阅读说明：本技术 一种引导性组织再生膜及其制备方法 (Guided tissue regeneration membrane and preparation method thereof ) 是由 车七石 刘少辉 李新霞 于 2020-08-14 设计创作，主要内容包括：本发明属于医疗材料领域,具体涉及一种引导性组织再生膜及其制备方法。本发明提供的引导性组织再生膜,包括如下组分及其重量百分数：胶原20％～30％,生物活性混合粉末20％～40％,儿茶素0.1％～0.3％,鼠尾草精油0.1％～0.2％,0.3mol/L的酸性溶液2％～4％,0.2mol/L的氢氧化钠溶液3％～5％,水溶性高分子物质5％～10％,无菌水10.5％～49.8％。本发明提供的引导性组织再生膜制备方法简单,无任何毒性物质,是一种可溶性膜,不需要取出,可以在人体内降解吸收；而且,本发明提供的引导性组织再生膜中含有保护牙齿的各营养元素,还可以间接保护牙齿健康。(The invention belongs to the field of medical materials, and particularly relates to a guided tissue regeneration membrane and a preparation method thereof. The guided tissue regeneration membrane provided by the invention comprises the following components in percentage by weight: 20 to 30 percent of collagen, 20 to 40 percent of mixed powder with biological activity, 0.1 to 0.3 percent of catechin, 0.1 to 0.2 percent of sage essential oil, 2 to 4 percent of 0.3mol/L acid solution, 3 to 5 percent of 0.2mol/L sodium hydroxide solution, 5 to 10 percent of water-soluble polymer and 10.5 to 49.8 percent of sterile water. The guided tissue regeneration membrane provided by the invention is simple in preparation method, free of any toxic substance, soluble, does not need to be taken out, and can be degraded and absorbed in a human body; in addition, the guided tissue regeneration membrane provided by the invention contains various nutrient elements for protecting teeth, and can indirectly protect the health of the teeth.)

一种引导性组织再生膜及其制备方法

技术领域

本发明属于医疗材料领域，具体涉及一种引导性组织再生膜及其制备方法。

背景技术

引导组织再生技术(Guided Tissue Regeneration，GTR)是在牙周手术中利用膜性材料作为屏障，阻挡牙龈上皮在愈合过程中沿根面生长，阻挡牙龈***与根面接触，并提供一定的空间，引导具有形成新附着能力的牙周膜细胞优先占领根面，从而在已暴露于牙周袋内的根面上形成新的牙骨质，并有牙周膜纤维埋入，形成牙周组织的再生，即形成新附着性愈合。GTR技术是目前能够有效治疗牙周病的一种最为先进的治疗方法。随着GTR技术越来越成熟，其在临床上的应用范围也越来越广泛。

目前，市场上常用的GTR膜性材料可以分为两类：一种是不可吸收性膜，这种膜在人体内不能被降解吸收，需在手术后6-8周时第二次手术将膜取出；还有一种是可吸收性膜，这类膜不需要进行二次试验，可以直接被人体吸收，也是市场上应用最广泛的膜。常用的可吸收性膜包括胶原膜，聚乳酸膜，聚乙醇酸与聚乳酸和碳酸三丙烯共聚膜等。

中国专利申请CN106693080A公开了一种引导组织再生膜及其制备方法，该再生膜由光滑面与粗糙面组成，以动物真皮层皮片为前体，经脱细胞处理、低渗-高渗盐处理、酶处理及去污剂处理，最后再矿化，冷冻干燥即得。该方法制得的组织再生膜虽然具有良好的骨诱导和骨传导的功能，但是制备过程复杂，成本较高，而且，这种复合膜对人体具有一定的毒副作用。

中国专利申请CN106110407A公开了一种引导性组织再生复合膜材料及其制备方法。所述的再生复合膜材料为双层膜结构，包括疏松层及致密层，具有良好的生物相容性，骨修复和抗菌功能，可用于牙周引导性组织再生的治疗和骨膜缺损修复。该复合膜需要的材料较多，使得成本很高，而且，该复合膜在使用过程中容易降解，达不到预定效果。

综上，目前已有的引导性组织再生膜普遍存在制作过程复杂，成本高，毒性高而且容易降解的缺点。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点，本发明的目的在于提供一种引导性组织再生膜及其制备方法，本发明提供的引导性组织再生膜具有操作简单，成本低，毒性低的优点，同时，本发明提供的引导性组织再生膜中含维护牙齿健康的各种营养元素，溶解后可以对牙齿起到一定的包含作用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种引导性组织再生膜，包括如下组分及其重量百分数：胶原20％～30％，生物活性混合粉末20％～40％，儿茶素0.1％～0.3％，鼠尾草精油0.1％～0.2％，0.3mol/L的酸性溶液2％～4％，0.2mol/L的氢氧化钠溶液3％～5％，水溶性高分子物质5％～10％，无菌水10.5％～49.8％。

所述引导性组织再生膜，由如下组分及其重量百分数组成：胶原25％，生物活性混合粉末30％，儿茶素0.2％，鼠尾草精油0.15％，0.3mol/L的酸性溶液3％，0.2mol/L的氢氧化钠溶液4％，水溶性高分子物质8％，无菌水29.65％。

优选地，所述胶原为I型胶原与III型胶原按重量比4～8：1～3组成。

优选地，所述胶原为I型胶原与III型胶原按重量比6：2组成。

优选地，所述酸性溶液为0.1mol/L的柠檬酸溶液与0.4mol/L的醋酸溶液按体积比3：7组成。

优选地，所述生物活性混合粉末由如下组分及其重量百分数组成：CaCl₂ 25-32％，Na₂SiO₃ 50-60％，NaF 12-20％。

优选地，所述生物活性混合粉末由如下组分及其重量百分数组成：CaCl₂ 27％，Na₂SiO₃ 56％，NaF 17％。

优选地，所述水溶性高分子物质为羧甲基淀粉与羟甲基纤维素按重量比2-4：2-8组成；

优选地，所述水溶性高分子物质为羧甲基淀粉与羟甲基纤维素按重量比3：5组成。

本发明还提供了所述引导性组织再生膜的制备方法，操作步骤如下：

S1、将生物活性混合粉末，儿茶素加入无菌水中，低速搅拌10-20min至混合均匀，得混合液I；

S2、向步骤S1所得混合液I中加入胶原及水溶性高分子物质，高速搅拌5-10min，混合均匀，得混合液II；

S3、向步骤S2所得混合液II中加入酸性溶液，鼠尾草精油及0.2mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH至7.6-8.0，高速离心10-15min，得混合液III；

S4、将步骤S3所得混合液进行冷冻干燥，然后模具成型，利用物理方法交联，即得。

优选地，所述步骤S1中的低速为20-30r/min；所述步骤S2、S3中的高速为40-50r/min。

优选地，所述步骤S4中物理方法交联的具体操作为：将经模具成型、冷冻干燥后的混合固体物质在真空条件下，于120-160℃的温度下热交联10-20min。

本发明中，创造性的加入多种物质组成的生物活性物质，可以为牙齿补充多种元素，维持牙齿健康，而且，申请人意外的发现，加入少量的儿茶素和鼠尾草精油，还可以帮助抑制口腔中细菌的增长，减少了虫牙发生的可能性。

与现有技术相比，本发明提供的引导性组织再生膜具有以下优点：

(1)本发明提供的引导性组织再生膜，含有维护牙齿健康的多种营养元素，在牙周手术后起屏障作用的同时，还可以起到保持牙齿健康的作用；

(2)本发明提供的引导性组织再生膜，添加了儿茶素和鼠尾草精油，二者混合使用，可以降低虫牙发生的概率，还具有一定的杀菌作用，可以帮助维持口腔健康；

(3)本发明提供的引导性组织再生膜，所用原料均为市场上常见的，售价低，节约了制作成本，而且制备工艺简单，可以为企业带来很大的效益；

(4)本发明提供的引导性组织再生膜，毒性低，而且其中的生物活性混合粉末，具有一定的活性，用作屏障时，不会出现降解过快问题。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

所述鼠尾草精油可购自江西环球天然香料有限公司；所述儿茶素可购自陕西晨明生物科技有限公司。

实施例1一种引导性组织再生膜

所述引导性组织再生膜由如下组分及其重量百分数组成：胶原20％，生物活性混合粉末20％，儿茶素0.1％，鼠尾草精油0.1％，0.3mol/L的酸性溶液2％，0.2mol/L的氢氧化钠溶液3％，水溶性高分子物质5％，无菌水49.8％；

所述胶原为I型胶原与III型胶原按重量比4：1组成；

所述酸性溶液为0.1mol/L的柠檬酸溶液与0.4mol/L的醋酸溶液按体积比3：7组成；

所述生物活性混合粉末由如下组分及其重量百分数组成：CaCl₂ 27％，Na₂SiO₃56％，NaF 17％。

所述水溶性高分子物质为羧甲基淀粉与羟甲基纤维素按重量比3：5组成。

所述引导性组织再生膜的制备方法为：

S1、将生物活性混合粉末，儿茶素加入无菌水中，于20r/min的条件下搅拌10min至混合均匀，得混合液I；

S2、向步骤S1所得的混合液I中加入胶原及水溶性高分子物质，于40r/min的条件下搅拌5min，混合均匀，得混合液II；

S3、向步骤S2所得的混合液II中加入酸性溶液，鼠尾草精油及0.2mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH至7.6，以40r/min的速度离心10min，得混合液III；

S4、将步骤S3所得的混合液III经冷冻干燥，模具成型，然后在真空条件下，在120℃的高温下交联10min，即得。

实施例2一种引导性组织再生膜

所述引导性组织再生膜，由如下组分及其重量百分数组成：胶原30％，生物活性混合粉末40％，儿茶素0.3％，鼠尾草精油0.2％，0.3mol/L的酸性溶液4％，0.2mol/L的氢氧化钠溶液5％，水溶性高分子物质10％，无菌水10.5％；

所述胶原为I型胶原与III型胶原按重量比8：3组成；

所述酸性溶液与实施例1类似；

所述生物活性混合粉末与实施例1类似；

所述水溶性高分子物质与实施例1类似。

所述引导性组织再生膜的制备方法为：

S1、将生物活性混合粉末，儿茶素加入无菌水中，于30r/min的条件下搅拌20min至混合均匀，得混合液I；

S2、向步骤S1所得的混合液I中加入胶原及水溶性高分子物质，于50r/min的条件下搅拌10min，混合均匀，得混合液II；

S3、向步骤S2所得的混合液II中加入酸性溶液，鼠尾草精油及0.2mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH至8.0，以50r/min的速度离心15min，得混合液III；

S4、将步骤S3所得混合液III经冷冻干燥，模具成型，然后在真空条件下，在160℃的高温下交联20min，即得。

实施例3一种引导性组织再生膜

所述引导性组织再生膜，由如下组分及其重量百分数组成：胶原25％，生物活性混合粉末30％，儿茶素0.2％，鼠尾草精油0.15％，0.3mol/L的酸性溶液3％，0.2mol/L的氢氧化钠溶液4％，水溶性高分子物质8％，无菌水29.65％；

所述胶原为I型胶原与III型胶原按重量比6：2组成；

所述酸性溶液与实施例1类似；

所述生物活性混合粉末与实施例1类似；

所述水溶性高分子物质与实施例1类似。

所述引导性组织再生膜的制备方法为：

S1、将生物活性混合粉末加入无菌水中，于25r/min的条件下搅拌15min至混合均匀，得混合液I；

S2、向步骤S1所得的混合液I中加入胶原及水溶性高分子物质，于45r/min的条件下搅拌8min，混合均匀，得混合液II；

S3、向步骤S2所得的混合液II中加入酸性溶液及0.2mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH至7.8，以45r/min的离心12min，得混合液III；

S4、将步骤S3所得混合液III经冷冻干燥，模具成型，然后在真空条件下，在140℃的高温下交联15min，即得。

对比例1一种引导性组织再生膜

所述引导性组织再生膜，由如下组分及其重量百分数组成：胶原25％，生物活性混合粉末30％，儿茶素0.2％。鼠尾草精油0.15％，0.3mol/L的酸性溶液3％，0.2mol/L的氢氧化钠溶液4％，水溶性高分子物质8％，无菌水29.65％；

所述胶原为I型胶原与II型胶原按重量比6：2组成；

所述酸性溶液与实施例1类似；

所述生物活性混合粉末由如下组分及其重量百分数组成：CaCl₂ 44％，Na₂SiO₃56％；

所述水溶性高分子物质与实施例1类似。

所述引导性组织再生膜的制备方法与实施例3类似；

与实施例3的区别在于，对比例1中的生物活性混合粉末由44％的CaCl₂及56％的Na₂SiO₃组成。

对比例2一种引导性组织再生膜

所述引导性组织再生膜，由如下组分及其重量百分数组成：胶原25％，生物活性混合粉末30％，儿茶素0.2％，鼠尾草精油0.15％，0.3mol/L的酸性溶液3％，0.2mol/L的氢氧化钠溶液4％，水溶性高分子物质8％，无菌水29.65％；

所述胶原为I型胶原与II型胶原按重量比6：2组成；

所述酸性溶液与实施例1类似；

所述生物活性混合粉末与实施例1类似；

所述水溶性高分子物质由羧甲基淀粉与羟甲基纤维素按重量比1：1组成。

所述引导性组织再生膜的制备方法与实施例3类似。

与实施例3的区别在于，对比例2中的水溶性高分子物质由羧甲基淀粉与羟甲基纤维素按重量比1：1组成。

对比例3一种引导性组织再生膜

所述引导性组织再生膜，由如下组分及其重量百分数组成：胶原25％，生物活性混合粉末30％，儿茶素0.2％，鼠尾草精油0.15％，0.3mol/L的酸性溶液3％，0.2mol/L的氢氧化钠溶液4％，水溶性高分子物质8％，无菌水29.65％；

所述胶原为I型胶原与II型胶原按重量比1：1组成；

所述酸性溶液与实施例1类似；

所述生物活性混合粉末与实施例1类似；

所述水溶性高分子物质与实施例1类似。

所述引导性组织再生膜的制备方法与实施例3类似。

与实施例3的区别在于，所述胶原由I型胶原与II型胶原按重量比1：1组成。

对比例4一种引导性组织再生膜

所述引导性组织再生膜，由如下组分及其重量百分数组成：胶原25％，生物活性混合粉末30％，儿茶素0.2％，0.3mol/L的酸性溶液3％，0.2mol/L的氢氧化钠溶液4％，水溶性高分子物质8％，无菌水30.15％；

所述胶原为I型胶原与II型胶原按重量比6：2组成；

所述酸性溶液与实施例1类似；

所述生物活性混合粉末与实施例1类似；

所述水溶性高分子物质与实施例1类似。

所述引导性组织再生膜的制备方法与实施例3类似。

与实施例3的区别在于，对比例4中不包含鼠尾草精油。

试验例1引导性组织再生膜的体外降解试验

1.试验样品：实施例1-3制得的引导性组织再生膜；对比例1-3制得的引导性组织再生膜；天然胶原膜；

2.试验方法：称取实施例1-3制得的引导性组织再生膜，对比例1-4制得的引导性组织再生膜及天然胶原膜各0.1g，分别置于不同离心管中，向离心管中加入胶原酶含量为15mg的磷酸盐缓冲液10mL，置于37℃的恒温摇床上以50r/min的速度摇动，每天半量换液，以维持溶液的pH值稳定，分别于第1天，第3天，第5天，第1周，第2周，第3周，第4周，第5周，第6周，第7周，第8周，取出样品，洗净烘干至恒重称量并计重。

降解率＝(测试前重量-测试后重量)/测试前重量×100％。

3.试验结果：试验结果见表1，表2。

表1 1-7天内不同试验样品的降解情况

表2 2-8周不同样品的降解情况

由表1，表2可知，本发明制得的引导性组织再生膜到第8周时，体外降解率为100％左右，而天然胶原膜的体外降解率至第8周时接近90％，对比例1-4制得的引导性组织再生膜由于改变了实施例的再生膜的组分，其降解率显著降低，第8周时还未完全降解。因此，本发明实施例制得的引导性再生膜的体外降解率显著高于对比例1-4制得的引导性组织再生膜及天然胶原膜，其中，实施例3制得的胶原膜的体外降解率为99.86％，为本发明的最佳实施例。

试验例2引导性组织再生膜引导牙周组织再生试验

1.试验样品：实施例1-3制得的引导性组织再生膜；天然胶原膜；

2.试验动物：体重为5～20kg，3～5月龄的巴马小型猪90只，随机分成9组，每组10只；

3.试验方法：每组猪进行模拟牙周炎骨缺损处理，于猪的双侧下颌第三、四前磨牙颊侧制作2个大小为5mm×5mm的急性二壁骨袋的骨缺损模型，深达牙面，采用自体对照的方法观察牙周组织再生情况，两个骨缺损区一个覆上试验样品，一个不做处理，作为空白对照。手术14周后进行标本观察，组织学观察，同时利用锥形束计算机体层摄影术扫描并重建。

4.试验结果：试验结果见表3。

表3 14周后新生牙槽骨体积(mm³)

由表3可知，手术14周后，敷用本发明实施例1-3制得的引导性组织再生膜的新生牙槽骨体积在12.21-14.22mm³之间，而天然胶原膜组的只有6.41mm³，对比例1-4制得的引导性组织再生膜的新生牙槽骨体积在10mm³以下，因此，本发明制得的引导性组织再生膜的效果显著高于天然胶原膜及对比例1-4制得的引导性组织再生膜。同时，与空白对照相比，敷用本发明的引导性组织再生膜的猪的新生牙槽骨体积显然增大了很多，牙周组织再生效果显著，以实施例3的体积最大，为本发明的最佳实施例。

试验例3虫牙发生概率试验

1.试验样品：实施例1-3及对比例4制备的引导性组织再生屏障膜；

2.试验方法：由于牙齿和蛋壳的主要成分均为碳酸钙，故用蛋壳模拟牙齿，用2mol/L的盐酸模拟有机酸。

将蛋壳洗净，剥除内皮后，称取两份1g的蛋壳，在两份蛋壳表面均匀覆盖一层组织引导性再生屏障膜，然后将蛋壳置于两个烧杯中，做好记号，放置3min，取2mL的2mol/L HCl稀释成10mL，在每只烧杯中加入5mL该稀盐酸，反应静置10min，取出蛋壳，分别抽滤再称量，记下结果。

3.试验结果：具体试验结果见表4。

表4不同试验样品的重量

试验样品	试验前蛋壳重量	试验后蛋壳重量
			实施例1	1g	0.98g
实施例2	1g	0.98g
			实施例3	1g	0.99g
对比例4	1g	0.91g

由表4可知，10min后，被对比例4中的引导性组织再生膜覆盖的蛋壳重量降低至0.91g，说明其被腐蚀，而被实施例1-3中的引导性组织再生膜覆盖的蛋壳重量在0.98～0.99g，极少被腐蚀，故发生虫牙的概率比对比例4小很多。

试验例4、生物屏障作用试验

1、试验材料：将实施例1-4和对比例1-4制备的可降解组织再生屏障膜材料剪成直径为6mm的小圆片，以⁶⁰Co辐射24h消毒，使用前用紫外线照射30min。试验前一天将材料放入24孔培养板中，用培养液预湿，备用。

将人牙龈成纤维细胞培养至细胞密度达到培养瓶的80％后，用胰蛋白酶消化后，计数，调整细胞悬浊液浓度为5×10³/mL。取100μL接种于24孔板内，标记可降解组织再生屏障膜接种细胞的一面为正面，另一面为反面，在37℃、50mL/L CO₂、饱和湿度条件下培养，3h后向每孔补加100μL培养液，继续培养，每24h换液1次。

培养3天后取出材料，用PBS漂洗2遍，去除死细胞，经过预处理的细胞材料用扫面电镜观察牙龈成纤维细胞在材料正反面及断面的生长情况。

2、试验结果：实施例1-4制备的可降解组织再生屏障膜材料表面，人牙龈成纤维细胞粘附生长，多角形细胞伸出长长的伪足，向外铺展在可降解组织再生屏障膜材料表面；膜材料反面未见有细胞生长；膜材料断面处也未观察到有细胞长入；而对比例1-4制备的可降解组织再生屏障膜材料的正反两面及断面处有人牙龈成纤维细胞粘附生长。实验结果表明，本发明制备的可降解组织再生屏障膜材料能够阻挡人牙龈成纤维细胞的长入，具有良好的屏障功能。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。