，37℃封闭3h；弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用，得到包好的酶标板。

2)血清效价与抑制检测

将步骤1)包好的酶标板，每孔分别加入50μL稀释好的1000ng/mL药物(抑霉唑)、50μLPBS、50μL按梯度倍数稀释(100、200、400、800、1600、3200、6400)的重链抗体(IgG2和IgG3)，做两组平行。37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗Alpaca(Goat Anti-Alpaca IgG H&L)二抗(用PBS按1:5000稀释)，37℃孵育30min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸光值。

2、实验结果

重链抗体血清效价与抑制检测结果如表2所示，由表2可知，本发明制备得到的抑霉唑重链抗体(IgG2和IgG3)均对抑霉唑有抑制作用，IgG2有40.35％抑制作用，IgG3有65.32％的抑制作用；说明本发明成功制备得到了能够特异性结合抑霉唑的重链抗体，为后续抑霉唑纳米抗体的制备提供了有力的基础验证。

表2重链抗体血清效价与抑制检测结果

实施例6基于重链抗体的间接竞争ELISA标准曲线的建立

由以上实施例5的结果可知，IgG3比IgG2有更好的抑制作用；因此，将IgG3用于建立基于重链抗体间接竞争ELISA标准曲线。具体步骤如下：

1)包板

将抑霉唑完全抗原YM-A-OVA用0.05M碳酸盐buffer(pH9.6)稀释至100ng/mL，按100μL/well，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤2次，每孔加入120μL 5％脱脂牛奶，37℃封闭3h；弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用，得到包好的酶标板。

2)血清效价与抑制检测

将步骤1)包好的酶标板，每孔加入50μL抗抑霉唑的重链抗体(IgG3)和一系列不同浓度的50μL的抑霉唑标准品。37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗Alpaca(Goat Anti-Alpaca IgG H&L)二抗(用PBS按1:5000稀释)，37℃孵育30min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸光值。以抑霉唑标准品浓度对横坐标，B/B₀(加入抑霉唑的孔的OD450/未加入抑霉唑的孔的OD450)为纵坐标，建立间接竞争ELISA标准曲线。

(2)实验结果

基于重链抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图4所示，可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，最低检测限为12.39ng/mL，半抑制浓度为122.18ng/mL，线性范围为29.41～507.63ng/mL。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。