阅读说明：本技术 一种人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料及制备方法 (Ginsenoside Rg 1/strontium-containing calcium sulfate composite material and preparation method thereof ) 是由 李雪 朱永展 谭艳庆 谭彩霞 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料,该复合材料的原料包括人参皂苷Rg1和含锶α-半水硫酸钙,人参皂苷Rg1和含锶α-半水硫酸钙的质量比为(1-100)×10<Sup>-4</Sup>：300。相应的,本发明还提供了上述复合材料的制备方法。本发明的复合材料以人参皂苷Rg1和含锶硫酸钙进行复合形成一种可生物降解的具有生物活性掺锶硫酸钙材料。在含锶硫酸钙的基础上加入了一定含量的人参皂苷Rg1,通过细胞及动物实验均证实了人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料有促进血管化的作用,较单纯的含锶硫酸钙骨修复能力更强。(The invention discloses a ginsenoside Rg 1/strontium-containing calcium sulfate composite material, which comprises the raw materials of ginsenoside Rg1 and strontium-containing α -calcium sulfate hemihydrate, wherein the mass ratio of the ginsenoside Rg1 to the strontium-containing α -calcium sulfate hemihydrate is (1-100) multiplied by 10 ‑4 : 300. correspondingly, the invention also provides a preparation method of the composite material. The invention also relates toThe synthetic material is formed by compounding ginsenoside Rg1 and strontium-containing calcium sulfate to form a biodegradable strontium-doped calcium sulfate material with bioactivity. The ginsenoside Rg1 with a certain content is added on the basis of the strontium-containing calcium sulfate, and cell and animal experiments prove that the ginsenoside Rg 1/strontium-containing calcium sulfate composite material has the effect of promoting vascularization and has stronger bone repair capability compared with the pure strontium-containing calcium sulfate.)

一种人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料及制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料及制备方法。

背景技术

外伤导致骨折或骨缺损时，多会造成周围血管的损伤，氧气输送的障碍和周围组织的快速坏死可以在局部造成一个低氧的微环境。新生血管可以为新生的骨修复组织提供营养、氧气、生长因子、细胞因子、成骨及破骨前体细胞等，且可以将代谢废物输送出去，故新生血管对于骨修复具有重要意义。在骨折端或骨缺损这个封闭空间内的骨形成和血管化的过程称为血管化及骨化联合过程(angiogenicosteogenic coupling)，两者相辅相成。故在制备新型骨替代材料时，除了促进骨修复，是否有新生血管的出现也是一个非常重要的因素。

硫酸钙作为临床使用历史最为悠久的骨替代材料，具有良好的生物相容性及骨传导性，广泛应用于各部位骨缺损的填充，其缺陷在于单纯硫酸钙缺乏骨诱导性。故大量复合材料引入了复合锶元素的概念，大量的体外及体内实验已经证实锶元素具有促进成骨活动和抑制破骨活动的作用，具有骨诱导性。我们前期动物体内实验结果证实虽然含锶硫酸钙部分改善了硫酸钙的骨修复能力，但其修复的骨质需较长时间才能达到与正常骨质一样的质量，原因可能在于新生血管较少，血供不足。

发明内容

本发明的目的在于提出一种人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料及制备方法，具有修复能力强的特点。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料，该复合材料的原料包括人参皂苷Rg1和含锶α-半水硫酸钙，人参皂苷Rg1和含锶α-半水硫酸钙的质量比为(1-100)×10^-4：300。

进一步的，含锶α-半水硫酸钙中锶元素和钙元素的摩尔比为1:4。

上述人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)共沉淀法制备含锶二水硫酸钙；

(2)以步骤(1)的含锶二水硫酸钙制备含锶α-半水硫酸钙；

(3)将人参皂苷Rg1和含锶α-半水硫酸钙按照比例混合制成混合物，将混合物以模具成型，室温下养护2-3小时，干燥灭菌后得成品。

进一步的，在步骤(1)中，共沉淀法制备含锶二水硫酸钙的步骤如下：

A、将Ca(OH)₂和Sr(OH)₂·8H₂O以Sr元素和Ca元素摩尔比1:9加入其离子水制成混合溶液；

B、在搅拌状态下，将稀硫酸逐滴加入混合溶液中，继续搅拌反应，反应完成后将沉淀干燥研磨，制得粉剂即含锶二水硫酸钙。

进一步的，步骤B中，在30℃下稀硫酸加入混合溶液，在30℃下搅拌反应3小时。

进一步的，步骤B中，反应生成的沉淀用去离子水洗涤后，放入冷冻干燥机中干燥72小时；将干燥的沉淀研磨过200目筛。

进一步的，步骤(2)制备含锶α-半水硫酸钙的步骤为：

a、将步骤(1)制得的含锶二水硫酸钙加入去离子水，并加入硫酸铝和酒石酸钾钠作为复合转晶剂，得到混合物；

b、将混合物放入高温高压釜在2个大气压130℃下反应6小时；

c、将步骤b中的反应物趁热进行过滤、洗涤、干燥及球磨，即制得含锶α-半水硫酸钙。

进一步的，步骤c中，反应物过滤所得的沉淀采用70℃去离子水洗涤，之后在冷冻干燥机中进行干燥，干燥后的沉淀研磨并过200目筛，制得含锶α-半水硫酸钙。

进一步的，步骤(3)中，将人参皂苷Rg1溶于无水乙醇中，然后按固体质量/液体体积＝3:1的固液比与含锶α-半水硫酸钙粉末进行混合。

进一步的，步骤(3)中，在80℃下干燥2-3小时，最后以钴-60辐照灭菌。

本发明的有益效果为：

本发明的复合材料以人参皂苷Rg1和含锶硫酸钙进行复合形成一种可生物降解的具有生物活性掺锶硫酸钙材料。在含锶硫酸钙的基础上加入了一定含量的人参皂苷Rg1，通过细胞及动物实验均证实了人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料有促进血管化的作用，较单纯的含锶硫酸钙骨修复能力更强。

本发明的人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料在骨科、整形外科、颅颌面外科、脑外科或口腔科中的骨、齿损伤填充再生修复和药物缓释系统方向均可应用。

附图说明

图1是在成骨细胞培养1-7天的细胞相对增殖率；

图2是对各实验例中成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的活性检测结果；

图3是各实验例中关于成骨分化相关基因的mRNA表达水平检测结果；

图4是各实验例中自成骨组织中相关新生血管多肽或蛋白质的电泳照片；

图5是各实验例中自成骨组织中相对蛋白表达检测结果；

图6是各时间段大鼠颅骨的CT重建图像；

图7是各时间段新生骨的骨密度分析结果；

图8是各时间段的骨修复区域的骨体积分数检测结果。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。

一种人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料，该复合材料的原料包括人参皂苷Rg1和含锶α-半水硫酸钙，人参皂苷Rg1和含锶α-半水硫酸钙的质量比为(1-100)×10^-4：300。

本发明的复合材料以人参皂苷Rg1和含锶硫酸钙进行复合形成一种可生物降解的具有生物活性掺锶硫酸钙材料。在含锶硫酸钙的基础上加入了一定含量的人参皂苷Rg1，通过细胞及动物实验均证实了人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料有促进血管化的作用，较单纯的含锶硫酸钙骨修复能力更强。

本发明中限定了含锶α-半水硫酸钙和人参皂苷Rg1的混合比例，在该比例范围内，复合材料有较好的促进血管化作用。

进一步的，含锶α-半水硫酸钙中锶元素和钙元素的摩尔比为1:4。通过限定含锶α-半水硫酸钙中锶的含量，能控制含锶α半水硫酸钙的降解速率在一个合理的范围内。

上述人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)共沉淀法制备含锶二水硫酸钙；

(2)以步骤(1)的含锶二水硫酸钙制备含锶α-半水硫酸钙；

(3)将人参皂苷Rg1和含锶α-半水硫酸钙按照比例混合制成混合物，将混合物以模具成型，室温下养护2-3小时，干燥灭菌后得成品。

进一步的，在步骤(1)中，共沉淀法制备含锶二水硫酸钙的步骤如下：

A、将Ca(OH)₂和Sr(OH)₂·8H₂O以Sr元素和Ca元素摩尔比1:9加入其离子水制成混合溶液；

B、在搅拌状态下，将稀硫酸逐滴加入混合溶液中，继续搅拌反应，反应完成后将沉淀干燥研磨，制得粉剂即含锶二水硫酸钙。

通过控制Ca(OH)₂和Sr(OH)₂·8H₂O的比例，能最大限度的节约材料，同时制得的含锶二水硫酸钙有较高的纯度。

进一步的，步骤B中，在30℃下稀硫酸加入混合溶液，在30℃下搅拌反应3小时。保持30℃的反应温度，使得反应缓慢匀速进行，有利于生成高质量的含锶二水硫酸钙。

进一步的，步骤B中，反应生成的沉淀用去离子水洗涤后，放入冷冻干燥机中干燥72小时；将干燥的沉淀研磨过200目筛。

在步骤B中，反应物在低温干燥箱内干燥，有效提高干燥速率，同时，采用这种低温干燥，有利于获得更纯净的含锶二水硫酸钙。对干燥后的反应物进行研磨和过筛，有利于获得更均质的含锶二水硫酸钙，同时，还能在(2)中更充分的反应。

进一步的，步骤(2)制备含锶α-半水硫酸钙的步骤为：

a、将步骤(1)制得的含锶二水硫酸钙加入去离子水，并加入硫酸铝和酒石酸钾钠作为复合转晶剂，得到混合物；

b、将混合物放入高温高压釜在2个大气压130℃下反应6小时；

c、将步骤b中的反应物趁热进行过滤、洗涤、干燥及球磨，即制得含锶α-半水硫酸钙。

复合转晶剂的使用以减少形成β相半水硫酸钙，确保反应物结晶纯度，在保证结晶速度的同时简化了反应步骤，且更节约成本。

进一步的，步骤c中，反应物过滤所得的沉淀采用70℃去离子水洗涤，之后在冷冻干燥机中进行干燥，干燥后的沉淀研磨并过200目筛，制得含锶α-半水硫酸钙。沉淀采用70℃去离子水洗涤能充分清洗杂质。

进一步的，步骤(3)中，将人参皂苷Rg1溶于无水乙醇中，然后按固体质量/液体体积＝3:1的固液比与含锶α-半水硫酸钙粉末进行混合。无水乙醇能充分溶解人参皂苷Rg1，使得人参皂苷Rg1能与含锶α-半水硫酸钙粉末充分混合均匀，同时，无水乙醇易于挥发，挥发后不留残质，提高了复合材料的纯净度。

进一步的，步骤(3)中，在80℃下干燥2-3小时，最后以钴-60辐照灭菌。80℃下干燥2-3小时能使复合材料充分干燥，提高干燥温度有效缩小干燥时间。钴-60辐照灭菌能对复合材料充分灭菌。

实施例1-5

实施例1-5的人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料，该复合材料的原料包括人参皂苷Rg1和含锶α-半水硫酸钙，人参皂苷Rg1和含锶α-半水硫酸钙的质量比为分别是10×10^-6：300、1×10^-4：300、10×10^-4：300、50×10^-4：300、100×10^-4：300。其中，含锶α-半水硫酸钙中锶元素和钙元素的摩尔比为1:4。

实施例1-5的人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料的制备方法包括以下步骤：

(1)共沉淀法制备含锶二水硫酸钙；

A、将Ca(OH)₂和Sr(OH)₂·8H₂O以Sr元素和Ca元素摩尔比1:9加入其离子水制成混合溶液；

B、在30℃搅拌状态下，将稀硫酸逐滴加入混合溶液中，30℃下继续搅拌反应，反应完成后将沉淀用去离子水洗涤后，放入冷冻干燥机中干燥72小时；将干燥的沉淀研磨过200目筛，制得粉剂即含锶二水硫酸钙。稀硫酸的浓度为5mol/L。

(2)以步骤(1)的含锶二水硫酸钙制备含锶α-半水硫酸钙；

a、将步骤(1)制得的含锶二水硫酸钙加入去离子水，并加入硫酸铝和酒石酸钾钠作为复合转晶剂，得到混合物；

b、将混合物放入高温高压釜在2个大气压130℃下反应6小时；

c、将步骤b中的反应物趁热进行过滤、采用70℃去离子水洗涤、冷冻干燥机中干燥及球磨过200目筛，即制得含锶α-半水硫酸钙。

(3)将人参皂苷Rg1 10μg、100μg、1mg、5mg及10mg，分别溶于100ml无水乙醇中，然后分别与300g含锶α-半水硫酸钙制成混合物，将混合物以模具成型，室温下养护2-3小时，在80℃下干燥2-3小时，最后以钴-60辐照灭菌后得成品。

实施例1-5的人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料的制备方法各步骤参数如下表所示。

实施例1-5制得的人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料，复合材料中人参皂苷Rg1和含锶硫酸钙的质量比例依次为：10×10^-6：300、1×10^-4：300、10×10^-4：300、50×10^-4：300、100×10^-4：300。

实施例1-5制得的人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料进行细胞实验和动物实验，实验如下。

实验一细胞实验

以含锶α-半水硫酸钙的骨诱导材料为对比实验例，以实施例1-5制成的人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料为实验例，进行细胞实验。结果如图1-5所示。

图1是在成骨细胞培养1-7天的细胞相对增殖率，采用实施例1-5复合材料的细胞增殖速度明显高于对比例。

图2是对各实验例中成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的活性检测，采用实施例1-5复合材料的成骨细胞中ALP活性明显高于对比例。ALP活性增强时，骨形成增强，并促进骨基质矿化形成，ALP的活性是反映成骨细胞分化程度和功能状态的良好指标。

图3是各实验例中关于成骨分化相关基因的mRNA表达水平，采用实施例1-5复合材料的成骨细胞中相关基因的mRNA表达水平明显高于对比例。成骨分化相关基因表示了成骨细胞***的速度。

图4是各实验例中自成骨组织中相关新生血管多肽或蛋白质的电泳照片，显示采用实施例1-5复合材料的实验例中相关新生血管蛋白质均有产生，而对比例中β-catenin、GSK3β、BMP-2三种蛋白含量很少，证明采用实施例1-5复合材料的实验例的成骨组织产生了新生血管，而对比例的成骨组织未有新生血管出现。

图5是各实验例中自成骨组织中相对蛋白表达，可见，采用实施例1-5复合材料的实验例中相关新生血管蛋白质均有产生，且产生量远远高于对比例。

实验二动物实验

以含锶α-半水硫酸钙的骨诱导材料为对比实验例，以实施例1-5制成的人参皂苷Rg1/含锶硫酸钙复合材料为实验例，进行动物实验。将六种材料分别植入不同大鼠颅骨，分别在4个星期、8个星期、12个星期进行检测，结果如图6-8所示。

图6是各时间段大鼠颅骨的CT重建图像，显示骨修复速度，采用实施例1-5的复合材料很明显能提高骨修复速度，当修复材料中人参皂苷Rg1含量越多时，骨修复速度越快。

图7是各时间段新生骨的骨密度分析，当修复时间越长时，采用实施例1-5的复合材料的新生骨的骨密度逐渐增大，具有较好的修复效果。

图8是各时间段的骨修复区域的骨体积分数，该值增高说明骨合成代谢大于分解代谢，骨量增加，显示采用实施例1-5的复合材料的骨修复区域的骨密骨量增加速度较大，且修复材料中人参皂苷Rg1含量越多时，骨骨量增加速度越快。

以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。