阅读说明：本技术 一种花椰菜单核苷酸突变的方法 (Method for single nucleotide mutation of cauliflower ) 是由 王桂香 宗梅 刘凡 田守卫 刘迪 武娅歌 韩硕 郭宁 段蒙蒙 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种花椰菜单核苷酸突变的方法。本发明公开的花椰菜单核苷酸突变的方法包括：以下胚轴为外植体,利用BE3系统对花椰菜进行基因编辑,得到发生单核苷酸突变的花椰菜,花椰菜为花椰菜Korso,该方法采用PHSE901-Basta进行,PHSE901-Basta的序列为序列表中序列3,侵染外植体的菌液浓度满足OD<Sub>600</Sub>值为0.1。利用本发明的方法对花椰菜Korso的ALS基因和CENH3基因进行单核苷酸突变,ALS基因和CENH3基因的编辑效率分别为24.7％和80.0％。本发明在花椰菜乃至芸薹属蔬菜的种质改良、基于突变体库进行的基因分离和基因功能验证等方面都提供了一个有效的技术手段。(The invention discloses a method for single nucleotide mutation of cauliflower. The method for single nucleotide mutation of cauliflower disclosed by the invention comprises the following steps: using the hypocotyl as an explant, and utilizing a BE3 system to perform gene editing on cauliflower to obtain the cauliflower with single nucleotide mutation, wherein the cauliflower is cauliflower Korso, the method adopts PHSE901-Basta, the sequence of PHSE901-Basta is a sequence 3 in a sequence table, and the concentration of a bacterial liquid infecting the explant meets OD 600 The value was 0.1. By using the method of the inventionThe ALS gene and the CENH3 gene of cauliflower Korso are subjected to single nucleotide mutation, and the editing efficiency of the ALS gene and the CENH3 gene is 24.7 percent and 80.0 percent respectively. The invention provides an effective technical means in the aspects of germplasm improvement of cauliflower or brassica vegetables, gene separation based on a mutant library, gene function verification and the like.)

一种花椰菜单核苷酸突变的方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域中，一种花椰菜单核苷酸突变的方法。

背景技术

花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)是一种广泛种植的十字花科芸薹属蔬菜。其具有较强的自交不亲和性，且需要长期春化低温诱导开花。这些特性显著增加了利用物理或化学诱变剂诱导突变和创造新种质的难度。芸薹属蔬菜作物是重要的蔬菜类群，伴随着白菜及甘蓝全基因组测序的完成和功能基因组的研究，如何利用功能基因编辑突变，定向遗传改良现有种质成为遗传育种领域最重要的课题之一。

基因编辑(genome editing)技术可以对植物基因组进行高效、精准、特异的修饰。特别是CRISPR/Cas9，为创造靶向点突变和种质创新提供了革命性的解决方案。

ALS基因，即乙酰乳酸合成酶基因，其不同位点发生单核苷酸的突变导致编码氨基酸的改变，可能使植株产生对除草剂的抗性，CENH3(着丝粒特异的组蛋白H3变体)基因的一些关键位点突变，会影响其蛋白的着丝粒定位功能，并可能诱导与其杂交的材料成为单倍体。这两个基因的单核苷酸突变都可能产生可利用的优良表型，具有极高的育种应用价值。

发明内容

本发明针对目前花椰菜转基因和基因编辑技术的缺乏，提供一种高效、稳定、简易的基因编辑创制定点突变的技术方法。

本发明提供的一种花椰菜基因单核苷酸突变的方法，包括：以下胚轴为外植体，利用BE3系统对花椰菜进行基因编辑，得到发生单核苷酸突变的花椰菜。

上述方法中，所述花椰菜可为花椰菜Korso。

上述方法中，所述基因编辑可采用PHSE901-Basta进行，PHSE901-Basta的序列为序列表中序列3。

上述方法中，侵染所述外植体的菌液浓度可满足OD₆₀₀值为0.1。

上述方法采用Basta进行筛选。

上述方法所用共培养培养基可为向MS培养基中添加6-BA和NAA得到的培养基，6-BA和NAA在所述共培养培养基中的浓度分别为3mg/L和0.1mg/L。

上述方法所用筛选培养基可为向所述共培养培养基中添加Basta和羧苄青霉素得到的培养基，Basta和羧苄青霉素在所述筛选培养基中的浓度分别为3mg/L和300mg/L。

上述方法所用芽伸长培养基可为向MS培养基中添加Basta和羧苄青霉素得到的培养基，Basta和羧苄青霉素在所述芽伸长培养基中的浓度分别为3mg/L和200mg/L。

上述方法中，所述基因可为ALS基因或CENH3基因。

上述方法中，所述基因为ALS基因，所述靶序列可为序列表中序列1；

所述基因为CENH3基因，所述靶序列可为序列表中序列2。

具体的，所述花椰菜基因单核苷酸突变的方法为花椰菜Korso中ALS基因单核苷酸突变的方法或花椰菜Korso中CENH3基因单核苷酸突变的方法。

所述花椰菜Korso中ALS基因单核苷酸突变的方法可包括：将OD₆₀₀值为0.1的EHA105/PHSE901-Basta-ALS菌液侵染花椰菜Korso下胚轴，得到侵染后的外植体；将所述侵染后的外植体于所述共培养培养基中进行共培养，得到共培养后的外植体；将所述共培养后的外植体于所述筛选培养基中进行筛选，得到抗性芽；将所述抗性芽于所述芽伸长培养基中进行培养，得到抗性苗，对所述抗性苗的ALS基因进行检测，得到ALS基因发生单核苷酸突变的花椰菜；

所述EHA105/PHSE901-Basta-ALS为将PHSE901-Basta-ALS导入农杆菌EHA105中得到的重组菌，所述PHSE901-Basta-ALS为利用BsaI在所述PHSE901-Basta中插入序列表中序列1所示的双链DNA得到的重组载体。

所述ALS基因发生单核苷酸突变可为C₆C₇C₈-T₆T₇T₈、C₆C₇C₈-T₆T₇C₈、C₆C₇C₈-C₆T₇T₈、C₆C₇C₈-T₆C₇T₈、C₆C₇C₈-C₆T₇C₈或C₆C₇C₈-T₆C₇C₈；

所述C₆C₇C₈-T₆T₇T₈为将ALS基因中序列1的第5-7位的胞嘧啶脱氧核苷酸均突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸；所述C₆C₇C₈-T₆T₇C₈为将ALS基因中序列1的第5、6位的胞嘧啶脱氧核苷酸均突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸；所述C₆C₇C₈-C₆T₇T₈为将ALS基因中序列1的第6、7位的胞嘧啶脱氧核苷酸均突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸；所述C₆C₇C₈-T₆C₇T₈为将ALS基因中序列1的第5、7位的胞嘧啶脱氧核苷酸均突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸；所述C₆C₇C₈-C₆T₇C₈为将ALS基因中序列1的第6位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸；所述C₆C₇C₈-T₆C₇C₈为将ALS基因中序列1的第5位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

所述花椰菜Korso中CENH3基因单核苷酸突变的方法可包括：将OD₆₀₀值为0.1的EHA105/PHSE901-Basta-CENH3菌液侵染花椰菜Korso下胚轴，得到侵染后的外植体；将所述侵染后的外植体于所述共培养培养基中进行共培养，得到共培养后的外植体；将所述共培养后的外植体于所述筛选培养基中进行筛选，得到抗性芽；将所述抗性芽于所述芽伸长培养基中进行培养，得到抗性苗，对所述抗性苗的ALS基因进行检测，得到ALS基因发生单核苷酸突变的花椰菜；

所述EHA105/PHSE901-Basta-CENH3为将PHSE901-Basta-CENH3导入农杆菌EHA105中得到的重组菌，所述PHSE901-Basta-CENH3为利用BsaI在所述PHSE901-Basta中插入序列表中序列2所示的双链DNA得到的重组载体。

所述CENH3基因发生单核苷酸突变可为将CENH3基因中序列2的第4位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

所述花椰菜基因单核苷酸突变的方法在花椰菜育种中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了用于花椰菜单剪辑编辑的成套试剂，由所述PHSE901-Basta、所述共培养培养基、所述筛选培养基和所述芽伸长培养基组成。

本发明中，所述花椰菜均可为花椰菜Korso。

本发明通过以花椰菜下胚轴为外植体，以农杆菌介导的方法进行转化，成功得到了ALS基因和CENH3基因发生单核苷酸突变的花椰菜，ALS基因和CENH3基因的编辑效率分别为24.7％和80.0％。本发明在花椰菜乃至芸薹属蔬菜的种质改良、基于突变体库进行的基因分离和基因功能验证等方面都提供了一个有效的技术手段。

附图说明

图1为TDZ培养基培养2周后，外植体芽再生情况。

图2为TDZ培养基培养的外植体。

图3为6-BA培养基培养2周后，外植体芽再生情况。

图4为不同浓度菌体重悬液侵染下胚轴的GUS染色情况。

图5为花椰菜下胚轴为外植体的转化抗性苗的获得。A、B为下胚轴外植体农杆菌侵染后的Basta筛选培养；C为Basta试纸条检测为阳性的转化株(即抗性再生植株)。

图6为T0代植株的PCR检测。第一排与第二排为gRNA-IDF与gRNA-IDR的PCR产物，第三排为nCas9-IDF与nCas9-IDR的PCR产物。M：最左侧为标准DNA分子量(Trans 2K plus DNAMarker)；+：为阳性对照(工程菌)，CK：为阴性对照(未转化的花椰菜DNA)；ntc：没有模板的对照；其他泳道为抗性再生植株的检测结果，与阳性对照条带相同的为阳性苗。

图7为花椰菜单碱基编辑鉴定。a：Korso(Ko)和拟南芥(At)ALS基因靶点序列比较，UGG为PAM区，红色字体的三个核苷酸是目标改变位点，即ALS的第182位脯氨酸(P)编码位点，方框内4-9位里的胞嘧啶脱氧核苷酸可被突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。b：Korso(Ko)和拟南芥(At)CENH3基因靶点序列比较。c：为重组载体中基因编辑相关结构。d和e：分别是两个基因编辑株的PCR测序，显示在目标位点发生了C-T的突变。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的花椰菜Korso(Wang et al.,Production and characterizationof interspecific somatic hybrids between Brassica oleracea var.botrytis andB.nigra and their progenies for the selection of advanced pre-breedingmaterials,Plant Cell Rep(2011)30:1811–1821)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的WX100、R8和XLH65均记载在文献(Zhu et al.,The GeneticDiversity and Relationships of Cauliflower(Brassica Oleracea Var.Botrytis)Inbred Lines Assessed by Using SSR Markers,PLoS One，December 6,2018；13(12):e0208551.doi:10.1371/journal.pone.0208551)中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的花椰菜尚美为厦门中厦蔬菜种籽有限公司产品。

下述实施例中的花椰菜台松为浙江神良种业有限公司产品。

下述实施例中的花椰菜盛松为天津市耕耘种业股份有限公司产品。

实施例1、花椰菜的基因编辑条件与材料的优化

一、基因编辑材料的选择

对7份花椰菜(Korso、WX100、R8、XLH65、尚美、台松、盛松)的下胚轴及带柄子叶为外植体进行芽再生能力比较。步骤如下：

1、选取健康饱满的种子，无菌水清洗1次，70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30S，无菌水冲洗2次；3％次氯酸钠消毒15min(加2-3滴吐温-20，避光，盖好封口膜并不断震荡)；无菌水冲洗约4次(无明显泡沫)，放于灭菌后的滤纸上吹干。

2、将消毒后的种子转入发芽培养基(即MS培养基)，遮光培养(弱光)3-4d，下胚轴长出约3cm，子叶未展开时切除两端的生长点，切成3-5mm小段平放在分化培养基(向MS培养基中添加6-BA和NAA得到的培养基，6-BA和NAA的浓度分别为3mg/L和0.1mg/L)上培养。带柄子叶为外植体时，用锋利的刀片切除子叶生长点并最大程度的保留子叶柄，将带柄子叶插入分化培养基中。

3、2000Lx 12h/d，25～28℃培养，每2周继代1次。4周后统计不定芽发生数，计算芽再生率，芽再生率＝芽发生数/外植体数×100％，选择高效芽再生材料。

结果如表1和2，可看出Korso的外植体再生能力明显优于其他材料，无论是带柄子叶还是下胚轴为外植体，芽再生率均超过85％。是后续基因编辑研究的首选材料。

表1不同基因型带柄子叶外植体芽再生

表2不同基因型的下胚轴外植体芽再生

二、培养基的选择

以Korso下胚轴为外植体，比较不同分化培养基对再生芽的影响，所用分化培养基为TDZ培养基和BA培养基。

TDZ培养基：为向MS培养基中添加TDZ和NAA得到的培养基，TDZ和NAA在该培养基中的浓度分别为0.2mg/L和0.1mg/L。

BA培养基：为向MS培养基中添加6-BA和NAA得到的培养基，6-BA和NAA在该培养基中的浓度分别为3mg/L和0.1mg/L。

1、选取健康饱满的种子，无菌水清洗1次，70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30S，无菌水冲洗2次；3％次氯酸钠消毒15min(加2-3滴吐温-20，避光，盖好封口膜并不断震荡)；无菌水冲洗约4次(无明显泡沫)，放于灭菌后的滤纸上吹干。

2、将消毒后的种子转入发芽培养基(即MS培养基)，遮光培养(弱光)3-4d，下胚轴长出约3cm，子叶未展开时用锋利的刀片切除下胚轴两端的生长点，切3-5mm小段平放在分化培养基上培养。

3、2000Lx 12h/d，25～28℃培养，每2周继代1次。4周后统计芽发生数，计算不定芽再生率，芽再生率＝芽发生数/外植体数×100％，选择合适的激素配比。

统计芽发生数并计算再生效率，结果显示，无论从单个外植体的最大芽发生数，还是具有不定芽形成的外植体频率上来看，TDZ培养基都不如BA培养基，而且前者易再生出大量白色愈伤组织，不定芽玻璃化较重，畸形芽较多(表3，图1-3)。

表3不同激素配比对不定芽再生的影响

表1中，其中，再生效率＝芽发生外植体数/外植体数×100％。

三、菌液侵染浓度的选择

下述步骤中如无特殊说明，培养均在28℃，12h光照/12h黑暗的条件下进行。

1、将pBI121载体导入农杆菌EHA105中，得到重组菌EHA105/pBI121。

2、选取健康饱满的Korso种子，无菌水清洗1次，70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30S，无菌水冲洗2次；3％次氯酸钠消毒15min(加2-3滴吐温-20，避光，盖好封口膜并不断震荡)；无菌水冲洗约4次(无明显泡沫)，放于灭菌后的滤纸上吹干，得到消毒后的种子。

3、步骤1结束后，将消毒后的种子转入发芽培养基(即MS培养基)，遮光培养(弱光)3-4d，下胚轴长出约3cm，用锋利的刀片切除下胚轴两端的生长点，切3-5mm小段平放在预培养基(向MS培养基中添加6-BA和NAA得到的培养基，6-BA和NAA的浓度分别为3mg/L和0.1mg/L)上，弱光预培养2天，得到预培养后的下胚轴。

4、将重组菌EHA105/pBI121接种至含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的10mLLB培养基中，28℃摇菌过夜，得到菌液。

5、步骤3结束后，将菌液转入离心管2000rpm 15min弃上清收集沉淀，于超净台上用液体MS培养基重悬后测OD₆₀₀值，调整OD₆₀₀值分别为0.1、0.3和0.5，得到菌体重悬液。

6、将步骤2的预培养后的下胚轴放入含有2ml液体MS培养基的培养皿内，全部转移完毕后吸出液体培养基，然后加入步骤4的菌体重悬液，侵染5min，侵染后将外植体全部取出置于无菌滤纸上，吹干菌液，得到不同浓度菌液侵染后的外植体，。

7、将不同浓度菌液侵染后的外植体在共培养培养基(共培养培养基：向MS培养基中添加6-BA和NAA得到的培养基，6-BA和NAA的浓度分别为3mg/L和0.1mg/L)中培养两天后进行GUS染色，观察不同浓度菌液的侵染情况，利用未侵染的外植体作为对照。

结果见图4，显示OD₆₀₀为0.1的菌体重悬液侵染效果最好，转化效率最高。

实施例2、花椰菜的基因编辑

本实施例构建了花椰菜的ALS基因(乙酰乳酸合成酶基因)和CENH3基因(着丝粒特异的组蛋白H3变体基因)的单核苷酸突变的植株，以ALS基因中的序列1所示的双链DNA片段和CENH3基因中的序列2所示的双链DNA片段为单核苷酸突变靶点，具体步骤如下：

一、重组载体的构建

合成如下四条单链DNA：

ALS-F：5′-ATTGAGGTCCCTCGCCGGATGAT-3′，ALS-R：5′-AAACATCATCCGGCGAGGGACCT-3′；

CENH3-F：5′-ATTGGCTCTTATGGCTATTCAAG-3′，CENH3-R：5′-AAACCTTGAATAGCCATAAGAGC-3′。

ALS-F和ALS-R各6μL等摩尔混匀做touch down PCR，反应条件为95℃/10min，95℃/1min，70个循环，每个循环降低1℃，16℃结束，得到带BsaI酶切接头的ALS靶点双链DNA。按照同样的方法得到CENH3靶点双链DNA。

将PHSE901-Basta(其序列为序列表中序列3)载体用内切酶BsaI酶切并回收载体骨架，连接载体骨架与ALS靶点双链DNA，将得到的序列正确的重组载体记为PHSE901-Basta-ALS；连接载体骨架与CENH3靶点双链DNA，将得到的序列正确的重组载体记为PHSE901-Basta-CENH3。

其中，序列3的第338-808位为U6-26p启动子，第1900-1975位为sgRNA骨架序列，第1994-2323位为U6-26t终止子，第3818-7918位为BE3基因，第9917-10469位为Bar基因。

二、重组菌的构建

将所得重组载体PHSE901-Basta-ALS导入农杆菌EHA105中得到重组菌EHA105/PHSE901-Basta-ALS，将所得重组载体PHSE901-Basta-CENH3导入农杆菌EHA105中得到重组菌EHA105/PHSE901-Basta-CENH3，将出发载体PHSE901-Basta导入农杆菌EHA105中得到空载体对照重组菌。

三、转基因植株的构建

分别利用步骤二所得重组菌EHA105/PHSE901-Basta-ALS、EHA105/PHSE901-Basta-CENH3和空载体对照重组菌，构建转基因植株，下述步骤中如无特殊说明，均在28℃，12h光照/12h黑暗的条件下进行。

1、选取健康饱满的花椰菜Korso种子，无菌水清洗1次，70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30S，无菌水冲洗2次；3％次氯酸钠消毒15min(加2-3滴吐温-20，避光，盖好封口膜并不断震荡)；无菌水冲洗约4次(无明显泡沫)，放于灭菌后的滤纸上吹干，得到消毒后的种子。

2、步骤1结束后，将消毒后的种子转入发芽培养基(即MS培养基)，遮光培养(弱光)3-4d，下胚轴长出约3cm，用锋利的刀片切除下胚轴两端的生长点，切3-5mm小段作为外植体平放在预培养基(向MS培养基中添加6-BA和NAA得到的培养基，6-BA和NAA的浓度分别为3mg/L和0.1mg/L)上，弱光预培养2天，得到预培养后的下胚轴。

3、将重组菌接种至含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的10mL LB培养基中，28℃摇菌过夜，得到菌液。

4、步骤3结束后，将菌液转入离心管2000rpm 15min弃上清收集沉淀，于超净台上用液体MS培养基重悬后测OD₆₀₀值，调整OD₆₀₀值为到0.1，得到菌体重悬液。

5、将步骤2的预培养后的下胚轴放入含有2ml液体MS培养基的培养皿内，全部转移完毕后吸出液体培养基，然后加入步骤4的菌体重悬液，侵染5min，侵染后将外植体全部取出置于无菌滤纸上，吹干菌液，得到侵染后的外植体。

6、将步骤5中侵染后的外植体分别转入共培养培养基(共培养培养基：向MS培养基中添加6-BA和NAA得到的培养基，6-BA和NAA的浓度分别为3mg/L和0.1mg/L)上，黑暗下共培养2天。

7、步骤6完成后，将未染菌且生长良好的共培养后的外植体转入筛选培养基1(向共培养培养基中添加Basta和羧苄青霉素(Cb)得到的培养基，Basta和羧苄青霉素(Cb)的浓度分别为3mg/L和300mg/L)中进行筛选。筛选期间，每周换一次培养基，筛选3-6周，得到抗性芽。

8、将筛选后的抗性芽转入芽伸长培养基(向MS培养基中添加Basta和羧苄青霉素(Cb)得到的培养基，Basta和羧苄青霉素(Cb)的浓度分别为3mg/L和200mg/L)上继续生长，2周换一次培养基，直至生根出苗(图5中A和B)，即得到抗性苗。

对得到的抗性苗利用Basta试纸条进行进一步检测筛选，筛选得到抗性再生植株(图5中C)。

9、抗性再生植株的PCR检测：利用CTAB法提取抗性株基因组DNA，之后对再生株的Cas9和gRNA区域进行PCR鉴定，筛选得到阳性苗(图6)。引物序列如下：

nCas9-IDF：5′-CATACCTCCCAGAACACAAATAAGC-3′；

nCas9-IDR：5′-ACTGAAGGGCAATAGTGAAGAATGT-3′；

gRNA-IDF：5′-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3′；

gRNA-IDR：5′-CCCCAGAAATTGAACGCCGAAGAAC-3′。

10、对鉴定得到的阳性苗目标编辑区段进行PCR扩增，对所得PCR产物进行测序(图7)，分析基因编辑结果。检测ALS基因编辑情况所用引物为：AlS7：5′-AAGAACAAGACTTTCGTCTCCC-3′；AlS762：5′-CCCCATCAAAGTACTCGCAA3′；检测CENH3基因编辑情况所用引物为：CENH3-245：5′-GTTACAAGCCTGGAACCGTTGC3′；CENH3-457：GCATAGCATCAGAGAACAAGCC3′。

四、结果分析

步骤三中第9步共获得PCR验证的对ALS基因进行编辑的阳性苗85株，获得对CENH3基因进行编辑的阳性苗120株。

目标基因PCR测序结果(图7)显示：85株对ALS基因进行编辑的阳性苗中21株发生了ALS基因单碱基替换突变，发生基因编辑的植株占24.7％，其中突变类型为C₆C₇C₈-T₆T₇T₈(即将序列表中序列1的第5-7位的胞嘧啶脱氧核苷酸均突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸)的是9株，突变类型为C₆C₇C₈-T₆T₇C₈(即将序列表中序列1的第5、6位的胞嘧啶脱氧核苷酸均突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸)的是5株，突变类型为C₆C₇C₈-C₆T₇T₈(即将序列表中序列1的第6、7位的胞嘧啶脱氧核苷酸均突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸)的是3株，突变类型为C₆C₇C₈-T₆C₇T₈(即将序列表中序列1的第5、7位的胞嘧啶脱氧核苷酸均突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸)的是1株,突变类型为C₆C₇C₈-C₆T₇C₈(即将序列表中序列1的第6位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸)的是1株，突变类型为C₆C₇C₈-T₆C₇C₈(即将序列表中序列1的第5位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸)的是2株。

120株对CENH3基因进行编辑的阳性苗中96株发生了单碱基替换突变，发生基因编辑的植株占80.0％，其突变均为序列表中序列2的第4位的胞嘧啶脱氧核苷酸突变为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。空载体对照重组菌处理的植株中ALS基因和CENH3基因均未发生改变。

制备ALS基因编辑再生植株和CENH3基因编辑再生植株时的转化效率(阳性苗数/外植体数目×100％)分别为16.7％和17.2％。ALS基因和CENH3基因的编辑效率分别为24.7％和80.0％(基因发生碱基替换编辑的植株数/阳性苗数×100％)。可见该方法可在花椰菜种高效创建单核苷酸定点突变植株。

五、不同外植体遗传转化效率比较

按照步骤三的方法，步骤7中筛选时间改为20天，其他步骤均不变。结果显示以下胚轴为外植体时的芽发生和再生苗是生长状态好，筛选死亡苗和存活苗差异显著，假阳性低，转化效率在12.4％-17.6％之间。

按照步骤三的方法，步骤2选取带柄子叶作为外植体，步骤7中筛选时间为35天。结果显示，以带柄子叶为外植体时需要更长时间的筛选，筛选35天才能较好的去除假阳性苗，转化效率较下胚轴低，在4.2％-7.2％之间。由此可见下胚轴做为外植体更有利于获得高效的转化编辑突变株。

六、不同筛选剂的比较

按照步骤一-三的方法，将PHSE901-Basta替换为PHSE901-Kana(PHSE901-Kana为将PHSE901-Basta中的抗性基因替换为Kana基因得到的重组载体)，以花椰菜Korso下胚轴为外植体，步骤三中7分别利用筛选培养基1和筛选培养基2进行筛选，其中，筛选培养基2为向共培养培养基中添加卡那霉素和羧苄青霉素得到的培养基，卡那霉素和羧苄青霉素的浓度分别为50mg/L和300mg/L。

结果显示，利用筛选培养基2进行筛选时容易苗玻璃化，影响再生苗的生长和成活，造成再生苗数量较Bar筛选标记转化的少,转化效率低。

综上所述，通过不同条件的比较试验获得了以花椰菜Korso下胚轴外植体，农杆菌OD0.1为最佳侵染浓度，Bar为转化筛选标记，利用优化了的培养基对花椰菜单碱基进行突变方法，具有很好的应用价值。

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种花椰菜单核苷酸突变的方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 花椰菜（Brassica oleracea var.botrytis）

<400> 1

aggtccctcg ccggatgat 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 花椰菜（Brassica oleracea var.botrytis）

<400> 2

gctcttatgg ctattcaag 19

<210> 3

<211> 17040

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60

aatctgatcc aagctcaagc tgctctagca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga 120

agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc 180

aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc 240

cagtgccaag cttcgacttg ccttccgcac aatacatcat ttcttcttag ctttttttct 300

tcttcttcgt tcatacagtt tttttttgtt tatcagctta cattttcttg aaccgtagct 360

ttcgttttct tctttttaac tttccattcg gagtttttgt atcttgtttc atagtttgtc 420

ccaggattag aatgattagg catcgaacct tcaagaattt gattgaataa aacatcttca 480

ttcttaagat atgaagataa tcttcaaaag gcccctggga atctgaaaga agagaagcag 540

gcccatttat atgggaaaga acaatagtat ttcttatata ggcccattta agttgaaaac 600

aatcttcaaa agtcccacat cgcttagata agaaaacgaa gctgagttta tatacagcta 660

gagtcgaagt agtgattggg agaccaaccc agtggacata agcctgttcg gttcgtaagc 720

tgtaatgcaa gtagcgtatg cgctcacgca actggtccag aaccttgacc gaacgcagcg 780

gtggtaacgg cgcagtggcg gttttcatgg cttgttatga ctgttttttt ggggtacagt 840

ctatgcctcg ggcatccaag cagcaagcgc gttacgccgt gggtcgatgt ttgatgttat 900

ggagcagcaa cgatgttacg cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta aacatcatgg 960

gggaagcggt gatcgccgaa gtatcgactc aactatcaga ggtagttggc gtcatcgagc 1020

gccatctcga accgacgttg ctggccgtac atttgtacgg ctccgcagtg gatggcggcc 1080

tgaagccaca cagtgatatt gatttgctgg ttacggtgac cgtaaggctt gatgaaacaa 1140

cgcggcgagc tttgatcaac gaccttttgg aaacttcggc ttcccctgga gagagcgaga 1200

ttctccgcgc tgtagaagtc accattgttg tgcacgacga catcattccg tggcgttatc 1260

cagctaagcg cgaactgcaa tttggagaat ggcagcgcaa tgacattctt gcaggtatct 1320

tcgagccagc cacgatcgac attgatctgg ctatcttgct gacaaaagca agagaacata 1380

gcgttgcctt ggtaggtcca gcggcggagg aactctttga tccggttcct gaacaggatc 1440

tatttgaggc gctaaatgaa accttaacgc tatggaactc gccgcccgac tgggctggcg 1500

atgagcgaaa tgtagtgctt acgttgtccc gcatttggta cagcgcagta accggcaaaa 1560

tcgcgccgaa ggatgtcgct gccgactggg caatggagcg cctgccggcc cagtatcagc 1620

ccgtcatact tgaagctaga caggcttatc ttggacaaga agaagatcgc ttggcctcgc 1680

gcgcagatca gttggaagaa tttgtccact acgtgaaagg cgagatcacc aaggtagtcg 1740

gcaaataatg tctagctaga aattcgttca agccgacgcc gcttcgcggc gcggcttaac 1800

tcaagcgtta gatgcactaa gcacataatt gctcacagcc aaactatcag gtcaagtctg 1860

cttttattat ttttaagcgt gcataataag ccggtctcgg ttttagagct agaaatagca 1920

agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 1980

tttgcaaaat tttccagatc gatttcttct tcctctgttc ttcggcgttc aatttctggg 2040

gttttctctt cgttttctgt aactgaaacc taaaatttga cctaaaaaaa atctcaaata 2100

atatgattca gtggttttgt acttttcagt tagttgagtt ttgcagttcc gatgagataa 2160

accaataagc ttgcatgcct gcaggtcaac atggtggagc acgacacact tgtctactcc 2220

aaaaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg 2280

gtaatatccg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag 2340

atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc 2400

gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc 2460

gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgataacatg 2520

gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa 2580

agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 2640

ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 2700

catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 2760

gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 2820

aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat 2880

ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacctcgacc 2940

tcaacacaac atatacaaaa caaacgaatc tcaagcaatc aagcattcta cttctattgc 3000

agcaatttaa atcatttctt ttaaagcaaa agcaattttc tgaaaatttt caccatttac 3060

gaacgatact cgagtaatct agatgtcttc cgagacagga ccggttgccg tcgaccctac 3120

tcttagaagg cgcattgagc cacacgagtt cgaggtgttc ttcgatccga gagagctgag 3180

gaaggagact tgcctccttt acgagatcaa ttggggcgga aggcactcta tttggcgcca 3240

tacctcccag aacacaaata agcatgtgga ggttaatttc atcgagaagt tcactaccga 3300

gaggtacttc tgcccaaaca cacgctgcag catcacttgg ttccttagct ggtcaccgtg 3360

cggagagtgc tctcgcgcca ttacagagtt cctgtccaga tacccgcacg ttactctttt 3420

catctacatt gccagactgt accaccatgc ggatcctcgc aacagacagg gtcttaggga 3480

cctgatcagc tcaggcgtca ccatccagat tatgacagag caggagtctg gatactgctg 3540

gcgcaacttc gtgaattact ctccttccaa tgaggctcac tggccaagat acccgcatct 3600

gtgggtcagg ctctacgtgc tcgagcttta ctgcatcatt cttggtctgc ctccatgcct 3660

caacatcctt agaaggaagc agccacagct cacattcttc actattgccc ttcagtcttg 3720

ccactaccag aggcttccgc ctcatattct gtgggcgact ggcctcaaga gcggctcaga 3780

gactccggga acatctgagt ccgctactcc tgagtctgac aagaagtact ccatcggact 3840

cgccattggt actaactccg ttggatgggc ggtcatcacc gatgagtaca aggtgcctag 3900

caagaagttc aaggttcttg gtaacacaga cagacactca atcaagaaga atctgattgg 3960

tgctctgctc ttcgattctg gagagactgc cgaggctacc aggctcaaga gaaccgcccg 4020

cagaaggtac acacgcagaa agaataggat ctgctacctt caggagattt tctctaacga 4080

gatggctaag gttgatgaca gcttcttcca tcgccttgag gagtcattcc tggtcgagga 4140

ggacaagaag cacgagagac atcctatctt cggtaacatt gtcgatgagg tggcctacca 4200

cgagaagtac ccaactatct accatcttag gaagaagctg gtggatagca ccgacaaggc 4260

ggatctccgc cttatctacc tggctctcgc ccacatgatt aagttcagag gccatttcct 4320

catcgagggc gatctcaacc cagataattc agacgtcgat aagctcttca tccagcttgt 4380

gcagacatac aatcagcttt tcgaggagaa cccgattaat gcgagcggtg ttgatgcgaa 4440

ggctatcctg tcagctagac tcagcaagtc aaggcgcctg gagaacctca tcgcccagct 4500

gccaggcgag aagaagaacg gtcttttcgg caatctgatt gcgctttctc tgggactcac 4560

cccgaacttc aagtccaatt tcgacctggc tgaggatgcc aagctccagc tgtctaagga 4620

tacatacgat gacgatctcg acaaccttct ggctcagatc ggcgaccagt acgccgatct 4680

cttccttgct gccaagaatc ttagcgatgc catcctcctt tcagacattc tgagagttaa 4740

cactgagatt accaaggctc cgctgtctgc ctccatgatc aagagatacg atgagcacca 4800

tcaggacctc actctgctca aggcgctggt ccgccagcag ctccctgaga agtacaagga 4860

gatcttcttc gaccagtcta agaacggcta cgcgggttac attgatggtg gcgctagcca 4920

ggaggagttc tacaagttca tcaagccaat tctggagaag atggatggca ctgaggagct 4980

tctggtcaag ctcaataggg aggatctcct taggaagcag cgcaccttcg acaacggatc 5040

tatccctcac cagattcatc ttggagagct gcacgccatc ctcagaaggc aggaggattt 5100

ctacccattc cttaaggaca accgcgagaa gatcgagaag attctgactt tcagaatccc 5160

ttactacgtt ggcccgctcg ctagaggcaa ctctaggttc gcgtggatga ccaggaagtc 5220

agaggagact atcacccctt ggaacttcga ggaggtggtt gacaagggag ccagcgcgca 5280

gtcattcatt gagcgcatga ctaatttcga taagaacctg cctaatgaga aggtcctccc 5340

aaagcatagc ctgctctacg agtacttcac tgtgtacaac gagcttacca aggtgaagta 5400

tgtgacagag ggcatgcgca agccggcttt cctttcagga gagcagaaga aggccatcgt 5460

ggatcttctg ttcaagacta atagaaaggt caccgtgaag cagctgaagg aggattactt 5520

caagaagatt gagtgcttcg actctgttga gatctccggt gtcgaggata ggttcaacgc 5580

ttccctcggc acctaccacg acctccttaa gatcattaag gacaaggatt tcctggataa 5640

cgaggagaat gaggacatcc tcgaggatat tgtgctgaca ctcactcttt tcgaggacag 5700

ggagatgatc gaggagcgcc ttaagacata cgcgcatctg ttcgacgata aggttatgaa 5760

gcagctcaag cgcagaaggt acactggatg gggtagactc tctaggaagc tcatcaacgg 5820

catcagagat aagcagtctg gcaagactat tctcgatttc cttaagtccg acggcttcgc 5880

taacaggaat ttcatgcagc tcattcacga cgattctctt actttcaagg aggacatcca 5940

gaaggcgcag gttagcggcc agggagattc actgcacgag catatcgcga acctcgctgg 6000

ctcccctgct atcaagaagg gcatcctcca gaccgttaag gtcgtggatg agctggttaa 6060

ggtcatgggc agacataagc cagagaacat cgtcattgag atggccaggg agaatcagac 6120

aactcagaag ggacagaaga actctaggga gcgcatgaag agaatcgagg agggtattaa 6180

ggagcttggc tcccagatcc tgaaggagca cccggtggag aacacacagc tgcagaatga 6240

gaagctgtac ctctactacc tccagaatgg ccgcgacatg tatgtggatc aggagcttga 6300

cattaacaga ctttctgact acgatgtgga ccatatcgtt ccacagtctt tccttaagga 6360

cgattccatt gataataagg tgctgactag atccgataag aacaggggaa agtctgacaa 6420

tgttccgtcc gaggaggttg tcaagaagat gaagaactac tggaggcagc tgctcaatgc 6480

taagctcatc acccagagga agttcgacaa ccttacaaag gccgagcgcg gaggtctgag 6540

cgagcttgat aaggcgggtt tcattaagag acagctcgtt gagacaaggc agatcactaa 6600

gcacgtcgcc cagattcttg actcaaggat gaacaccaag tacgacgaga atgataagct 6660

gatccgcgag gtgaaggtta ttacactgaa gagcaagctc gtttcagatt tcagaaagga 6720

cttccagttc tacaaggtca gggagatcaa caattaccac catgcccatg atgcgtacct 6780

caacgcggtg gttggtactg ctcttattaa gaagtacccg aagctggagt ctgagttcgt 6840

gtacggcgat tacaaggtgt acgacgttag aaagatgatc gctaagagcg agcaggagat 6900

tggcaaggct accgccaagt acttcttcta ctcaaacatt atgaatttct tcaagacaga 6960

gatcactctc gcgaacggcg agatcagaaa gaggccactt attgagacta acggcgagac 7020

aggagagatc gtctgggata agggtcgcga cttcgctact gtcagaaagg tgctctctat 7080

gccgcaggtt aatattgtca agaagactga ggtgcagacc ggcggattct ctaaggagtc 7140

cattctccct aagaggaact ccgacaagct catcgcccgc aagaaggatt gggaccctaa 7200

gaagtacggt ggcttcgata gcccaaccgt cgcttactca gtgcttgtcg tggccaaggt 7260

cgagaaggga aagagcaaga agctgaagtc agtgaaggag cttctgggta tcacaattat 7320

ggagaggtct tccttcgaga agaatcctat cgacttcctc gaggcgaagg gctacaagga 7380

ggttaagaag gatcttatca ttaagctgcc aaagtactca cttttcgagc tggagaacgg 7440

acgcaagaga atgctggcgt ctgctggaga gcttcagaag ggtaatgagc ttgctctgcc 7500

gtctaagtat gtgaacttcc tctaccttgc ctctcattac gagaagctca agggctcccc 7560

tgaggacaac gagcagaagc agctgttcgt cgagcagcac aagcattacc tcgatgagat 7620

cattgagcag attagcgagt tctcaaagag agtgatcctc gccgatgcga atctcgacaa 7680

ggttcttagc gcgtacaaca agcaccgcga taagccaatc agagagcagg ctgagaatat 7740

cattcatctc ttcaccctta caaacctggg tgctccggcg gctttcaagt acttcgatac 7800

cacaattgac aggaagcgct acacttcaac caaggaggtg ctggacgcca ccctcatcca 7860

ccagtctatt actggcctct acgagactag gatcgatctc tcccagcttg gtggtgactc 7920

tggcggatcc accaacctca gcgatatcat tgagaaggag acaggcaagc agcttgttat 7980

ccaggagtca attctgatgc tcccggagga ggtggaggag gttattggca ataagcctga 8040

gtctgatatc ctcgtgcata ctgcctacga tgagagcacc gacgagaacg ttatgctcct 8100

tacatcagac gcgcctgagt acaagccttg ggctctcgtc attcaggatt ccaacggaga 8160

gaataagatc aagatgctta gcggtggctc tcctaagaag aagagaaagg tgtgagctca 8220

gagctttcgt tcgtatcatc ggtttcgaca acgttcgtca agttcaatgc atcagtttca 8280

ttgcgcacac accagaatcc tactgagttt gagtattatg gcattgggaa aactgttttt 8340

cttgtaccat ttgttgtgct tgtaatttac tgtgtttttt attcggtttt cgctatcgaa 8400

ctgtgaaatg gaaatggatg gagaagagtt aatgaatgat atggtccttt tgttcattct 8460

caaattaata ttatttgttt tttctcttat ttgttgtgtg ttgaatttga aattataaga 8520

gatatgcaaa cattttgttt tgagtaaaaa tgtgtcaaat cgtggcctct aatgaccgaa 8580

gttaatatga ggagtaaaac acttgtagtt gtaccattat gcttattcac taggcaacaa 8640

atatattttc agacctagaa aagctgcaaa tgttactgaa tacaagtatg tcctcttgtg 8700

ttttagacat ttatgaactt tcctttatgt aattttccag aatccttgtc agattctaat 8760

cattgcttta taattatagt tatactcatg gatttgtagt tgagtatgaa aatatttttt 8820

aatgcatttt atgacttgcc aattgattga caacgaattc gtaatcatgt catagctgtt 8880

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 8940

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 9000

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 9060

ggggagaggc ggtttgcgta ttggctagag cagcttgcca acatggtgga gcacgacact 9120

ctcgtctact ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact 9180

tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac 9240

ttcatcaaaa ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa 9300

ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc 9360

acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga 9420

tgtgaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag atacagtctc 9480

agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg 9540

attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg aaggtggcac 9600

ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct ctgccgacag 9660

tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 9720

cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca 9780

atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag 9840

gacacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct ctctcgagct ttcgcagatc 9900

cggggggcaa tgagatatga gcccagaacg acgcccggcc gacatccgcc gtgccaccga 9960

ggcggacatg ccggcggtct gcaccatcgt caaccactac atcgagacaa gcacggtcaa 10020

cttccgtacc gagccgcagg aaccgcagga gtggacggac gacctcgtcc gtctgcggga 10080

gcgctatccc tggctcgtcg ccgaggtgga cggcgaggtc gccggcatcg cctacgcggg 10140

cccctggaag gcacgcaacg cctacgactg gacggccgag tcgaccgtgt acgtctcccc 10200

ccgccaccag cggacgggac tgggctccac gctctacacc cacctgctga agtccctgga 10260

ggcacagggc ttcaagagcg tggtcgctgt catcgggctg cccaacgacc cgagcgtgcg 10320

catgcacgag gcgctcggat atgccccccg cggcatgctg cgggcggccg gcttcaagca 10380

cgggaactgg catgacgtgg gtttctggca gctggacttg agcctgccgg taccgccccg 10440

tccggtcctg cccgtcaccg agatctgaag tagatgccga ccgggatctg tcgatcgaca 10500

agctcgagtt tctccataat aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat tagggttcct 10560

atagggtttc gctcatgtgt tgagcatata agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta 10620

aaatacttct atcaataaaa tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtac taaaatccag 10680

atcccccgaa ttaattcggc gttaattcag tacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta 10740

agttgtctaa gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc tgccaccagc cagccaacag 10800

ctccccgacc ggcagctcgg cacaaaatca ccactcgata caggcagccc atcagtccgg 10860

gacggcgtca gcgggagagc cgttgtaagg cggcagactt tgctcatgtt accgatgcta 10920

ttcggaagaa cggcaactaa gctgccgggt ttgaaacacg gatgatctcg cggagggtag 10980

catgttgatt gtaacgatga cagagcgttg ctgcctgtga tcaccgcggt ttcaaaatcg 11040

gctccgtcga tactatgtta tacgccaact ttgaaaacaa ctttgaaaaa gctgttttct 11100

ggtatttaag gttttagaat gcaaggaaca gtgaattgga gttcgtcttg ttataattag 11160

cttcttgggg tatctttaaa tactgtagaa aagaggaagg aaataataaa tggctaaaat 11220

gagaatatca ccggaattga aaaaactgat cgaaaaatac cgctgcgtaa aagatacgga 11280

aggaatgtct cctgctaagg tatataagct ggtgggagaa aatgaaaacc tatatttaaa 11340

aatgacggac agccggtata aagggaccac ctatgatgtg gaacgggaaa aggacatgat 11400

gctatggctg gaaggaaagc tgcctgttcc aaaggtcctg cactttgaac ggcatgatgg 11460

ctggagcaat ctgctcatga gtgaggccga tggcgtcctt tgctcggaag agtatgaaga 11520

tgaacaaagc cctgaaaaga ttatcgagct gtatgcggag tgcatcaggc tctttcactc 11580

catcgacata tcggattgtc cctatacgaa tagcttagac agccgcttag ccgaattgga 11640

ttacttactg aataacgatc tggccgatgt ggattgcgaa aactgggaag aagacactcc 11700

atttaaagat ccgcgcgagc tgtatgattt tttaaagacg gaaaagcccg aagaggaact 11760

tgtcttttcc cacggcgacc tgggagacag caacatcttt gtgaaagatg gcaaagtaag 11820

tggctttatt gatcttggga gaagcggcag ggcggacaag tggtatgaca ttgccttctg 11880

cgtccggtcg atcagggagg atatcgggga agaacagtat gtcgagctat tttttgactt 11940

actggggatc aagcctgatt gggagaaaat aaaatattat attttactgg atgaattgtt 12000

ttagtaccta gaatgcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 12060

agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 12120

ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 12180

accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 12240

tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 12300

cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 12360

gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 12420

gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 12480

gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 12540

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 12600

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 12660

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 12720

ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 12780

taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc 12840

agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg 12900

tatttcacac cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 12960

ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca 13020

acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 13080

gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 13140

aggcagggtg ccttgatgtg ggcgccggcg gtcgagtggc gacggcgcgg cttgtccgcg 13200

ccctggtaga ttgcctggcc gtaggccagc catttttgag cggccagcgg ccgcgatagg 13260

ccgacgcgaa gcggcggggc gtagggagcg cagcgaccga agggtaggcg ctttttgcag 13320

ctcttcggct gtgcgctggc cagacagtta tgcacaggcc aggcgggttt taagagtttt 13380

aataagtttt aaagagtttt aggcggaaaa atcgcctttt ttctctttta tatcagtcac 13440

ttacatgtgt gaccggttcc caatgtacgg ctttgggttc ccaatgtacg ggttccggtt 13500

cccaatgtac ggctttgggt tcccaatgta cgtgctatcc acaggaaaca gaccttttcg 13560

acctttttcc cctgctaggg caatttgccc tagcatctgc tccgtacatt aggaaccggc 13620

ggatgcttcg ccctcgatca ggttgcggta gcgcatgact aggatcgggc cagcctgccc 13680

cgcctcctcc ttcaaatcgt actccggcag gtcatttgac ccgatcagct tgcgcacggt 13740

gaaacagaac ttcttgaact ctccggcgct gccactgcgt tcgtagatcg tcttgaacaa 13800

ccatctggct tctgccttgc ctgcggcgcg gcgtgccagg cggtagagaa aacggccgat 13860

gccgggatcg atcaaaaagt aatcggggtg aaccgtcagc acgtccgggt tcttgccttc 13920

tgtgatctcg cggtacatcc aatcagctag ctcgatctcg atgtactccg gccgcccggt 13980

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