阅读说明：本技术 microRNA诱导开启型DNA荧光纳米机器人在肿瘤中的应用及其构建方法 (Application of microRNA (ribonucleic acid) induced open type DNA (deoxyribonucleic acid) fluorescence nano robot in tumor and construction method thereof ) 是由 吴正治 张鹏 李利民 刘洁人 刘展艳 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程技术领域,公开了一种肿瘤标志物microRNA诱导开启型DNA纳米机器人在肿瘤细胞中的应用及其构建方法,首次将肿瘤标志物microRNA诱导开启型DNA纳米机器人与以DNA为模板原位合成的金属纳米簇结合,构建新型荧光纳米机器人,利用金属纳米簇具有荧光成像和抑制细胞生长的功能,实现对肿瘤细胞免标记、免修饰成像并抑制其生长的功能。本发明利用肿瘤标志物microRNA诱导开启纳米机器人,该构建方式未见报道,为功能化DNA纳米机器人理性设计提供了新思路,为荧光成像技术提供了新工具；将该多功能纳米机器人用于肿瘤细胞的成像和抑制比较新颖。(The invention belongs to the technical field of genetic engineering, and discloses an application of a tumor marker microRNA induced open type DNA nano-robot in tumor cells and a construction method thereof. The tumor marker microRNA is used for inducing and starting the nano-robot, the construction mode is not reported, a new thought is provided for the rational design of the functionalized DNA nano-robot, and a new tool is provided for the fluorescence imaging technology; the multifunctional nano robot is used for imaging and inhibiting tumor cells and is novel.)

microRNA诱导开启型DNA荧光纳米机器人在肿瘤中的应用及 其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种microRNA诱导开启型DNA荧光纳米机器人构建方法及其在肿瘤细胞诊疗一体化中的应用。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

19世纪五十年代，J.D.Watson和F.H.C.Crick在Nature上公开了DNA的双螺旋结构模型，并暗示DNA就是传承生命的遗传模板。1983年，Seeman首次利用DNA构建了核酸纳米结构，表明DNA不仅承载了生命的重要遗传信息，而且还可作为构建纳米材料的元件，从而一门新兴科学——DNA纳米技术产生了(Seeman，2010)。DNA纳米机器人是其中发展最为迅速的方向之一，它是指利用DNA准确的互补配对功能，在特定形式的能量驱动下通过改变碱基排列顺序进而可控地改变DNA的构象，并做出某种机械运动实现能量转移的纳米装置(樊春海和刘冬生，2011)。众所周知，DNA包含A、T、C、G四种碱基种类，赋予了DNA纳米机器人结构多样性；同时由于DNA碱基排列顺序可变、设计灵活，使其设计上具有可编程性；加之DNA特有的碱基互补配对原则，使其具有高度地运动可控性。DNA纳米机器人可以像真正的开关一样捕获、保存和释放目标分子，实现“机器”的功能。目前，结构各异的DNA纳米机器人相继被构建并在许多领域，如药物运输(Bhatia et al.,2011；Douglas et al.,2012；Lee etal.,2012；Amir et al.,2014；Chen et al.2017；Li et al.,2018)、生物成像(Bhatia etal.,2011；Modi et al.,2013；Jungmann et al.,2014；You et al.,2017)和生物传感(Torelli et al.,2014，2018；He et al.,2018)等发挥重要作用，具有十分广阔的应用前景。

目前技术方案：

目前构建纳米机器人的方法主要是设计多条线性DNA序列，利用碱基互补原则，通过自组装方式结合成DNA纳米机器人。如果需要对纳米机器人进行表征、示踪或成像，则需对其DNA骨架进行荧光基团标记。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)目前文献报道的DNA纳米机器人的驱动元件，如DNA，不能循环使用，限制了其使用效率；

(2)目前文献报道的DNA纳米机器人的表征、示踪及成像等功能的实现所需的荧光信号需要对其DNA骨架进行荧光基团标记，但价格昂贵，限制了其广泛应用；

(3)目前文献报道的DNA纳米机器人的功能较为单一，限制了其广泛应用。

解决上述技术问题的难度在于：

如何设计一种新型纳米机器人，使得其开启运行受驱动元件得调控；如何设计一种新型荧光纳米机器人，使得其荧光信号地获得无需标记修饰，且荧光信号得开启和增强受驱动元件得调控；如何设计一种新型荧光纳米机器人，使得其具有多功能。综上，荧光纳米机器人构建原理及功能应用的创新性设计是解决上述技术问题的难点。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种microRNA诱导开启型DNA荧光纳米机器人在肿瘤细胞中的应用及其构建方法。

本发明是这样实现的，提供一种microRNA诱导开启型DNA荧光纳米机器人在肿瘤细胞中的应用，将所述DNA荧光纳米机器人应用在肿瘤细胞成像和抑制中，纳米机器人与肿瘤细胞共孵育，可使肿瘤细胞呈现显著荧光；延长孵育时间，肿瘤细胞可被显著抑制。

本发明还需构建肿瘤标志物microRNA诱导开启型DNA荧光纳米机器人，其构建方法包括：

选取肿瘤标志物microRNA-195为目标物，并将选取的肿瘤标志物microRNA-195通过软件模拟，设计三个不同序列的发卡结构DNA，只在肿瘤标志物microRNA-195存在的情况下，通过链置换反应依次打开，相互结合形成稳定的“Y型”结构，并置换目标DNA使“Y型”结构循环使用。

进一步，构建一种miR-195诱导开启型DNA荧光纳米机器人，其构建方法包括：

选取肿瘤细胞，并将选取的肿瘤细胞通过软件模拟，设计三个不同序列的发卡结构DNA，合成金属纳米簇的双链模板DNA理性设计进入发卡结构DNA中，只在miR-195存在的情况下形成稳定的“Y型”结构，并置换目标DNA使其循环使用；金属离子在还原剂的作用下，以“Y型”结构为模板，形成金属纳米簇，呈现荧光；并置换目标DNA使其循环使用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

(1)本发明首次将DNA荧光纳米机器人用于肿瘤细胞的成像和抑制。该多功能纳米机器人的构建比较新颖，为肿瘤细胞的诊疗一体化提供了新思路。

(2)本发明构建了一种新型免标记、肿瘤标志物诱导开启荧光纳米机器人，提高了纳米机器人的工作效率，实现了荧光免标记，为功能化DNA纳米机器人构建提供新思路，为荧光成像技术提供新工具；

(3)本发明首次设计了一个miR-195驱动开启型DNA纳米机器人，只有miR-195存在的情况下，DNA纳米机器人才能驱动开启，且Trigger DNA能循环利用。

(4)本发明首次将金属纳米簇模板糅合进纳米机器人设计中，首次用无酶链置换反应介导以DNA为模板原位合成铜纳米簇，构建新型DNA荧光纳米机器人，实现免标记、无酶、免修饰及荧光信号诱导性级联增强的功能。该方法拓展了功能化DNA纳米机器人的应用，为荧光成像技术提供了新工具；

(5)本发明开发新型免标记、免修饰荧光DNA纳米机器人，实现目标物诱导开启、无酶介导及荧光信号诱导性级联增强的目标，可为功能化DNA纳米机器人的理性设计提供新思路，为荧光成像技术提供新工具，对于创新和发展具有诊疗一体化功能的DNA纳米机器人具有重要科学意义。

附图说明

图1是本发明实施例提供的miR-195诱导开启型DNA荧光纳米机器人构建方法原理图。

图2是本发明实施例提供的DNA纳米机器人的荧光光谱鉴定图。

图3是本发明实施例提供的基于DNA纳米机器人的肿瘤细胞成像鉴定图。

图4是本发明实施例提供的基于DNA荧光纳米机器人的抑制肿瘤细胞鉴定图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

目前文献报道的DNA纳米机器人的驱动元件，如DNA，不能循环使用，限制了其使用效率；DNA纳米机器人表征、示踪及成像等功能的实现所需的荧光信号需要对其DNA骨架进行荧光基团标记，价格昂贵，限制了其广泛应用。DNA纳米机器人的功能较为单一，限制了其广泛应用。

下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

本发明实施例提供的新型荧光纳米机器人的构建方法，为miR-195诱导开启型荧光DNA纳米机器人的构建；

(1)荧光DNA纳米机器人的理性设计：

选取肿瘤标志物microRNA-195(miR-195，SEQ ID NO：1UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC)为目标物，通过理性设计并借助DNAMAN软件模拟，一种无酶、免标记、免修饰的DNA纳米机器人的构建原理见图1。在本系统中，一个创新性设计得捕获探针复合物，包括miR-195互补序列(SEQ ID NO：2TCATACGTTCATACTCGCCAATATTTCTGTGCTGCTA)和部分互补的诱导序列(Trigger DNA，SEQ ID NO：3CACAGAAATATTGATGAACGTATGA)被用作miR-195的识别探针。发卡A(Hairpin A，SEQ ID NO：4AATATTGATGAACGTATGAGCGCTCATACGTTTCATACGTTCATCAATATTTC TGTG)、发卡B(Hairpin B，SEQ ID NO：5GTATGAGCGCTCATACGTTCATCACAGAAATATTAACGTATGAGCGCTCATA CGTTCAT)、发卡C(Hairpin C，SEQ ID NO：6CGTTCATCACAGAAATATTGATGAACGTATGAAATATTTCTGTGATGAAC GTATGAGCG)分别包含CuNPs模板的部分序列，序列信息见Table1。更重要的是，发卡A、B、C被创新性地设计成发卡结构，以锁住部分CuNPs合成模板，并且在3′端具有突出末端，作为立足点，且只有与特异性序列相结合时，才能启动链置换反应来打开发卡结构。在只有miR-195存在时，它特异性地结合miR-195互补序列，释放出TriggerDNA，继而结合发卡A的立足点，促发第一轮链迁移，打开发卡A，发卡A的5'端随即结合发卡B的立足点，启动第二轮链迁移，打开发卡B；然后，发卡B的5'端结合发卡C的立足点，启动第三轮链迁移，打开发卡C；随后，发卡C的5'端结合发卡A的3'端，形成稳定的“Y型”DNA结构ABC，同时，置换出Trigger DNA，继而诱发新一轮的链迁移，实现Trigger DNA的循环利用。此时，形成的“Y型”DNA中含有完整的CuNPs模板。最终，通过抗坏血酸钠(Ascorbate)的还原作用，Cu²⁺被还原成Cu⁰，后者以形成的“Y型”DNA为模板，生成CuNPs，产生显著增强的荧光信号，实现miR-195诱导开启型DNA荧光纳米机器人的构建。

表1 使用的寡核苷酸序列

(2)荧光DNA纳米机器人荧光光谱分析：

使用荧光分光光度计F-7100(Hitachi)，在室温条件下，在300-400nm范围内记录实验样品的荧光强度，寻找最大激发波长(λex)；在室温条件下，在500-700nm范围内记录上述实验样品的荧光强度，寻找最大发射波长(λem)。每组样品重复测定3次。

结果如图2所示，构建的DNA纳米机器人的最大激发波长为345nm，最大发射波长为605nm。

(3)基于DNA荧光纳米机器人的肿瘤细胞成像：

将上述构建成功的DNA荧光纳米机器人与人卵巢癌细胞A2780共孵育，使用共聚焦荧光显微镜，观察纳米机器人的荧光成像能力。

结果如图3所示，A2780呈现显著荧光增强，表明构建的DNA纳米机器人对肿瘤细胞具有成像功能。

(4)基于DNA荧光纳米机器人的肿瘤细胞抑制：

将上述构建成功的DNA荧光纳米机器人与人卵巢癌细胞A2780共孵育，使用CCK-8实验，观察纳米机器人的肿瘤细胞抑制能力。

结果如图4所示，随着孵育时间的延长，A2780生存率显著下降，表明构建的DNA纳米机器人对肿瘤细胞具有抑制功能。

下面结合效果对本发明作进一步描述。

1)miR-195诱导开启型DNA纳米机器人的制备方法，该方法包括三个不同序列的发卡结构DNA，使其能只在目标miR-195存在的情况下，通过链置换反应依次打开，继而相互结合形成稳定的“Y型”结构，并置换目标DNA使其循环使用；

2)miR-195诱导开启型荧光DNA纳米机器人的制备方法，该方法包括三个不同序列的发卡结构DNA，并将合成金属纳米簇的双链模板DNA理性设计进入发卡结构DNA中，使其能够只在目标miR-195存在的情况下形成“Y型”结构，金属离子在还原剂的作用下，以此结构为模板，形成金属纳米簇，继而呈现荧光。

3)基于荧光DNA纳米机器人的肿瘤细胞成像和抑制方法，该方法是将构建成功的纳米机器人与肿瘤细胞共孵育，可使肿瘤细胞呈现显著荧光；延长孵育时间，肿瘤细胞可被显著抑制，从而实现对肿瘤诊疗一体化的目的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。