一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法
阅读说明：本技术 一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法 (Dorsal gene interference method for relieving lipid peroxidation of macrobrachium rosenbergii ) 是由 孙存鑫 刘波 钱妤 周群兰 戈贤平 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法,包括以下步骤：(1)根据罗氏沼虾Dorsal基因的核苷酸序列合成序列特异性的dsRNA；(2)调整dsMsDorsal的浓度,按4μg/g虾的剂量注射,控制注射体积在30μL以内,(3)检测dsMsDorsal对组织损伤、细胞凋亡和基因表达的影响。本发明针对罗氏沼虾Dorsal基因设计的dsMsDorsal能快捷、高效、特异性地抑制罗氏沼虾摄食饲料脂肪酸不平衡、脂肪酸氧化等原因导致的脂质过氧化,实现罗氏沼虾健康、高效养殖。(The invention discloses a Dorsal gene interference method for relieving lipid peroxidation of macrobrachium rosenbergii, which comprises the following steps: (1) synthesizing sequence-specific dsRNA (double-stranded ribonucleic acid) according to the nucleotide sequence of the Macrobrachium rosenbergii Dorsal gene; (2) adjusting the concentration of dsMsDorsal, injecting at a dose of 4 μ g/g shrimp, controlling the injection volume within 30 μ L, and (3) detecting the effect of dsMsDorsal on tissue damage, apoptosis and gene expression. The dsMsDorsal designed aiming at the Dorsal gene of the Macrobrachium rosenbergii can quickly, efficiently and specifically inhibit lipid peroxidation caused by imbalance of fatty acid in ingested feed of the Macrobrachium rosenbergii, oxidation of fatty acid and the like, and realize healthy and efficient culture of the Macrobrachium rosenbergii.)
技术领域：
本发明属于水产动物生理调控领域，具体涉及利用RNA干扰技术对罗氏沼虾Dorsal基因进行敲减缓解脂肪过氧化的方法。
背景技术：
罗氏沼虾自上世纪70年代引入我国以来已在我国华东和华南地区广泛养殖，年产量已达13.2万吨。在养殖过程中罗氏沼虾普遍还存在脂质营养研究缺乏的问题，饲料中不恰当的脂肪水平和脂肪酸组成以及饲料在存储过程中产生的脂肪酸氧化不仅抑制了生长，还导致罗氏沼虾脂肪代谢紊乱，对虾体造成了一定程度的氧化损伤。因此，对罗氏沼虾进行脂肪代谢调控对罗氏沼虾健康高效养殖具有重要意义。
Dorsal基因是NF-κB在无脊椎动物中的同源亚型，最先在果蝇中被发现。研究表明，Dorsal与炎症反应、细胞增殖和凋亡有着密切的关系。近年来，在虾类的研究中发现，Dorsal在Toll信号通路中可激活下游抗菌肽基因表达，参与抗菌和抗病毒反应。而Dorsal在虾脂肪代谢中的调控作用还鲜有报道。
RNA干扰（RNAi）技术指在进化过程中高度保守的、由dsRNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的过程，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。近年来，RNAi也逐渐应用于无脊椎动物基因功能验证和抗病毒研究中。由于虾等水生无脊椎动物无稳定传代的细胞系，因此，相关RNAi研究主要集中在体内水平，而不同个体、不同引物、不同dsRNA的导入方式对实验结果影响差异较大，因此，针对Dorsal基因建立一个相对稳定的RNA干扰体系对于罗氏沼虾脂肪生理研究和健康高效养殖是必不可少的。
发明内容
：本发明所要解决的技术问题是提供一种可有效缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法。
本发明公开的一种缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法，包括以下步骤：
①根据罗氏沼虾Dorsal基因的核苷酸序列，合成序列特异性的dsMsDorsal，具体包括如下步骤：
（1）cDNA的制备
取罗氏沼虾肝胰腺，用Trizol法提取Total RNA，提取后Total RNA的用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，并利用Nano Drop紫外分光光度计测定RNA浓度，浓度达标的RNA借助试剂盒进行反转录成cDNA，并保存于-20℃备用；
（2）引物的设计
利用http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl网页端设计dsRNA引物，引物设计时，在每对引物的5’端都加上一段T7启动子序列，获得引物序列如下：
正义链
TAATACGACTCACTATAGGGCAAGTGTTCCTCGAAGGCTC，
反义链
TAATACGACTCACTATAGGGAACTTCACCAATTTGTCCGC；
（3）cDNA的扩增
以cDNA为模板，借助试剂盒进行扩增，扩增步骤为: 94℃ 5min → [94℃ 30s → 53℃ 45s → 72℃ 1min]×35 cycle → 72℃ 10min，利用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的质量，将目标条带进行切胶回收并进行纯化；
（4）dsRNA的转录及合成
按照转录试剂盒说明书要求转录合成dsRNA，其中，TranscriptAid Enzyme Mix 和核苷酸置于冰上，5× TranscriptAid Reaction Buffer 置于室温，将反应液缓慢混匀，转录在PCR仪上进行，反应条件为37℃ 2 h，所得的转录产物进行后续的纯化；
（5）dsRNA的纯化
a) 向上述反应液中加入2μL DNase I，RNase free，混合均匀，在37℃条件下静置15min；
b) 加入2μL 0.5 M EDTA，调制反应液pH至8.0；在65℃条件下静置10min；
c) 向上述反应液中加入150μL的DEPC水和15μL 3M醋酸钠，充分混匀，其中醋酸钠溶液的pH 为5.2；
d) 加入150μL的比例为1：1的苯酚／氯仿混合物，充分混匀后离心，将上层水相转移至新离心管中；
e) 向新离心管中加入150μL的氯仿，充分混匀后离心，将上层水相转移至新的离心管中；
f) 向新离心管中加入两倍体积的乙醇，-20℃冰却至少30 min，4℃离心20 min，弃上清；
g) 向上述沉淀中加入500μL的70％冷乙醇漂洗，13000 rpm，4℃离心5min，弃上清后干燥，其中70％冷乙醇采用DEPC水配制；
h) 加入20μLDEPC水溶解沉淀，制成dsMsDorsal溶液，-20℃保存备用；
②将合成后的dsMsDorsal按2～4μg/g虾的剂量进行围心腔注射；
③检测dsMsDorsal对组织损伤、细胞凋亡和基因表达的影响，结果表明缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法可有效缓解生产上由脂质过氧化所导致的罗氏沼虾生长抑制和肝胰腺损伤。
优选地，所述步骤（1）中RNA浓度达标标准为≥200 ng/μL，即RNA浓度在200 ng/μL以上均可使用，反转录试剂盒型号为Takara Primer Script II 1st Strand cDNASynthesis试剂盒。
优选地，所述步骤（2）中T7启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGG。
优选地，所述步骤（3）中cDNA扩增采用的试剂盒型号为Takara PrimeSTAR HS DNAPloymetase试剂盒，Code No. R010A，切胶纯化使用的试剂盒型号为Takara MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒，Code No. 9762。
优选地，所述步骤（4）中dsRNA转录试剂盒型号为Thermo ScientificTranscriptAidTM T7 High Yield Transcription kit # K0441，对于≤100 nt的转录本，PCR仪的反应时间延长至4～8 h。
优选地，所述步骤②中dsMsDorsal的注射体积控制在30μL以内，根据养殖周期每1～2周注射一次。
优选地，所述Dorsal基因核苷酸序列编号为GenBank: KX219631.1。
优选地，所述dsMsDorsal的注射浓度为4 μg/g。
附图说明
图1 为本发明不同注射部位对Dorsal沉默效果的影响。
图2a 为本发明dsMsDorsal注射浓度为1 μg/g对沉默效果的影响。
图2b 为本发明dsMsDorsal注射浓度为2 μg/g对沉默效果的影响。
图2c 为本发明dsMsDorsal注射浓度为4 μg/g对沉默效果的影响。
图3 为本发明不同脂肪源对罗氏沼虾肝胰腺组织结构的影响。
图4 为本发明不同脂肪源对罗氏沼虾肝胰腺细胞凋亡的影响。
图5 为本发明不同脂肪源对罗氏沼虾Toll-Dorsal基因表达的影响。
图6 为本发明注射dsMsDorsal对罗氏沼虾肝胰腺Toll-Dorsal通路表达的影响。
图7 为本发明注射dsMsDorsal对罗氏沼虾肝胰腺组织结构的影响。
具体实施方式
：
通过下述实施例进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，所用试剂如无特殊说明，均为常规时售试剂或按常规方法配制的试剂。
一种可有效缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法，包括以下步骤：
①根据罗氏沼虾Dorsal基因的核苷酸序列，合成序列特异性的dsMsDorsal；
②将合成后的dsMsDorsal按2～4μg/g虾的剂量进行围心腔注射；
③检测dsMsDorsal对抗氧化酶活性、组织损伤、细胞凋亡和基因表达的影响，结果表明缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法可有效缓解生产上由脂质过氧化所导致的罗氏沼虾生长抑制和肝胰腺损伤。
实施例1 dsMsDorsal注射部位的实验分析
选择罗氏沼虾肌肉、心脏、围心腔、眼柄基部4个部位分别注射4 μg/g的dsRNA和同样体积的生理盐水，记录7天的死亡率并检测Dorsal的沉默效率。结果如表1和图1所示，注射部位选择围心腔罗氏沼虾的死亡率最低，注射心脏罗氏沼虾死亡率最高；围心腔注射Dorsal沉默效果最好，眼柄基部注射Dorsal沉默效果最差如图1所示，因此，生产上优选围心腔作为注射部位。
表1 不同注射部位罗氏沼虾死亡率
实施例2 dsMsDorsal注射计量的实验分析
根据实施例1的实验结果，选择罗氏沼虾围心腔作为注射部位，分别设置0、1、2、4 μg/g等四个梯度注射dsDorsal，对干扰后1、4、7、14天各组虾的肝胰腺进行采样，运用RT-qPCR的方法检测沉默效率。
结果显示，1 μg/g剂量注射，14天内罗氏沼虾肝胰腺Dorsal基因表达与对照组差异不显著，如图2a所示；2 μg/g剂量注射肝胰腺dsDorsal基因表达在注射4天后显著降低，7天后表达最低，14d差异不显著，如图2b所示；4 μg/g剂量注射肝胰腺dsDorsal基因表达在14d内均显著降低，如图2c所示，且在注射后7天沉默效果最好。因此，选择注射量4 μg/g为宜。
实施例3 特异性dsMsDorsal的制备
取罗氏沼虾肝胰腺，用Trizol法提取Total RNA，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，用Nano Drop紫外分光光度计测定RNA浓度，浓度在200 ng/μL以上均可使用，使用Takara Primer Script 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒进行反转录，cDNA保存于-20℃备用。
利用http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl网页端设计dsRNA引物，引物设计时，在每对引物的5’端都加上一段T7启动子序列：TAATACGACTCACTATAGGG，获得引物序列如下：
正义链TAATACGACTCACTATAGGGCAAGTGTTCCTCGAAGGCTC
反义链TAATACGACTCACTATAGGGAACTTCACCAATTTGTCCGC。
以cDNA为模板，用Takara PrimeSTAR HS DNA Ploymetase试剂盒，Code No.R010A，进行扩增，步骤为: 94℃ 5min → [94℃ 30s → 53℃ 45s → 72℃ 1min]×35cycle → 72℃ 10min，利用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的质量，将目标条带进行切胶回收并进行纯化，切胶纯化使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction KitVer.4.0试剂盒进行，试剂盒Code No. 9762。
按照Thermo Scientific TranscriptAidTM T7 High Yield Transcription kit# K0441转录试剂盒说明书要求转录合成dsRNA，其中，TranscriptAid Enzyme Mix 和核苷酸置于冰上；5× TranscriptAid Reaction Buffer 置于室温。将反应液缓慢混匀，转录在PCR仪上进行，反应条件为：37℃ 2 h；对于≤100 nt的转录本，反应时间延长至4-8 h。所得的转录产物进行后续的纯化。
dsRNA纯化步骤如下：
a) 向上述反应液中加入2μL DNase I，RNase free，混合均匀，在37℃条件下静置15min；
b) 加入2μL 0.5 M EDTA，调制反应液pH至8.0；在65℃条件下静置10min；
c) 向上述反应液中加入150μL的DEPC水和15μL 3M醋酸钠，充分混匀，其中醋酸钠溶液的pH 为5.2；
d) 加入150μL的比例为1：1的苯酚／氯仿混合物，充分混匀后离心，将上层水相转移至新离心管中；
e) 向新离心管中加入150μL的氯仿，充分混匀后离心，将上层水相转移至新的离心管中；
f) 向新离心管中加入两倍体积的乙醇，-20℃冰却至少30 min，4℃离心20 min，弃上清；
g) 向上述沉淀中加入500μL的70％冷乙醇漂洗，13000 rpm，4℃离心5min，弃上清后干燥，其中70％冷乙醇采用DEPC水配制；
h) 加入20μL DEPC水溶解沉淀，制成特异性dsMsDorsal溶液，-20℃保存备用。
实施例4 注射dsMsDorsal对罗氏沼虾生长和脂质过氧化影响的检测分析
将罗氏沼虾幼虾分为两组，分别投喂含6%鱼油（FOD）和6%菜籽油（COD）的饲料，每组3个重复，8周后评定罗氏沼虾的生长性能，并检测组织损伤、细胞凋亡和基因表达。
FOD组剩余虾每个重复取10尾围心腔注射4 μg/g dsDorsal，另取10尾注射等体积的生理盐水，虾继续饲养4周，每周补充注射一次dsDorsal和生理盐水。8周后评定罗氏沼虾的生长性能，并评定肝胰腺组织损伤和基因表达。
结果表明，罗氏沼虾投喂过高鱼油可导致生长下降、肝胰腺脂质过氧化，表现为肝胰腺脂肪沉积加剧，细胞核变形，细胞凋亡增加、氧化损伤，如表2、图3、图4所示，Dorsal基因表达量上调，如图5所示。
图3中N表示细胞核，L表示脂滴，图4中正常细胞未被染色，如黑色箭头所指示，凋亡细胞被染成棕黄色，如白色箭头所指示。
表2 不同脂肪源对罗氏沼虾生长的影响
对FOD组分别注射生理盐水和dsMsDorsal后发现注射dsMsDorsal后肝胰腺Dorsal表达显著降低，如图6所示；罗氏沼虾生长性能显著提高，如图表3所示；肝胰腺组织损伤降低，如图7所示。
图7中N表示细胞核，L表示脂滴。
表3 注射dsMsDorsal对罗氏沼虾生长的影响
综上所述，本发明的缓解罗氏沼虾脂质过氧化的Dorsal基因干扰方法可有效缓解生产上由脂质过氧化所导致的罗氏沼虾生长抑制和肝胰腺损伤。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。