阅读说明：本技术 一种纤维素完全磷酸解产肌醇的方法 (Method for producing inositol by complete phosphorization of cellulose ) 是由 游淳 孟冬冬 于 2018-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及肌醇的酶催化制备领域,具体的说是一种纤维素完全磷酸解生产肌醇的酶法制备方法。本发明所公开的肌醇的制备方法是以预处理过的纤维素(主要成分为纤维多糖)为酶催化反应的底物；采用纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、聚磷酸葡萄糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶催化纤维多糖完全磷酸解转化为肌醇。通过优化多酶反应过程,分阶段控制反应过程温度,显著提升底物的转化效率和肌醇的产率,缩短了反应时间。该技术方法实现了纤维素底物的完全磷酸解,还可以用于其他体外多酶反应体系催化纤维多糖产氢气、产电或生产其他生物基化学品。(The invention relates to the field of enzyme-catalyzed preparation of inositol, in particular to an enzymatic preparation method for producing inositol by completely phosphorylating cellulose. The preparation method of the inositol disclosed by the invention takes pretreated cellulose (the main component is cellopolysaccharide) as a substrate of enzyme catalytic reaction; the complete phosphorylation conversion of the fibrous polysaccharide into inositol is catalyzed by fibrous polysaccharide phosphorylase, cellobiose phosphorylase, polyphosphoric acid glucokinase, glucose phosphoglucomutase, inositol-1-phosphate synthase and inositol monophosphate enzyme. By optimizing the multienzyme reaction process and controlling the temperature of the reaction process in stages, the conversion efficiency of the substrate and the yield of inositol are obviously improved, and the reaction time is shortened. The technical method realizes the complete phosphorolysis of the cellulose substrate, and can also be used for catalyzing fibrous polysaccharide to produce hydrogen and electricity or produce other bio-based chemicals by other in-vitro multi-enzyme reaction systems.)

一种纤维素完全磷酸解产肌醇的方法

技术领域

本发明涉及肌醇的制备方法，具体涉及通过体外多酶体系催化纤维多糖完全磷酸解生产肌醇的方法，属于肌醇的酶催化制备领域。

背景技术

肌醇属于水溶性维生素B族，是人、动物与微生物生长的必需物质，广泛应用于食品、饲料、医药等行业。目前肌醇的主要生产方法是高温加压水解植酸，该方法能耗高、对工艺设备材质要求严格，环境污染严重。近年来，利用体外多酶反应体系催化淀粉生产肌醇(You,C.,et al.(2017).An in vitro synthetic biology platform for theindustrial biomanufacturing of myo-inositol from starch.Biotechnol.Bioeng.114(8):1855-1864)作为一种低污染、高产率的新方法，逐渐得到大家的关注。

纤维素是地球上最丰富的可再生资源，其主要组分是β-1,4糖苷键连接的葡聚糖。与粮食作物来源的淀粉相比，纤维素的高效利用具有更重要的潜在价值。在过去几十年的研究中，预处理后的纤维素通常通过纤维素酶(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶等)的作用而水解成葡萄糖，葡萄糖经微生物发酵生产化学品。纤维素磷酸解是另外一种纤维素降解方式，即预处理后的纤维素在无机磷存在的基础上，经纤维多糖磷酸化酶催化生成葡萄糖1-磷酸，直至纤维多糖被磷酸解为纤维二糖；纤维二糖在无机磷存在下，经纤维二糖磷酸化酶催化生成葡萄糖和葡萄糖1-磷酸；葡萄糖在聚磷酸盐存在下，经聚磷酸葡萄糖激酶催化生成葡萄糖6-磷酸。纤维素磷酸解可以将葡聚糖链完全磷酸解为葡萄糖磷酸盐，而且，葡聚糖链中β-1,4糖苷键的能量转化储存在葡萄糖磷酸盐中。因此，与纤维素酶水解相比较，纤维素磷酸解具有更大的能量优势是一种优于纤维素酶水解的可持续的纤维素高值转化方式。

目前，以纤维素为底物制备肌醇虽已有报道(中国专利申请号：201510184621.4)，但其转化率远远低于最大理论转化率100％，同时，催化反应时间也过长，通常要72小时左右。这两方面的缺陷会导致肌醇生产成本增加，同时低转化率还会导致副产物含量高，肌醇的分离纯化困难，从而进一步增加成本，不能满足工业化要求。

因此，亟需开发一种以非粮生物质资源—纤维素为底物，采用完全磷酸解方法，低成本、高转化率制备肌醇的方法。

发明内容

本发明涉及一种纤维素完全磷酸解生产肌醇的方法。该方法以纤维素为底物，通过构建体外多酶催化反应体系并进行体系优化，将纤维素完全磷酸解，以实现纤维素低成本、高转化率的合成肌醇。同时，该方法具有原料可再生、来源丰富、廉价、低污染、环境友好等优点。

本发明通过如下技术方案来实现：

本发明提供了一种纤维素完全磷酸解生产肌醇的方法，包括：

纤维素通过预处理，得到纤维多糖。

以纤维多糖为底物，加入纤维多糖磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase，EC2.4.1.49)、葡萄糖磷酸变位酶(phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2)、肌醇-1-磷酸合成酶(inositol 1-phosphate synthase，EC5.5.1.4)和肌醇单磷酸酶(inositolmonophosphatase，EC 3.1.3.25)，进行多酶催化反应。

根据本发明，酸水解法、酶水解法、物理法等预处理方法均可用于本发明。优选酸水解法作为预处理方法。

根据本发明，聚合度低于100的纤维多糖均可用于本发明。优选地，所述聚合度低于50，更优选为低于20，最优选为3-7。

根据本发明，优选地，多酶催化反应的温度为10-95℃，进一步优选为20-80℃，更优选为30-60℃，最优选为55℃。

根据本发明，优选地，多酶催化反应的时间为0.5-150小时，进一步优选为1-60小时，更优选为6-48小时，最优选为24-36小时。

根据本发明，优选地，多酶催化反应中纤维多糖的浓度为1-200g/L，进一步优选为5-50g/L，更优选为8-20g/L，最优选为10g/L。

根据本发明，优选地，多酶催化反应中纤维多糖磷酸化酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL。

根据本发明，优选地，多酶催化反应中葡萄糖磷酸变位酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL。

根据本发明，优选地，多酶催化反应中肌醇-1-磷酸合成酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL。

根据本发明，优选地，多酶催化反应中肌醇单磷酸酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL。

在优选的实施方案中，所述多酶催化反应中还包括加入纤维二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20)，用于催化纤维二糖和磷酸盐生成葡萄糖1-磷酸和葡萄糖。

优选地，在上述多酶催化反应进行一段时间后再加入纤维二糖磷酸化酶。

优选地，多酶催化反应中纤维二糖磷酸化酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL。

优选地，多酶催化反应在10-95℃反应0.25-10小时，进一步优选在20-80℃反应0.5-5小时，更优选在30-60℃反应1-3小时，最优选在55℃反应2小时时加入纤维二糖磷酸化酶。优选地，在多酶催化反应中加入纤维二糖磷酸化酶后，继续在10-95℃反应0.25-50小时，进一步优选在20-80℃反应5-30小时，更优选在30-60℃反应10-25小时，最优选在55℃反应12-24小时。

在优选的实施方案中，所述多酶催化反应进一步包括加入聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，EC 2.7.1.63)和聚磷酸盐，用于将副产物葡萄糖磷酸化生成葡萄糖6-磷酸。

优选地，多酶催化反应中聚磷酸葡萄糖激酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL。

优选地，多酶催化反应中聚磷酸盐的用量为0.1-50mM，进一步优选为1-30mM，更优选为5-20mM，最优选为10mM。

优选地，多酶催化反应在10-95℃反应0.25-15小时，进一步优选在20-80℃反应0.5-10小时，更优选在30-60℃反应2-8小时，最优选在55℃反应6小时时加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐。

优选地，多酶催化反应加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸盐后，继续在10-95℃反应0.25-50小时，进一步优选在20-80℃反应5-30小时，更优选在30-60℃反应10-25小时，最优选在55℃反应12-24小时。

根据本发明，优选地，多酶催化反应中还加入有缓冲液、磷酸盐、镁盐、还原剂。

本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液例如柠檬酸钠缓冲液等，优选地，缓冲液为HEPES缓冲液。优选地，缓冲液的pH为5.0-8.5，更优选为6.0-8，最优选为7.5。优选地，反应体系中缓冲液的浓度为10-500mM，进一步优选为20-150mM，更优选为50-120mM，最优选为100mM。

本领域技术人员可以理解，各种磷酸盐均可用于本发明，例如磷酸钾、磷酸钠等，优选地，磷酸盐为磷酸钾。优选地，反应体系中磷酸盐的浓度为1-50mM，进一步优选为2-30mM，更优选为5-25mM，最优选为20mM。

本领域技术人员可以理解，各种镁盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁等，优选地，镁盐为氯化镁。优选地，反应体系中镁盐的浓度为1-20mM，进一步优选为2-15mM，更优选为3-10mM，最优选为5mM。

优选地，还原剂为二硫苏糖醇。优选地，多酶催化反应中二硫苏糖醇的浓度为1-20mM，进一步优选为2-15mM，更优选为3-10mM，最优选为5mM。

为了进一步提高肌醇的产率，在优选的实施方案中，所述多酶催化反应在反应一段时间后，还补充加入镁离子。

优选地，在镁离子浓度低于0.1-5mM时补充加入镁离子，进一步优选地，在镁离子浓度低于0.2-3mM时补充加入镁离子，更优选为在镁离子浓度低于0.5-1.5mM时补充加入镁离子，最优选为在镁离子浓度低于1mM时补充加入镁离子。

优选地，补充加入镁离子的浓度为1-30mM，进一步优选为5-20mM，最优选为15mM。

为了缩短反应时间并提高肌醇的产率，在优选的实施方案中，所述多酶催化反应在反应一段时间后，提高催化反应的反应温度。优选地，在反应进行0.5-20小时后提高多酶催化反应的反应温度，进一步优选地，在反应进行1-15小时后提高多酶催化反应的反应温度，更优选地，在反应进行5-10小时后提高多酶催化反应的反应温度，最优选地，在反应进行8小时后提高多酶催化反应的反应温度。

优选地，反应一段时间后提高多酶催化反应的反应温度至60-100℃，进一步优选65-80℃，最优选为70℃。

本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

1.本发明采用纤维多糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶和聚磷酸葡萄糖激酶构建体外多酶反应体系，通过精确控制酶的加入顺序与加入时间，将纤维多糖完全磷酸解为葡萄糖磷酸盐，实现纤维素的完全磷酸解；

2.本发明首次通过控制多酶催化反应的反应温度、镁盐的含量，将纤维素转化为肌醇，相较于恒定反应温度，通过提高后期反应体系的温度，一方面缩短反应时间，另一方面提高肌醇的转化率。同时，本发明的底物为纤维素，具有廉价、来源丰富、可再生等优点，可实现肌醇的廉价合成与生产；

3.本发明中的方法具有产物转化率高(接近理论值100％)、反应时间短、生产成本低、环境友好等一系列优点，有利于肌醇的工业化生产。

4.此外，本发明所述的纤维素完全磷酸解的方法，还可以应用到包括产氢气、产电或生产其他生物基化学品的体外多酶反应体系中。

附图说明

图1为纤维素完全磷酸解生成肌醇及其他生物能源的体外多酶催化途径示意图。其中，CDP为纤维多糖磷酸化酶、CBP为纤维二糖磷酸化酶、PPGK为聚磷酸葡萄糖激酶、PGM为葡萄糖磷酸变位酶、IPS为肌醇-1-磷酸合成酶、IMP为肌醇单磷酸酶；P_i为无机磷、(P_i)_n和(P_i)_n-1为聚磷酸钠。

图2为CDP、PGM、IPS和IMP构成的体外多酶体系催化纤维多糖生成肌醇情况。其中，图2A为SDS-PAGE检测4个酶，M为Marker，1为CDP、2为PGM、3为IPS、4为IMP；图2B为55℃下，4个酶催化纤维多糖产肌醇的时间进程曲线。

图3为CDP、CBP、PGM、IPS和IMP构成的体外多酶体系催化纤维多糖生成肌醇情况。其中，图3A为SDS-PAGE检测CBP，M为Marker；图3B为55℃下，5个酶催化纤维多糖产肌醇的时间进程曲线。反应进行2小时，添加CBP。

图4为CDP、CBP、PPGK、PGM、IPS和IMP构成的体外多酶体系催化纤维多糖生成肌醇情况。其中，图4A为SDS-PAGE检测PPGK，M为Marker；图4B为55℃下，6个酶催化纤维多糖产肌醇的时间进程曲线。反应进行6小时，添加PPGK和聚磷酸钠。

图5为在55℃下，反应进行6小时，添加PPGK、聚磷酸钠和氯化镁，CDP、CBP、PPGK、PGM、IPS和IMP构成的体外多酶体系催化纤维多糖产肌醇的时间进程曲线。

图6为反应进行8小时，反应温度由55℃提高至70℃，CDP、CBP、PPGK、PGM、IPS和IMP构成的体外多酶体系催化纤维多糖产肌醇的时间进程曲线。其中，曲线a，反应6小时，向反应体系添加PPGK、聚磷酸钠和氯化镁；曲线b，反应6小时，向反应体系添加PPGK和聚磷酸钠。

图7为CDP、CBP、PPGK、PGM、IPS和IMP构成的体外多酶体系催化50g/L纤维多糖或玉米秸秆水解液生产肌醇情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实验材料

微晶纤维素Avicel PH-105，FMC(Philadelphia,PA,USA)产品；

pET20b载体，Novagen，Madison，WI；

大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；

本发明中的所有酶(除肌醇单磷酸酶和聚磷酸葡萄糖激酶)均能在Sigma公司购买得到，所有酶也都可以按照基因工程方法通过原核表达获得。

实施例1利用纤维多糖磷酸化酶催化纤维素生产肌醇

通过体外多酶催化体系将纤维素完全磷酸解转化为肌醇或产氢气、产电的催化途径见图1。其中催化纤维多糖产肌醇途径涉及的关键酶包括：(1)纤维多糖磷酸化酶(CDP，EC2.4.1.49)，用于从纤维多糖上释放葡萄糖1-磷酸，直到纤维二糖；(2)纤维二糖磷酸化酶(CBP，EC 2.4.1.20)，用于将纤维二糖磷酸解为葡萄糖1-磷酸和葡萄糖；(3)聚磷酸葡萄糖激酶(PPGK，EC 2.7.1.63)用于将葡萄糖磷酸化为葡萄糖6-磷酸；(4)葡萄糖磷酸变位酶(PGM，EC 5.4.2.2)，用于将葡萄糖1-磷酸异构化为葡萄糖6-磷酸；(5)肌醇-1-磷酸合成酶(IPS，EC 5.5.1.4)，用于将葡萄糖6-磷酸转化为肌醇1-磷酸；(6)肌醇单磷酸酶(IMP，EC3.1.3.25)，用于将肌醇1-磷酸脱去磷酸基团生成肌醇。

在本发明中，纤维素完全磷酸解生成葡萄糖6-磷酸，可以进入其他体外多酶反应体系，生成氢气(Kim et al.,(2017)Advanced water splitting for green hydrogengas production through complete oxidation of starch by in vitro metabolicengineering.Metab.Eng.44:246-252)、产电(Zhu,Z.,et al.,(2017)In vitro metabolicengineering of bioelectricity generation by the complete oxidation ofglucose.Metab.Eng.39:110-116)或生产其他化学品(Wang,W.,et al.,(2017)ATP-freebiosynthesis of a high-energy phosphate metabolite fructose1,6-diphosphate byin vitro metabolic engineering.Metab.Eng.42:168-174)。

在本实施例中，微晶纤维素Avicel PH-105经过酸水解(Zhang,Y-HP.,et al.(2003).Cellodextrin preparation by mixed-acid hydrolysis and chromatographicseparation.Analytical Biochemistry.322(2):225-232)，制备成为聚合度为3-7的纤维多糖(平均聚合度4.4)，添加到多酶反应体系中进行催化反应。

在本实施例中，纤维多糖磷酸化酶来源于热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)，其基因编号为Cthe_2989；葡萄糖磷酸变位酶来源于嗜热古菌Thermococcus kodakarensis，其基因编号为TK1108；肌醇-1-磷酸合成酶来源于Archaeoglobus fulgidus，其基因编号为AF_1794；肌醇单磷酸酶来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)，其基因编号为TM1415。这些基因组DNA都可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning(You C,Zhang XZ,Zhang Y-HP.2012.Simple cloning via directtransformation of PCR product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillussubtilis.Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-5.)的方法克隆至pET载体(Novagen,Madison,WI)中，获得相应的表达载体pET21c-ctcdp、pET20b-tkpgm、pET20b-afips和pET20b-tmimp。然后，将这些质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，进行蛋白质表达与纯化，蛋白质纯化的结果如图2A所示。

本实施例所用的酶的信息如表1所示。

在一个1.0mL的反应体系中含有10g/L平均聚合度为4.4的纤维多糖，100mM的HEPES缓冲液(pH 7.5)，5mM的氯化镁，20mM的磷酸钾，5mM二硫苏糖醇，1U/mL纤维多糖磷酸化酶，1U/mL葡萄糖磷酸变位酶，2U/mL肌醇-1-磷酸合成酶、1.5U/mL肌醇单磷酸酶。在55℃进行催化反应，反应时间为24个小时。通过高效液相色谱检测反应体系产生的肌醇和纤维二糖的浓度。高效液相色谱条件为：HPX-87H色谱柱(Bio-Rad)、5mM硫酸溶液为流动相、柱温60℃，示差折光检测器。反应体系产生的葡萄糖的浓度通过葡萄糖试剂盒测定(北京普利莱基因技术有限公司，货号E1010)。

实验结果如图2B所示，肌醇的浓度随着时间逐渐增大，在12小时后达到4.64g/L，并保持恒定；纤维二糖的浓度快速增加，在2小时后达到4.61g/L，并保持恒定。因此，肌醇相对纤维多糖的质量转化率为46％。

实施例2利用纤维多糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶催化纤维素生产肌醇

纤维多糖磷酸化酶不能完全磷酸解纤维多糖生成葡萄糖1-磷酸，在反应体系中添加纤维二糖磷酸化酶能够提高底物转化率。

在本实施例中，纤维二糖磷酸化酶来源于热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)，其基因编号为Cthe_0275；该基因通过PCR获取，并通过Simple Cloning的方法克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-ctcbp。然后，将这个质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，进行蛋白质表达与纯化，蛋白质纯化的结果如图3A所示。本实施例所使用的纤维二糖磷酸化酶的基本信息如表1所示。

根据实施例1的实验结果，在反应体系中纤维二糖的浓度达到最大值时，即反应2小时，向多酶催化体系添加1U/mL纤维二糖磷酸化酶，在55℃进行催化反应，至24小时。

经高效液相色谱检测，如图3B所示，纤维二糖的浓度逐渐降低，在6小时，其浓度为0.11g/L；肌醇的浓度逐渐增加，在6小时和24小时，浓度分别为5.62g/L和5.99g/L。在24小时，葡萄糖的浓度为2.34g/L。因此，肌醇相对纤维多糖的质量转化率为60％。

实施例3体外多酶体系完全磷酸解纤维素生产肌醇

为了进一步提高肌醇的转化率，在反应体系中添加聚磷酸葡萄糖激酶(PPGK，EC2.7.1.63)和聚磷酸钠，用于将葡萄糖磷酸化生成葡萄糖6-磷酸，进而转化为肌醇。

在本实施例中，聚磷酸葡萄糖激酶来源于嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)，其基因编号为Tfu_1811；该基因通过PCR获取，并通过Simple Cloning的方法克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-tfuppgk。本实施例中所用到的聚磷酸葡萄糖激酶为经过热稳定性改造后的突变体4-1(Zhou W,Huang R,Zhu Z,Zhang Y.-H.P.J.,Coevolutionof both thermostability and activity of polyphosphate glucokinase fromThermobifida fusca YX.Appl.Environ.Microbiol.2018.doi:10.1128/AEM.01224-18)，蛋白质表达与纯化结果如图4A所示，其基本信息如表1所示。

根据实施例2的实验结果，在反应体系中葡萄糖的浓度达到最大值，即反应6小时，向多酶催化体系添加1U/mL聚磷酸葡萄糖激酶和10mM聚磷酸钠，在55℃进行催化反应，至24小时。

如图4B所示，葡萄糖浓度在8小时接近0g/L。经高效液相色谱检测，在24小时，肌醇的浓度为6.89g/L。因此，肌醇相对纤维多糖的质量转化率为69％。通过镁离子浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：BC2790)分析，反应8小时，镁离子浓度为0.38mM，远低于初始加入的镁离子浓度。

实施例4优化体外多酶反应体系，进一步提高肌醇的产率

低浓度镁离子会降低产肌醇途径中肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶的比酶活。根据实施例3的实验结果，在反应6小时，向反应体系中添加1U/mL聚磷酸葡萄糖激酶、10mM聚磷酸钠和15mM氯化镁。在55℃进行催化反应，至60小时。

如图5所示，在60小时，肌醇的浓度为9.81g/L。因此，肌醇相对纤维多糖的质量转化率为98％。

实施例5提高体外多酶反应体系温度，缩短反应时间

肌醇-1-磷酸合成酶在低于60℃时，具有非常低的比酶活(Chen,L.J.,et al.(2000)Inositol-1-phosphate synthase from Archaeoglobus fulgidus is a class IIaldolase.Biochemistry.39(40):12415-12423)，通过提高反应体系的反应温度，提高肌醇-1-磷酸合成酶的催化能力，从而缩短反应时间。在70℃下，葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇单磷酸酶的比酶活如表1所示。

根据实施例4的实验结果，反应6小时，向反应体系中添加1U/mL聚磷酸葡萄糖激酶、10mM聚磷酸钠和15mM氯化镁；在反应8小时，将多酶体系的温度升高至70℃。如图6曲线a所示，在24小时，肌醇的浓度为9.9g/L。因此，肌醇相对纤维多糖的质量转化率为99％。

反应6小时，向反应体系中添加1U/mL聚磷酸葡萄糖激酶和10mM聚磷酸钠；在反应8小时，将多酶体系的温度升高至70℃。反应12小时，反应体系中的镁离子浓度为4.6mM，与初始加入的镁离子浓度5mM相当。在24小时，肌醇的浓度为9.78g/L，如图6曲线b所示。因此，肌醇相对纤维多糖的质量转化率为98％。

实施例6利用体外多酶反应体系催化高浓度纤维素底物生产肌醇

在本实施例中，所用的底物为50g/L纤维多糖(平均聚合度4.4)或玉米秸秆水解液。气爆预处理(1兆帕、10分钟)的玉米秸秆，粉碎后过40-60目筛。根据文献(Zhang,Y-HP.,et al.(2003).Cellodextrin preparation by mixed-acid hydrolysis andchromatographic separation.Analytical Biochemistry.322(2):225-232)方法制备玉米秸秆水解液。利用硫酸、盐酸混合溶液在22℃下酸解4小时，经丙酮沉淀、真空过滤等步骤，将纤维多糖溶解到水溶液中。经氢氧化钡调节pH至7.0，制备得到玉米秸秆水解液。

根据实施例5的操作步骤，在一个反应体系中，添加pH为7.5的HEPES缓冲液的浓度为100mM，磷酸钾的浓度为50mM，氯化镁的浓度为20mM，二硫苏糖醇的浓度为5mM，纤维多糖或玉米秸秆水解液的浓度为50g/L，纤维多糖磷酸化酶的用量为5U/mL、葡萄糖磷酸变位酶的用量为5U/mL、肌醇-1-磷酸合成酶的用量为10U/mL、肌醇单磷酸酶的用量为7.5U/mL；反应体系在55℃下进行至2h，添加纤维二糖磷酸化酶的用量为5U/mL；反应体系在55℃下进行至6h，添加聚磷酸葡萄糖激酶的用量为5U/mL，添加聚磷酸钠的用量为50mM；反应体系在55℃下进行至8h，提高反应体系温度至70℃；最终以纤维多糖或玉米秸秆水解液为底物的反应体系中，肌醇的产量分别为36.3g/L和15.3g/L(图7)。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

表1本发明中所用到的酶的信息

^a纤维多糖磷酸化酶的比酶活测定在55℃下进行，以平均聚合度为4.4的纤维多糖为底物。