一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法

文档序号：1388838 发布日期：2020-08-18 浏览：8次 >En<

阅读说明：本技术 一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法 (Method for realizing gene knockout in porcine fetal fibroblast by using CRISPR/Cas9 system ) 是由姜爱文刘红林陶景丽李荣阳张轩于 2020-04-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法,包括下述步骤：构建Cas9/sgRNA真核表达载体；构建RGS-CR双荧光代替性报告载体；将Cas9/sgRNA真核表达载体和RGS-CR报告载体共转至293T细胞中,筛选最高效的sgRNA序列；将筛选出的Cas9/sgRNA质粒电转至猪胎儿成纤维细胞中,实现敲除。本发明的方法操作简单,可在猪体细胞上可实现高效的基因编辑。(The invention discloses a method for realizing gene knockout in porcine fetal fibroblasts by using a CRISPR/Cas9 system, which comprises the following steps: constructing a Cas9/sgRNA eukaryotic expression vector; constructing an RGS-CR dual-fluorescence alternative report vector; transferring a Cas9/sgRNA eukaryotic expression vector and an RGS-CR report vector into a 293T cell together, and screening the most efficient sgRNA sequence; and electrically transferring the screened Cas9/sgRNA plasmid into a porcine fetal fibroblast to realize knockout. The method of the invention is simple to operate, and can realize high-efficiency gene editing on the somatic cells of the pigs.)

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法。

背景技术

CRISPR-Cas系统最早发现于细菌和古生菌基因组中，是细菌和古生菌的自身免疫防护机制。其中，CRISPR发挥识别功能，而Cas蛋白发挥剪切功能。CRISPR簇是由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。

CRISPR-Cas系统有3种类型，在2型CRISPR-Cas系统中，Cas9含有RuvC和HNH两个独特的活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNaseIII核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。

自2013年开始，研究者们在包括《science》和《nature biotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍该系统，并成功利用该系统在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法，该方法包括下述步骤：

(1)、构建Cas9/sgRNA真核表达载体；

(2)、构建RGS-CR双荧光代替性报告载体；

(3)、将步骤(1)构建的Cas9/sgRNA真核表达载体和步骤(2)构建的RGS-CR双荧光代替性报告载体共转至293T细胞中，筛选最高效的sgRNA序列；

(4)将筛选出的Cas9/sgRNA真核表达载体电转至猪胎儿成纤维细胞中，实现敲除。

作为一种优选技术方案：步骤(1)构建Cas9/sgRNA真核表达载体的具体过程包括以下步骤：

(a)、依据目的基因设计sgRNA靶点序列，将带有限制性内切酶BbsI粘性末端序列的sgRNA靶点序列以及带有限制性内切酶BbsI粘性末端序列的互补序列退火形成DNA双链；

(b)、px459v2.0-cas9质粒用BbsⅠ酶切后，回收质粒骨架，然后将步骤(a)中得到的DNA双链克隆到px459v2.0-cas9质粒骨架中，得到px459-sgRNA。

(c)、连接产物转化至DH5a中，挑单克隆扩培后测序鉴定。

作为一种优选技术方案：步骤(2)构建RGS-CR双荧光代替性报告载体的具体过程包括以下步骤：

(a)、依据目的基因设计sgRNA靶点序列的RGS-CR报告载体序列，将带有限制性内切酶EcoRⅠ粘性末端序列的RGS-CR报告载体序列以及带有限制性内切酶BamHⅠ粘性末端序列的互补序列退火形成DNA双链；

(b)、RGS-CR质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，回收质粒骨架，然后将步骤(a)中得到的DNA双链克隆到RGS-CR质粒骨架中，得到RGS-sgRNA。

(c)、连接产物转化至DH5a中，挑单克隆扩培后测序鉴定。

作为一种优选技术方案：步骤(3)的具体过程包括以下步骤：

(a)、将293T细胞传至细胞培养器皿中，待汇合度达到要求时进行转染；详细的为，将293T细胞传至5个6cm培养皿中，待汇合度达到90％时进行转染。

(b)、按照Lipofectamine3000说明书进行共转，转染后48h观察荧光。

作为一种优选技术方案：步骤(4)的具体过程包括以下步骤：

(a)、将传至第三代的PEF，使用Tryple消化后收集至离心管中离心；将配置好的无抗培养基加入细胞培养板中，提前放入培养箱中预热；

(b)、向电转玻璃管中加入buffer E，并插入移液器座；

(c)、将离心后的PEF使用DPBS清洗一次，再次离心并弃掉DPBS；使用Buffer R重悬细胞沉淀，并加入Cas9/sgRNA真核表达载体，1500V，3次，10ms；

(d)、电转后的细胞放入细胞培养板中进行培养实现敲除。

进一步优选的：基因敲除所针对的目的基因为ROSA26，但不限于此。针对该目的基因的设计的sgRNA靶点序列为5’-AGAGAAGAGGCTGTGCTCTG-3’(SEQ ID No.2)。

带有限制性内切酶BbsI粘性末端序列的sgRNA靶点序列为5’-CACCGAGAGAAGAGGCTGTGCTCTG-3’(SEQ ID No.5)；其带有限制性内切酶BbsI粘性末端序列的互补序列为5’-AAACCAGAGCACAGCCTCTTCTCTC-3’(SEQ ID No.6)

针对该目的基因设计的sgRNA靶点序列的RGS-CR报告载体序列为5’-AGAGAAGAGGCTGTGCTCTGGGG(PAM)-3’(SEQ ID No.8)。

带有限制性内切酶EcoRⅠ粘性末端序列的RGS-CR报告载体序列为5’-AATTCAGAGAAGAGGCTGTGCTCTGGGG(PAM)-3’(SEQ ID No.11)，其带有限制性内切酶BamHⅠ粘性末端序列的互补序列为5’-GATCCCCCAGAGCACAGCCTCTTCTCTG-3’(SEQ ID No.12)。

更进一步优选的：步骤(1)中退火形成DNA双链的过程为：将带有限制性内切酶BbsI粘性末端序列的sgRNA靶点序列以及带有限制性内切酶BbsI粘性末端序列的互补序列溶解后各取1uL，再加入1uL 10×T4 ligase buffer，1uL T4 PNK，6uL dH₂O，混匀；37℃加热30min，95℃加热5min，梯度降温至25℃，随后25℃孵育5min，4℃孵育5min，-20℃保存备用。

更进一步优选的：步骤(2)中退火形成DNA双链的过程为：将带有限制性内切酶EcoRⅠ粘性末端序列的RGS-CR报告载体序列以及带有限制性内切酶BamHⅠ粘性末端序列的互补序列溶解后各取1uL，再加入1uL 10×T4 ligase buffer，1uL T4 PNK，6uL dH₂O，混匀；37℃加热30min，95℃加热5min，梯度降温至25℃，随后25℃孵育5min，4℃孵育5min，-20℃保存备用。

更进一步优选的：步骤(4)的具体过程为：

(a)、将传至第三代的PEF，使用Tryple消化3min，收集至15mL离心管中，1000rpm离心5min；将配置好的无抗培养基加入6孔板中，每孔2mL，提前放入培养箱中预热；

(b)、将电转玻璃管中加入3mL buffer E，并插入移液器座；

(c)、PEF离心以后，使用DPBS清洗一次，离心5min后弃掉DPBS；使用Buffer R重悬细胞沉淀，并加入2ug Cas9/sgRNA真核表达载体，1500V，3次，10ms；

(d)、电转后的细胞放入6孔板中，培养72h，实现敲除。

本发明所述的室温为25±5℃。

本发明具有以下效益：

1、针对猪原代细胞进行基因编辑，相对来说大型动物的原代细胞难转染，因此进行基因编辑较为困难，相关研究也较少，本发明在实现基因敲除的基础上，为后续大型动物基因敲入奠定基础。

2、利用RGS-CR筛选最有效的sgRNA靶序列，提高基因编辑的准确性和可靠性。

附图说明

图1为px459-sgRNA+RGS-sgRNA检测的荧光图；

图2为不同电转条件下px458-EGFP的电转效率荧光图；

图3为测序得到的猪胎儿成纤维细胞中靶基因的定点突变。

具体实施方式

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实验例对本发明一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法做进一步说明。

实验例1：一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法：

本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法，通过将含有特定sgRNA打靶序列的px459v2.0-cas9质粒利用Neon电转系统转染至PEF，得到基因敲除的PEF细胞，包括以下步骤：

一、目的基因靶序列的确定及Cas9质粒的构建

在目的基因的外显子序列中，找到PAM序列，即N₍₂₀₎NGG，N₍₂₀₎即为目的基因的靶点序列。本发明中选择的目的基因是pROSA26，依据目的基因设计不同的靶点序列sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1的靶点序列为5’-AAAGTGTGCTGTGTATTTTG-3’(SEQ ID No.1)，sgRNA2的靶点序列为5’-AGAGAAGAGGCTGTGCTCTG-3’(SEQ ID No.2)；

将sgRNA1靶点序列连同限制性内切酶BbsI四个碱基的粘性末端5’-CACCGAAAGTGTGCTGTGTATTTTG-3’(SEQ ID No.3)，以及互补序列连同限制性内切酶BbsI四个碱基的粘性末端5’-AAACCAAAATACACAGCACACTTTC-3’(SEQ ID No.4)，sgRNA2的靶点序列连同限制性内切酶BbsI四个碱基的粘性末端5’-CACCGAGAGAAGAGGCTGTGCTCTG-3’(SEQ IDNo.5)以及互补序列连同限制性内切酶BbsI四个碱基的粘性末端5’-AAACCAGAGCACAGCCTCTTCTCTC-3’(SEQ ID No.6)送北京擎科生物有限公司合成；

合成的靶序列及其互补序列分别用水溶解至100uM，各取1uL，再加入1uL 10×T4ligase buffer，1uL T4 PNK，6uL dH₂O，混匀；37℃加热30min，95℃加热5min，梯度降温至25℃，随后25℃孵育5min，4℃孵育5min，形成DNA双链，-20℃保存备用；

px459v2.0-cas9质粒(购自addgene)用限制性内切酶BbsⅠ(NEB)酶切，反应体系为DNA质粒10uL，BbsⅠ限制性内切酶5uL，10×buffer G 10uL，去离子水175uL，混匀之后37℃孵育3h。孵育后，跑1.2％的琼脂糖凝胶，分离目的片段，约9000bp，将目的DNA片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)回收，确保浓度在50ng/uL，-20℃保存备用；

将靶序列及互补形成的双链DNA克隆至经限制性内切酶BbsⅠ(NEB)酶切的px459v2.0-cas9质粒中，连接体系为：回收的px459v2.0-cas9质粒骨架100ng，靶序列及互补形成的DNA双链2uL，10×T4 DNA ligase buffer 1uL，T4 ligase 1uL，去离子水补足至10uL。16℃连接过夜。将连接产物导入感受态细胞DH5a中进行转化，扩大培养，测序正确后提取质粒，得到的质粒分别命名为px459-sgRNA1和px459-sgRNA2，将质粒浓度调整为1ug/uL。

二、含靶点序列的RGS-CR质粒的构建及在293T细胞中目的基因不同靶序列活性的筛选

1、含靶点序列的RGS-CR质粒的构建

sgRNA1靶点序列的RGS-CR报告载体序列为5’-AAAGTGTGCTGTGTATTTTGAGG(PAM)-3’(SEQ ID No.7)，命名为sgRNA1-RGS-CR；sgRNA2靶点序列的RGS-CR报告载体序列为5’-AGAGAAGAGGCTGTGCTCTGGGG(PAM)-3’(SEQ ID No.8)，命名为sgRNA2-RGS-CR；将sgRNA1和sgRNA2靶点的RGS-CR报告载体序列连同限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ的四个碱基的粘性末端送至北京擎科生物有限公司合成；其中，sgRNA1靶序列连同EcoRⅠ粘性末端序列为5’-AATTCAAAGTGTGCTGTGTATTTTGAGG(PAM)-3’(SEQ ID No.9)，其反向互补序列连同限制性内切酶BamHⅠ的粘性末端序列为5’-GATCCCTCAAAATACACAGCACACTTTG-3’(SEQ ID No.10)；sgRNA2点序列连同EcoRⅠ粘性末端序列为5’-AATTCAGAGAAGAGGCTGTGCTCTGGGG(PAM)-3’(SEQ ID No.11)，其互补序列连同BamHⅠ粘性末端序列为5’-GATCCCCCAGAGCACAGCCTCTTCTCTG-3’(SEQ ID No.12)；

合成的靶序列及其互补序列分别用水溶解至100uM，各取1uL，再加入1uL 10×T4ligase buffer，1uL T4 PNK，6uL dH₂O，混匀；37℃加热30min，95℃加热5min，梯度降温至25℃，随后25℃孵育5min，4℃孵育5min，-20℃保存备用。

将RGS-CR报告载体(现有技术已公开的双荧光报告质粒)用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切体系为RGS-CR质粒20ug，EcoRⅠ10uL，BamHⅠ10ul，10×Tango buffer 40ul，DEPC水120uL。37℃孵育3h，回收质粒骨架。将sgRNA1-RGS-CR和sgRNA2-RGS-CR连接到RGS-CR的骨架上，将最终得到的载体分别命名为RGS-sgRNA1和RGS-sgRNA2。

2、293T细胞中目的基因不同靶序列活性的筛选

将px459-sgRNA1质粒，px459-sgRNA2，RGS-CR，px459-sgRNA1+RGS-sgRNA1，px459-sgRNA2+RGS-sgRNA2分别转染293T细胞。转染前一天，将293T细胞平均传至5个60mm培养皿中，待其汇合度达到90％时进行转染。取10个1.5mL离心管，分别编号1-10,；在1-5号离心管中加入280uL opti-M，随后加入16.8uL lipo3000转染试剂，混匀；在6-10号离心管中分别加入280uL opti-M，随后加入24uL P3000，然后在6号管中加入12ug px459-sgRNA1，在7号管中加入12ug px459-sgRNA2，在8号管中加入12ug RGS-CR，在9号管中加入6ug px459-sgRNA1和6ug RGS-sgRNA1，在10号管中加入6ug px459-sgRNA2和6ug RGS-sgRNA2；各自混匀后，将1号管中的转染试剂加入6号管中，2号加入7号，3号加入8号，4号加入9号，5号加入10号，充分混匀形成转染混合液，室温静置15min，随后逐滴加入293T细胞中。48h后，观察荧光表达情况(图1)。荧光显示，px459-sgRNA2+RGS-sgRNA2的绿色荧光表达明显多于px459-sgRNA1+RGS-sgRNA1，因此，后续选择px459-sgRNA2进行后续打靶实验。

三、利用Neon^TM电转系统进行电转条件筛选及px459-sgRNA2电转至PEF实现敲除

1、Neon^TM电转px458-EGFP进行电转条件筛选

取2个35mm培养皿的猪成体成纤维(PAF)，Tryple消化后1000rpm离心5min，收集细胞沉淀；1mLDPBS重悬细胞，并转移至1.5mL离心管中，离心去除DPBS；将2个35mm培养皿的细胞沉淀中，加入36uL Buffer R，再加入4uL px458-EGFP质粒，混匀；向12孔板中加入无抗的细胞培养基1mL，37℃培养箱预热；将电转移液枪打到2档，使螺丝完全松开，用力将枪头插入移液器，使螺丝完全夹住枪头内部的金属条，松开移液器按钮；将枪按到一档，缓慢吸气混液10uL；将移液枪放入电转玻璃管中，听到咔哒一声后，调节电压、脉冲时间和脉冲次数，按start开始，电击结束出现complete后，拿出移液器，将枪内混液加入12孔板中，立即摇匀；为选择最适宜的电转条件，本试验共设3组，分别是1500V、10ms、3次，1600V、10ms、2次，1650V、20ms、1次。培养48h，观察绿色荧光以确定转染效率，同时观察细胞状态确定细胞活力(图2)。结果表明，1500V、10ms、3次的电转条件细胞转染效率较高，且细胞活力较好，因此在后续实验中选择该条件进行电转。

2、px459-sgRNA2电转至PEF实现敲除

将传至第三代的PEF，Tryple消化3min，收集至15mL离心管中，1000rpm离心5min；此时6孔板中每孔加入2mL无抗培养基，提前放入37℃培养箱预热；向电转玻璃管中加入bufferE，并插入移液器座；PEF离心以后，使用DPBS清洗一次，离心5min，弃掉DPBS，使用9uLBuffer R重悬细胞沉淀，并加入2ug px459-sgRNA2，混匀后，1500V、10ms、3次进行电转，将电转后的细胞加入到6孔板中培养72h，实现敲除；

四、突变PEF的检测

此步主要是检测CRISPR/Cas9系统介导的猪胎儿成纤维细胞ROSA26的敲除效率，具体步骤为：

电转的细胞培养72h后，胰酶消化，1000rpm离心5min，弃掉胰酶；PBS清洗一次，1000rpm离心5min，弃掉PBS，收集细胞沉淀；使用基因组DNA提取试剂盒(天根DP304)提取PEF基因组DNA；

利用PCR上游引物和下游引物扩增靶点附近约500bp的DNA片段，PCR体系为：Q5高保真酶12.5uL，上、下游引物(SEQ ID No.13和SEQ ID No.14)各1.25uL，基因组DNA 1uL，去离子水9uL；扩增程序为：98℃30s，35×(98℃5s，58℃10s，72℃20s)，72℃2min，4℃保存；所用引物如下：

序列13：ACTGTGTTGGCGGACTGG(SEQ ID No.13)

序列14：AACGATATGCTCCCGACTTCC(SEQ ID No.14)

将扩增后的PCR产物连T载体，进行测序。共挑19个克隆测序，突变3个，突变率为15.79％，PEF突变检测结果见图3。

本发明提供的一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法，可在猪原代细胞上可实现高效的基因编辑。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现基因敲除的方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA