阅读说明：本技术 一种降低乳糖含量的牛奶制作方法 (Milk production method capable of reducing lactose content ) 是由 刘羿羿 吴耀 张东 荆文魁 张立 苏小虎 张焱如 李璐 王申元 周欢敏 曹俊伟 于 2018-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种降低乳糖含量的牛奶制作方法,属于基因工程技术领域。本发明利用了耐热的硫矿硫化叶菌的嗜热菌糖苷酶基因(LacS)可以耐受80℃以上高温的特性,通过乳腺生物反应器生产外源蛋白的技术将该基因序列进行密码子优化后的lacs基因转染到牛的乳腺细胞进行特异性的表达,使生产出的牛乳含有乳糖分解酶,经常规加热消毒后牛乳中的乳糖被降解,含量下降。此方法具有成本低、产量稳定、安全高效等优点,对于工业制备低乳糖牛奶具有颠覆性的意义。(The invention discloses a milk preparation method for reducing lactose content, and belongs to the technical field of genetic engineering. The invention utilizes the characteristic that thermophilic mycose glycosidase gene (LacS) of heat-resistant sulfolobus solfataricus can resist high temperature of more than 80 ℃, and the LacS gene of which the gene sequence is subjected to codon optimization is transfected into mammary gland cells of a cow to perform specific expression by a technology for producing exogenous protein by a mammary gland bioreactor, so that the produced cow milk contains lactose clastic enzyme, and lactose in the cow milk is degraded and reduced after conventional heating and sterilization. The method has the advantages of low cost, stable yield, safety, high efficiency and the like, and has subversive significance for industrially preparing the low-lactose milk.)

一种降低乳糖含量的牛奶制作方法

技术领域

本发明涉及一种降低乳糖含量的牛奶制作方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

乳糖不耐受是由于乳糖酶分泌少、不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹泻，又被称乳糖酶缺乏症。乳糖酶缺乏是广泛存在的世界性问题，远东人群发生率高，大部分人群不出现症状，但在以乳汁为主要饮食的新生儿及婴幼儿中常发生腹泻等症状。

根据Food Intolerance Network公布的调查结果，95％的亚洲人经受着乳糖不耐症的困扰。普通牛奶中乳糖含量占4.2％，而乳糖不耐症的人群因为缺乏乳糖分解酶无法完成乳糖的降解和吸收。不能降解的乳糖就会被肠道微生物作为碳化合物进行发酵产酸产气，从而导致胃肠失调，并造成有价值的蛋白质和矿物质的损失。此外，乳糖吸收不良还会影响到对牛乳中铁、锌、钙等矿物质元素的吸收。

目前降低牛奶中乳糖含量的方法主要有发酵成酸奶、过筛法或通过对原料乳进行巴士杀菌后加乳糖水解酶水解乳糖的方法。发酵方法改变了牛奶的风味，过筛法获得的牛奶主要制成奶粉，在市场上销售价格较高，而巴士杀菌后加酶的方法存在能耗高、生产效率低等问题。

动物乳腺生物反应器是利用利用乳腺特异性调控元件指导外源基因在乳腺中特异表达，以转基因动物的乳腺组织生产重组蛋白。其基本原理是应用DNA重组技术和转基因技术，将目的基因转移至尚处于原核阶段的受精卵或1-2细胞期的动物胚胎中，经胚胎移植，得到转基因乳腺表达个体，通过收集乳汁来获得目的基因表达产物。动物乳腺生物反应器是目前研究最多、应用最为广泛的动物生物反应器，备受各国科学家的关注。

乳腺生物反应器生产的外源蛋白种类广泛、优势明显。首先，动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性；其次，动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，该方法的目的蛋白易分离提纯、成本低廉、产量高。

利用乳腺生物反应器大量生产蛋白质的方法应用很普遍，但由于载体较大会降低转染效率，基因整合到基因组上的效率较低，因此目前还没有利用奶牛乳腺生物反应器生产乳糖分解酶的研究出现。

发明内容

本发明的目的是提供一种降低乳糖含量牛奶的制作方法，是将外源基因转染到牛的乳腺细胞进行特异性的表达，使生产出的牛乳含有乳糖分解酶，具体包括以下步骤：

(2)转染：将含外源基因的特异性表达载体转入来源于奶牛胎儿皮肤组织的细胞系；

(3)筛选转染成功的细胞系，扩大培养；

(4)利用克隆方法生产携带外源基因的奶牛，产乳；

(5)75-100℃下加热牛乳。

所述外源基因是对来自硫矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus，P2)的嗜热菌糖苷酶基因(LacS)序列进行密码子优化得到的lacs基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述lacs基因导入动物体后特异表达部位在乳腺。

在本发明的一种实施方式中，所述特异性表达载体是以pMD19-T载体框架表达lacs基因，该特异性表达载体上还包括β-酪蛋白启动子、TALEN酶切识别位点及其微同源位点。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的细胞系为来源于奶牛胎儿皮肤组织的可以连续传代15代，细胞周期和核型分析正常，且活力良好的成纤维细胞系。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的转染，电压设置为175-200V。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)是在75-100℃下加热牛乳。

本发明另一个目的是提供一种以pMD19-T载体为框架，目的基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的lacs基因的基因表达载体及其在乳制品制备中的应用。

本发明利用了耐热的硫矿硫化叶菌的嗜热菌糖苷酶基因(LacS)可以耐受80℃以上高温的特性，通过乳腺生物反应器生产外源蛋白的技术将该基因序列进行密码子优化后的lacs基因转染到牛的乳腺细胞进行特异性的表达，使生产出的牛乳含有乳糖分解酶，经常规加热消毒后牛乳中的乳糖被降解，含量下降。此方法具有成本低、产量稳定、安全高效等优点，对于工业制备低乳糖牛奶具有颠覆性的意义。

附图说明

图1：TALEN质粒图谱(携带CMV启动子，Sp6体外转录启动子)；

图2：lacs基因特异性表达载体框架；

图3：产物1～5的PCR鉴定电泳图；模板为扩大培养后的细胞，目的产物为lacs基因的部分片段；鉴定引物P3、P4；目的片段长度约560bp；M:100bp ladder marker；

图4：产物6～11的PCR鉴定电泳图；模板为扩大培养后的细胞，目的产物为lacs基因和细胞基因组***位点下游部分序列；鉴定引物P3、P2；目的片段长度约900bp；M:100bpladder marker。

具体实施方式

实施例1：TALENs及lacs基因载体构建

(1)合成lacs基因序列

首先利用PCR技术扩增硫矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus，P2)的嗜热菌糖苷酶基因(LacS)(NCBI编号：AF133096)。

PCR引物：P1序列如SEQ ID NO.2所示；P2序列如SEQ ID NO.3所示，预期产物为长度1490bp。测序后根据牛的密码子偏好优化密码子序列，人工合成lacs序列，如SEQ IDNO.1所示。

(2)构建TALEN载体

TALEN载体构建按照试剂盒说明书进行，拼接的TALEN识别DNA长度为11-18bp。采用T7E1酶切法检测TALEN质粒活性，TALEN载体选用携带哺乳动物细胞通用的CMV启动子以及Sp6体外转录启动子，如图1所示，可以用于体外mRNA转录。

采用在线网站http://www.e-talen.org/E-TALEN设计***位点，序列如SEQ IDNO.4所示。序列的第18-33位为间隔序列。

(3)lacs基因载体构建

在lacs基因的5'端添加β-酪蛋白启动子，得到一个长约4.4kb的lacs-β-酪蛋白启动子片段。以该片段为模板进行PCR扩增，引物两端分别添加TALEN识别位点和微同源序列。微同源区域为8bp。lacs基因在牛基因组上的***位点选择β-酪蛋白第二内含子区域，在lacs基因整合进牛基因组的过程中，可以实现一对TALEN同时切割基因组靶位点与lacs基因片段上的识别位点，剔除克隆载体骨架，以实现外源基因的无痕敲入。

PCR引物：lacs PF序列如SEQ ID NO.5所示；lacs PR序列如SEQ ID NO.6所示。其中lacs PF和lacs PR序列的第1-18位为TALEN识别序列，第27-34位为微同源区域。

PCR体系：GXL polymerase：1μL；5×GXL Buffer：10μL；dNTPs：4μL；上下游引物各1μL；模板质粒(30ng/μL)：1μL；ddH2O：补至50μL。

PCR反应条件：94℃5min；94℃1min，61℃1min，72℃5min；72℃10min；35个循环。

对PCR产物进行测序分析，证明构建得到的目的片段包括lacs基因、β-酪蛋白启动子、TALEN识别位点和微同源序列，约为4.5kb，连入pMD19-T simple载体，得到特异性表达载体，如图2所示。

实施例2：筛选lacs细胞系

采集荷斯坦奶牛60d胎儿皮肤组织，PCR鉴定留取性别为母牛的胎儿皮肤，利用贴壁培养法培养15个成纤维细胞系，选用可以连续传代15代、细胞周期和核型分析正常且活力良好的细胞系。

利用NEPA21高效基因转染系统(NEPA，日本)，利用实施例1构建得到的TALEN载体和特异性表达载体进行TALENs及lacs基因载体共转染。选择第1代成纤维细胞，接种2天后细胞90％汇合，0.25％胰酶消化细胞，终止消化，离心后弃掉上清液，加1mL opti-MEM清洗2次，并计数。加适量opti-MEM重悬细胞，调节细胞终浓度为1×10⁶/90μL。取90μL细胞悬液，加入质粒混合物包含TALEN单体各4μg，lacs基因载体2μg，轻轻吹打混匀。移入电转杯，注意别出现气泡，放入电转仪后，测定电阻，在30-55kΩ之间，如在此范围外，检测混合液或电转杯是否有问题。设置转染电压175V到200V之间，脉冲时间5ms，脉冲次数2次，脉冲间隔50ms，衰减10％。基因导入电压为20V，脉冲时间50ms，脉冲次数5次，脉冲间隔50ms，衰减40％。

同时以含有荧光片段的pEGFP-N1质粒作为对照以确定转染效率，将90μL细胞悬液细胞和10μL 1μg/μL的pEGFP-N1质粒混合液以上述方法同时进行转染。转染后，迅速将转染完的细胞移入预先准备的添加2ml完全培养液的6孔板中，轻轻混匀，置于37℃，100％湿度，5％CO₂培养箱培养。次日换液，48h后荧光观察，发现175V电压转染效率与200V电压转染效率相同，但175V的电压室细胞死亡率较低。

转染2d后消化收集细胞，制备成细胞悬液后采用口吸管法将单个细胞接种于96孔板中，加入完全培养液200μL/孔，3-5天后细胞90％汇合时将细胞接种到24孔板中，待90％汇合后再接种到6孔板中，这样就达到了单个细胞扩大培养的目的，待6孔板细胞长满，消化收集细胞，一半进行冻存，一半用PCR方法鉴定。PCR引物信息如下：

P3如SEQ ID NO.7所示；P4如SEQ ID NO.8所示。对PCR产物进行电泳检测，得到的条带如图3所示，预期目的片段长约560bp。所得产物中条带约560bp且条带单一、清晰、明亮的选为阳性细胞株。

取第一次筛选出的阳性细胞株进行再次鉴定，选取lacs基因部分序列与细胞基因组***位点下游部分序列作为目的片段，只有正确***的细胞株才可以扩增出片段。

PCR引物信息如下：

P3如SEQ ID NO.7所示；P2如SEQ ID NO.9所示。对PCR产物进行电泳检测，得到的条带如图4所示，预期目的片段长约900bp。所得产物中条带约900bp且条带单一、清晰、明亮的选为阳性细胞株。

鉴定后的阳性样品进行测序分析，将测序后的阳性细胞进行扩大培养用于核移植实验。

实施例3：利用克隆方法生产携带lacs基因的奶牛

利用核移植方法生产重构胚胎，体外激活发育到桑椹胚和囊胚阶段，将核移植重组胚胎用非手术法移植到同步发情的***母牛子宫内。三个情期不发情的***母牛做B超检查，确定怀孕，足月后密切注意***母牛情况，如果发生胎儿过大或羊水指标差等情况则采用剖腹产方法，迅速取出胎儿，助产过程在室内进行，室温控制在20℃-25℃之间，严格防止犊牛感冒，清理娩出后犊牛呼吸道，擦净体表，检测体征，母乳喂养，犊牛出生一个星期后可以适量进行室外活动。

实施例4：牛乳中乳糖含量的测定

采集出生犊牛的羊膜细胞，提取基因组DNA，利用PCR技术鉴定是否存在lacs基因。待携带目标基因的奶牛成年配种产犊后，采集牛奶。

(1)利用PCR技术鉴定后，送测。测序结果表明生产出的牛奶中包含如SEQ IDNO.10所示的序列。虽然采用的lacs基因载体框架中的pMD19-T克隆载体和TALEN骨架载体都包含氨苄霉素抗性基因，但在最后得到的阳性细胞系基因组中只含有目的DNA片段，并无抗性基因引入，提高了安全性。

(2)用碘量法标定加热前后牛乳中的乳糖含量

取1mL待测乳(约1g)，加入蛋白质沉淀剂10mL定容至250mL，静置30min，过滤沉淀后，取上清液，利用透析袋多次透析去除滤液样品中的葡萄糖。

取25ml处理好的待测样品移入碘量瓶中，加入50μL 0.1％甲基橙，20mL 0.1M碘液，7.5mL 0.5mol/L NaOH，摇匀后在阴暗处静置30min；加入8mL 0.5mol/L HCl，摇匀后用硫代硫酸钠标定液滴定至黄色后加入60μL 1％淀粉指示剂摇匀，继续滴定至淡粉色，记录消耗硫代硫酸钠体积。同时做空白样品滴定，每组滴定样品做三个平行。

乳糖含量(％)＝[(滴定空白消耗硫代硫酸钠体积-滴定样品消耗硫代硫酸钠体积)×硫代硫酸钠摩尔浓度×0.18]×100÷0.1

表1：本发明所得牛乳与普通牛乳80℃加热前后的乳糖含量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古农业大学

内蒙古高原基因研发中心

<120> 一种降低乳糖含量的牛奶制作方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 1018

<212> DNA

<213> 人工合成

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