阅读说明：本技术 用于快速合成抗菌化妆品粉扑的生物相容性组合物及其制备方法 (Biocompatible composition for rapid synthesis of antibacterial cosmetic puff and method for preparing the same ) 是由 金容泰 李相载 曹世熙 于 2018-07-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了生物相容性组合物,以使得能够用抗菌粘附蛋白快速涂覆化妆品粉扑。牢固附着的抗菌蛋白可赋予化妆品粉扑抗菌功能,其抗菌活性持续6个月以上。本发明还描述了用生物相容性组合物中的抗菌粘附蛋白快速涂覆化妆品粉扑的方法。(The present invention provides a biocompatible composition to enable the rapid coating of a cosmetic puff with an antimicrobial adhesive protein. The firmly attached antibacterial protein can endow the cosmetic puff with an antibacterial function, and the antibacterial activity of the cosmetic puff lasts for more than 6 months. The present invention also describes a method for the rapid coating of cosmetic puffs with antimicrobial adhesion proteins in biocompatible compositions.)

用于快速合成抗菌化妆品粉扑的生物相容性组合物及其制备 方法

技术领域

本发明涉及具有抗菌性能的化妆品粉扑，以在潮湿环境中使用后在使用和储存期间防止粉扑中微生物的生长。

背景技术

已知由各种材料制成的化妆品粉扑，优选的是在皮肤上柔软舒适的那些。这样的化妆品粉扑的示例包括由如日本专利(JP 11-000224)中所述的由聚酯丝绒和聚酯经编绒毛、聚对苯二甲酸丙二醇酯(JP 2004-033432、US 2015/0173485)制成的那些。粉扑通常由丝绒、海绵等制成，特别制成用作涂抹化妆品粉饼、粉剂和粉底。

化妆品粉扑用于从化妆品容器上刮除化妆品(主要是粉末化妆品)并且在将粉扑施加到皮肤上时将刮除的化妆品转移到皮肤表面。发生这种情况时，有必要将刮除并附着在粉扑表面的化妆品尽可能多地转移到皮肤表面。

化妆品粉末有时会被微生物(诸如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、破伤风梭菌、酵母菌和霉菌)污染，这些微生物可能来自原材料，或来自制造、加工期间，以及化妆品粉末容器的破损或损坏，在零售市场由于灰尘的存在，还可能来自产品使用期间(参见MichaelMacvren Dashen等人，Microbiological quality assessment of some brands ofcosmetics powders sold within Jos Metropolis,PlateauState.J.Microbiol.Biotech.Res.,2011,1(2):101-106)。

实际上，每次我们接触我们的化妆品时，我们皮肤上的所有污垢和微小的生物体都会转移到产品中。任何刷子或海绵涂抹器也是如此，所有这些细菌不可避免地会进入我们的化妆品中。此外，我们使细菌充斥的化妆品进入我们的口腔、眼睛和任何破损的皮肤。

为了保护产品和我们的身体免受微生物污染，包括银纳米颗粒在内的银基抗菌剂由于其抗菌性能而被广泛用于商业产品中。例如，将银纳米颗粒加入诸如绷带的医疗产品以及纺织品和家用物品中。对于化妆品涂抹器，一些韩国专利公开了银基化妆品粉扑(参见KR 10-1750832、KR 10-2015-0137442)。

然而，已知诸如银纳米颗粒的银化合物在许多不同物种中引起毒性，并且已知长期暴露于银会导致人的银屑病和/或银质沉着病(参见ChristianeBeer等人，Toxicity ofsilver nanoparticles-Nanoparticle or silver ion？Toxicology Letters Volume208,Issue 3(5)2012,86-292)。

在韩国专利(KR 10-1652263)中公开了基于抗菌粘附蛋白的涂层组合物。但是，DOPA介导的粘附在不使用对我们的组织有毒的氧化剂的情况下需要较长的接触时间，通常需要至少6小时。为了快速固化含DOPA的化合物，缓冲液或溶剂的pH必须为强碱性，这对我们的组织也不利。

由于这个原因，存在对用于化妆品粉扑的新颖且毒性很小或无毒性的快速固化抗菌剂的需求。我们通过提供重组加入天然存在的粘附蛋白中的天然存在的抗菌肽解决了毒性问题。该抗菌粘附蛋白的自粘剂可不需要任何化学物质(例如交联剂)即可快速涂覆或粘附。

发明内容

解决技术问题的技术方案

在本发明的一个方面，提供了一种涂层组合物，其包含缓冲溶液和用抗菌肽重组功能化的天然存在的粘附蛋白。

在本发明的一个实施例中，所述缓冲溶液可包含水、醇或其混合物。在本发明的优选实施例中，所述醇可以为低级醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。其中，更优选乙醇。在本发明的另一个优选实施例中，缓冲溶液中醇与水的质量比可以为1:9至9:1。

在本发明的另一个实施例中，涂层组合物中的缓冲溶液可以进一步含有浓度为10至100mM的盐。在本发明的一个优选实施例中，该盐可以为无机盐或有机盐。在更优选的实施例中，无机盐可以为乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠、氢氧化钠、乙酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾或氢氧化钾，有机盐可以为Tris、Bis-Tris、MES、PIPES、MOPS或HEPES。

在本发明的另一个实施例中，涂层组合物中的天然存在的粘附蛋白可以为藤壶粘附蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白或贻贝粘附蛋白。在本发明的优选实施例中，贻贝粘附蛋白可以具有序列ID：13或14的氨基酸序列。在另一个实施例中，贻贝粘附蛋白可以用酪氨酸酶预处理以将酪氨酸残基转化为DOPA残基。

在本发明的另一个实施例中，涂层组合物中的抗菌肽可以为KLWKKWAKKWLKLWKA(序列ID号：16)、FALALKALKKL(序列ID号：17)、ILRWPWWPWRRK(序列ID号：18)、AKRHHGYKRKFH(序列ID号：19)、KWKLFKKIGAVLKVL(序列ID号：20)、LVKLVAGIKKFLKWK(序列ID号：21)、IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK(序列ID号：22)、GIGAVLKVLTTGLPALISWI(序列ID号：23)、SWLSKTAKKGAVLKVL(序列ID号：24)、KKLFKKILKYL(序列ID号：25)、GLKKLISWIKRAAQQG(序列ID号：26)、或GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(序列ID号：27)。

在本发明的另一方面，提供了一种包含本发明的涂层组合物的化妆品粉扑。在本发明的一个优选实施例中，化妆品粉扑可以由以下制得：聚氨酯(PUR)、丙烯腈丁二烯橡胶(NBR)、丁苯橡胶(SBR)、天然橡胶(NR)、聚氯乙烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯丁基橡胶(EVA)、乳胶、硅树脂、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯(SIS)、苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯(SEBS)、聚乙烯醇(PVA)、丁腈橡胶、丁基橡胶、氯丁二烯橡胶、或其组合。

在本发明的另一方面，提供了一种用本发明的涂层组合物涂覆化妆品粉扑的方法。在本发明的优选实施例中，该方法可以包括以下步骤：a)提供本发明的包含抗菌肽的涂层组合物；b)将涂层组合物施加至化妆品粉扑的表面；c)干燥抗菌肽涂覆的粉扑。在本发明的一个实施例中，涂层组合物中抗菌肽的浓度范围为0.01至0.2㎎/ml，更优选为0.02至0.1㎎/ml。在更优选的实施例中，干燥可以在60℃下进行。

在本发明的一个方面，用于化妆品粉扑的新型抗菌涂层剂和制备涂覆有所述抗菌涂层剂的化妆品粉扑的方法，其中所述抗菌肽可以源自人血或蛙皮。

含有DOPA的粘合剂(诸如贻贝粘附蛋白或聚多巴胺)的现有技术要求高pH(至少8或更高)，并添加固化剂(诸如过氧化物)以促进固化，否则至少需要10小时或更长时间进行涂层或附着。

本发明提供了粘合剂组合物和用于抗菌涂覆化妆品粉扑的方法，而无需使用任何调节pH或促进固化的试剂。

在第一方面，提供了一种包含抗菌粘附蛋白的抗菌涂层组合物，其中所述抗菌粘附蛋白在所述粘附蛋白主链中可包含至少1mol％的儿茶酚基团。

在第二方面，提供了一种将抗菌粘合剂涂层施加到化妆品粉扑表面上的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含抗菌粘附蛋白溶液的组合物，b)将组合物施加至要涂覆的表面以在表面上获得抗菌粘合剂涂层，以及c)干燥粘合剂涂层。在本发明的一个实施例中，所述聚合物在所述组合物中的浓度为0.01至0.2㎎/ml，更优选为0.02至0.1㎎/ml。

附图说明

图1表示具有L-多巴胺的抗菌粘附蛋白的快速抗菌涂覆的示意图。L-多巴胺快速吸附到基底表面，并与源自抗菌贻贝粘附蛋白的DOPA反应形成固态且耐久的抗菌涂层。

图2表示来自含醇缓冲溶液的抗菌涂覆的表面的抗菌活性，其中抗菌粘附蛋白以不同浓度溶解。完全抑制了抗菌涂覆的表面上的大肠杆菌(2A)和金黄色葡萄球菌(2B)的生长。

图3表示抗菌涂覆的化妆品粉扑。未观察到抗菌涂覆的表面和对照样品的外观变化。

图4表示抗菌粘附蛋白涂覆的表面的抗菌功效。多巴胺的添加对涂层有利，抗菌效果不受L-DOPA的影响。

图5表示耐久性测试结果。当两个样品均经过3至10个水洗循环时，与市售的抗菌化妆品粉扑(5C)相比，抗菌粘附蛋白涂覆的粉扑(5B)表现出优异的持久抗菌活性。

具体实施方式

本发明直接涉及用于抗菌化妆品粉扑的抗菌粘附蛋白涂层组合物，其中所述抗菌粘附蛋白包括用天然存在的或合成的抗菌肽重组功能化的天然存在的粘附蛋白。本发明中的天然粘附蛋白可以源自贻贝粘附蛋白、藤壶粘附蛋白、纤维蛋白或胶原蛋白。由于其自粘性，与现有技术不同，本发明可不需要任何化学物质即可使化妆品粉扑被涂覆。

本发明中的所述粘附蛋白可以使用任何合适的粘附蛋白，包括但不限于提取的或重组的藤壶粘附蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白或贻贝粘附蛋白。优选地，所述蛋白为重组贻贝粘附蛋白。

本发明中可以使用任何合适的重组贻贝粘附蛋白。市售底物蛋白的示例包括由Kollodis BioSciences，Inc.(北奥古斯塔，南卡罗来纳州)出售的MAPTrix^TM或由BioVitCo.Ltd出售的BV AMP。可选的第三种组分是生物相容性聚合物(例如，聚乙二醇或聚乙烯醇)，可以将其添加到组合物中以增强其诸如物理或机械性能(例如，粘性)的生物相容性，增强涂层工艺。

由Kollodis BioSciences Inc.(北奥古斯塔，南卡罗来纳州)开发的MAPTrix^TM是预先设计的贻贝粘附蛋白，或者基于藤壶的适用于疏水性或亲水性表面涂层。预先设计的MAPTrix^TM由于其分子主链是交替的疏水域和亲水域，所以对于表面涂层非常有利。我们的BV AMP基于用抗菌肽重组功能化的该两亲性粘附蛋白。

近来，发明人开发并测试了抗菌粘附蛋白涂覆的纺织品和化妆品粉扑它们抑制在所述纺织品和化妆品粉扑表面上微生物生长的能力(参见韩国专利申请KR 2017-0084822和美国专利申请US 15/953,055，它们出于所有目的通过引用并入本文，如同在本文中充分阐述)。

MAPTrix^TM是融合蛋白，其包含：贻贝足蛋白FP-5的第一肽，其选自由序列ID号：8-11构成的组，或由序列ID号：15构成的藤壶衍生的粘附蛋白；以及至少一个选自由如下构成的组的第二肽：选自由序列ID号：1-3构成的组的贻贝FP-1、贻贝FP-2(序列ID号：4)、选自由序列ID号：5-6构成的组的贻贝FP-3、贻贝FP-4(序列ID号：7)、贻贝FP-6(序列ID号：12)及其片段，并且第二肽连接到FP-5的C末端、N末端或C-和N-末端。优选地，第二肽是包含序列ID号：3的氨基酸序列的FP-1。更优选地，融合的贻贝粘附蛋白是包含序列ID号：13或14的氨基酸序列的蛋白。重组贻贝粘附蛋白应使用酪氨酸酶处理，以将酪氨酸残基转化为DOPA残基，从而具有较强的粘附性。为了将酪氨酸残基转化为DOPA，将重组贻贝粘附蛋白以0.1㎎/ml溶解在具有0.1M抗坏血酸、pH 5.5的0.1M乙酸钠缓冲液中。加入蘑菇酪氨酸酶至最终浓度为150U/ml，并将混合物在氧气条件和300rpm下培养1小时。如前所述，每ml反应用0.2ml的6N HCl停止酶活性(DS Hwang等人，Appl Environ Microbiol.2004；70(6):3352-3359)。

在本发明中可以使用任何合适的源自生物体或合成设计的抗菌肽。大多数合成的或天然的抗菌肽总体上是阳离子的，有些示例的净电荷高达+9。抗菌肽的阳离子组分和疏水性组分混合使其非常适合与通常呈现阴离子表面、富含脂质(诸如磷脂酰甘油或心磷脂)的微生物细胞质膜相互作用，并对其产生干扰(参见William C.Wimley,Describing theMechanism of Antimicrobial Peptide Action with the Interfacial ActivityModel,ACS Chem Biol.2010；5(10):905-917)。

由于静电相互作用的作用，抗菌肽与微生物膜的结合是显著的，而抗菌肽与动物血浆膜的富含中性磷脂酰胆碱/胆固醇/鞘磷脂的表面的结合较弱。与AMP接触1小时或更长时间后，微生物膜结构彻底破裂。

本发明提供了一种用于化妆品粉扑的抗菌粘附蛋白涂层组合物，其中在不使用任何其他抗菌剂例如银纳米颗粒或抗生素的情况下，充分抑制了微生物污染。微生物污染是化妆品适配件(adaptor)(例如化妆品粉扑)中的主要问题。污染可来自使用者及其周围环境。抗菌粘附蛋白涂覆的表面能够通过提供仅作用于微生物膜表面而不作用于人细胞质膜的抗菌肽来防止这种微生物污染。抗菌涂层组合物包含作为粘附蛋白的贻贝粘附蛋白，该贻贝粘附蛋白被一种或两种抗菌肽官能化，该抗菌肽可以重组引入所述粘附蛋白的C末端、N末端或C末端和N末端两者。抗菌肽可以选自KLWKKWAKKWLKLWKA(序列ID号：16)、FALALKALKKL(序列ID号：17)、ILRWPWWPWRRK(序列ID号：18)、AKRHHGYKRKFH(序列ID号：19)、KWKLFKKIGAVLKVL(序列ID号：20)、LVKLVAGIKKFLKWK(序列ID号：21)、IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK(序列ID号：22)、GIGAVLKVLTTGLPALISWI(序列ID号：23)、SWLSKTAKKGAVLKVL(序列ID号：24)、KKLFKKILKYL(序列ID号：25)、GLKKLISWIKRAAQQG(序列ID号：26)、GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR(序列ID号：27)。

在一个实施例中，提供了用于抗菌化妆品粉扑的涂层组合物，其包含用抗菌肽KLWKKWAKKWLKLWKA(序列ID号：16)功能化的贻贝粘附蛋白，以抑制化妆品粉扑表面上的细菌生长。在另一个实施例中，提供了用于抗菌化妆品粉扑的涂层组合物，其包含分别用抗菌肽KLWKKWAKKWLWLKLWKA(序列ID号：16)和AKRHHGYKRKFH(序列ID号：19)功能化的贻贝粘附蛋白，以抑制化妆品粉扑表面上细菌的大范围生长。

在PCT/KR2016/008677、KR 10-2015-0179898和PCT/KR2017/002980专利申请中公开了所述抗菌粘附蛋白的制备方法，这些专利申请的全部内容通过引用并入本文。

本发明还涉及用于化妆品粉扑的抗菌涂层组合物。根据本发明，提供了涂覆有抗菌粘附蛋白的抗菌化妆品粉扑。该抗菌涂层组合物可以施加至由如下制得的任何化妆品粉扑：聚氨酯(PUR)、丙烯腈丁二烯橡胶(NBR)、丁苯橡胶(SBR)、天然橡胶(NR)、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯(SIS)、苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯(SEBS)、聚乙烯醇、丁腈橡胶、丁基橡胶、氯丁二烯橡胶或其组合。在一个实施例中，提供了一种用于自动固化抗菌粘附蛋白的组合物的方法。酶法处理抗菌贻贝粘附蛋白，以将酪氨酸残基转化为DOPA残基，然后冷冻干燥，将含有DOPA的抗菌粘附蛋白以0.1％至3％(wt/wt)，更优选以0.1至0.3％(wt/wt)的浓度溶解在蒸馏水中。

在另一个实施例中，提供了一种在不考虑pH的情况下快速固化抗菌粘附蛋白的组合物的方法。

在现有技术中，众所周知的是，当含有DOPA残基的聚合物或蛋白质的pH升高到约5以上时，DOPA会自动氧化为多巴醌。众所周知，这种自动氧化在较高的pH下更快。在含有DOPA的蛋白质粘合剂基的组合物中，低pH会使粘合剂固化太慢。提高粘附速度的先前策略是提高pH(如WO 2003/051418中所公开的)、降低pH并使用浓溶液(如WO 2004/005421中所公开的)、或添加高碘酸盐离子(如WO 2003/080137中所公开的)。

在pH 8.5的缓冲聚多巴胺溶液中制备了贻贝胶粘蛋白产生的聚多巴胺涂层。在聚多巴胺中涂覆各种底物的培养时间约为18h，这是一种非常低效的方法(参见See Sileika等人,Antibacterial performance of polydopamine-modified polymer surfacescoating passive and active component,ACS Appl.Mater.Interfaces,2011,3(12),4602-4610)。为了快速固化，多巴胺的自聚合速度随着温度从20℃升高至60℃而增加。(参见Zhou P等人,(2014)Rapidly-deposited polydopamine coating via hightemperature and vigorous stirring:formation,characterization andbiofunctional evaluation.PLoS ONE 9(11):e113087)。

为了快速固化，需要快速蒸发缓冲液以促进DOPA自动氧化成多巴醌以进行交联反应。随着缓冲溶液的蒸发，我们得到了浓缩的含有DOPA的溶液。此外，加热含有浓DOPA的溶液可以使其快速固化。

可以使用任何含醇的缓冲液来制备用于快速蒸发的抗菌粘附蛋白涂层溶液。例如，在本发明中可以使用乙醇、丙醇、异丙醇。优选地，使用含有乙醇的缓冲液来制备用于使化妆品粉扑被快速涂覆的抗菌粘附蛋白涂层组合物。醇的百分比范围从10％到90％。优选地，缓冲液中的乙醇含量范围为50％至70％。在一个实施例中，提供一种抗菌组合物，该抗菌组合物包含溶解在70％乙醇缓冲液中的0.05㎎抗菌粘合蛋白，以在30分钟内制成涂覆的化妆品粉扑。当加热到60℃时，用于涂覆化妆品粉扑的培养时间减少至5分钟，而不会损失抗菌活性。

本发明提供了一种作为涂层组合物的缓冲的抗菌粘附蛋白，其包含基于钠盐如乙酸钠或碳酸氢钠的缓冲液，其中抗菌粘附蛋白以0.02至0.1㎎/ml的浓度溶解。

本发明还提供了包含醇的缓冲溶液，其包含至少一种可以促进抗菌涂层的盐。一些盐(例如乙酸钠)会导致贻贝粘附蛋白聚集形成纳米级至微米级的颗粒，这些颗粒涂覆在化妆品粉扑的表面上。涂层溶液的快速蒸发使抗菌粘合蛋白颗粒迅速涂覆在化妆品粉扑表面上。上述盐选自乙酸钠(CH₃COONa)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、碳酸钠(Na₂CO₃)、磷酸钠(Na₃PO₄)、氢氧化钠(NaOH)、乙酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾和氢氧化钾。在一个实施例中，抗菌粘附蛋白在涂层组合物中的浓度为0.02至0.1㎎/ml，其中抗菌粘附蛋白溶解于10mM乙酸钠缓冲液(其中乙醇50wt％)中。

本发明还提供了一种组合物，其包含溶解在基础缓冲液或含醇缓冲液中的抗菌粘附蛋白和L-多巴胺。在一个实施例中，将L-多巴胺溶解在抗菌粘附蛋白溶液中，其中L-多巴胺的浓度范围为0.001㎎/ml至0.1㎎/ml。

本发明提供了将抗菌粘附蛋白涂层施加到化妆品粉扑表面上的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供抗菌涂层组合物，其包含溶解在醇缓冲液中的抗菌粘合蛋白，其中所述聚合物在所述组合物中的浓度范围为0.01至0.2㎎/ml，更优选为0.02至0.1㎎/ml，

b)将涂层组合物施加到待涂覆表面，以在化妆品粉扑的至少一部分表面上获得抗菌涂层，以及

c)干燥抗菌粘附蛋白涂覆的化妆品粉扑。

本发明提供了一种在10分钟内快速固化的、在化妆品粉扑表面上快速涂覆抗菌涂层的方法。本发明提供了将抗菌粘附蛋白涂层施加到化妆品粉扑表面上的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含抗菌粘附蛋白的含醇溶液的组合物，并且其中所述聚合物在所述组合物中的浓度范围为0.01至0.2㎎/ml，更优选为0.02至0.1㎎/ml，

b)将组合物施加到化妆品粉扑的表面，以及

c)将涂覆有粘合剂的化妆品粉扑在60℃下干燥。

提供以下示例以说明本发明的优选实施例，并且本发明并不旨在由本文所述的具体实施例限制范围，这些实施例仅出于举例说明的目的。如本文所述，功能上等效的产品、组合物和方法显然也在本发明的范围内。

示例

示例1.编码与抗菌肽融合的贻贝粘附蛋白的表达载体的构建

设计表达载体，以在重组贻贝粘附蛋白的C-末端引入抗菌肽。编码抗菌肽的核酸购自Cosmogentec Co.Ltd.(韩国，首尔)。将构建的表达载体转染到大肠杆菌BL21(DE3)中，表1列出了在贻贝粘附蛋白的C末端引入的抗菌肽。

[表1]

引入贻贝粘附蛋白的抗菌肽序列

示例2.抗菌贻贝粘附蛋白的制备

2.1蛋白表达

在LB培养基(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白和10g/L NaCl)中培养大肠杆菌BL21(DE)，并且当培养液的光密度在600nm处为0.6时将IPTG加入至最终浓度为1mM，从而诱导重组抗菌肽融合的贻贝粘附蛋白的表达。将大肠杆菌BL21(DE)培养物以13,000rpm离心4至10分钟以获得细胞聚合体，并将其保存在-80℃下。

将细胞聚合体重新悬浮于100μl的SDS-PAGE缓冲液(pH 6.8的0.5M Tris-HCl，10％甘油，5％SDS，5％β-巯基乙醇，0.25％溴酚蓝)中，在100℃下煮沸5分钟使其变性。对于SDS-PAGE分析，将样品在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后使用考马斯蓝染色检测蛋白条带。

2.2纯化

将示例2.1的细胞聚合体与包含2.4g/L磷酸二氢钠、5.6g/L磷酸氢二钠、10mMEDTA和1％Triton X-100的裂解缓冲液一起搅拌，并使用高压均质器破裂。将裂解物通过离心过滤器单元以9,000rpm离心20分钟，得到含有贻贝粘附蛋白的不溶性蛋白复合物。在相同条件下(9,000rpm，20分钟)，以25％(v/v)的乙酸浓度将从不溶性复合物中洗脱的表面活性剂粘附蛋白离心，以获得上清液。通过加入10N NaOH，在相同条件下(9,000rpm，20分钟)在pH 12.8下将获得的上清液离心。使用乙酸在pH 6～7下中和上清液，然后在相同条件下离心以取得沉淀的贻贝粘附蛋白。将沉淀物溶解在蒸馏水中，进行冷冻干燥，得到纯度为90％的冻干贻贝粘附蛋白。

2.3酪氨酸残基酶促转化为DOPA残基

将冻干的表面活性剂贻贝粘附蛋白溶解在含有20mM抗坏血酸和20mM硼酸钠的0.1M乙酸盐缓冲液中至浓度为1㎎/ml，然后通过向该溶液中加入氧气使表面活性剂粘附蛋白溶液用氧气饱和30分钟。每抗菌粘附蛋白加入40～1μg酪氨酸酶(优选40～1μg每粘附蛋白)后，将其在氧气条件下振摇一小时。一小时后，通过向溶液中加入5％乙酸来终止化学改性反应。将终止的表面活性剂粘附蛋白溶液冷冻干燥以获得冻干粉末。通过该过程，将粘附蛋白的酪氨酸残基改性为DOPA。

示例3.抗菌贻贝粘附蛋白涂覆的化妆品粉扑的制备

将示例2.3制得的抗菌粘附蛋白溶解在蒸馏水中，以分别形成1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的抗菌涂层溶液。通过1)喷涂和2)浸涂，涂覆聚氨酯基化妆品粉扑，然后在室温下在洁净工作台上干燥。对于浸涂，将化妆品粉扑样品分别浸入抗菌涂层溶液中30分钟、6小时和12小时，然后在室温下在洁净工作台上干燥。

示例4.抗菌化妆品粉扑的抗菌活性测定

为了评估示例3中制备的抗菌化妆品粉扑对SA(金黄色葡萄球菌)的抗菌效果，制备含有1×10⁴CFU/ml金黄色葡萄球菌的PBS，并将这些生物体分别向各个样品中接种18h。根据作为标准方案的KS K 0693进行了抗菌评估。作为对照样品，使用由InnisfreeCo.Ltd.制造和销售的市售粉扑进行比较。

[表2]

各种条件下的抗菌涂覆的粉扑的抗菌活性总结

条件	样品(BioVit)	对照(Innisfree)
			原样	99.9％	99.9％
水洗，×3	99.9％	99.9％
			清洁剂洗，×3	93.9％	78.9％

在比较试验中观察到，与Innisfree的商业产品相比，抗菌粘附蛋白涂覆的粉扑显示出优异的抗菌活性，并且可以解决耐久性问题。现有的产品(例如Innisfree产品)通常是基于银纳米颗粒的产品，并且从化妆品粉扑中连续释放银纳米颗粒会引起耐久性问题。

示例5.高速抗菌涂层组合物

制备了两种不同浓度的抗菌粘附蛋白的各种涂覆条件，总结于下表3中。

[表3]

将70ml的纯乙醇(SigmaAldrich，美国圣路易斯)与30ml的蒸馏水混合制备70体积％的乙醇溶液。将5㎎在C-末端具有序列KLWKKWAKKWLKLWKA(序列ID号：16)的抗菌粘附蛋白溶解在50ml的70体积％的乙醇缓冲液中，制成0.1㎎/ml的抗菌粘附蛋白涂层溶液，然后通过添加另外的70体积％的乙醇缓冲溶液稀释至0.05㎎/ml和0.025㎎/ml。从SigmaAldrich(美国圣路易斯)购买98％盐酸多巴胺，并原样使用。将L-多巴胺溶解在70体积％的乙醇缓冲溶液中，分别制成0.01㎎/ml、0.1㎎/ml和1㎎/ml的多巴胺溶液。首先，将多巴胺溶液(1ml)施加到聚苯乙烯皮氏培养皿的疏水性表面以增加可湿性，并将抗菌贻贝粘附蛋白快速引入到疏水性聚苯乙烯皮氏培养皿的多巴胺涂覆的表面上。将抗菌粘附蛋白涂层溶液(3ml)加入到每个皮氏培养皿中用于涂覆。培养10分钟后，从皮氏培养皿中除去涂层溶液，并将涂覆的皮氏培养皿在室温下干燥30分钟。所得的干燥皮氏培养皿用于进一步的抗菌活性分析。在图2中示出抗菌涂覆的表面的抗菌效果，其中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长被完全抑制。

示例6.涂覆的表面的抗菌活性测定

使用革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)和***金黄色葡萄球菌(SA)评估示例5中制备的涂覆的表面的抗菌活性。根据JIS Z2801：2000确定涂覆的表面的抗菌活性，如Haldar等人在Nature Protocols 2007，2(19)，2412中描述的。基本上，JIS Z 2801：2000通常表示为由在处理过的表面上菌落形成单位(CFU)的Log10数和未处理过的表面上测得的菌落形成单位(CFU)的Log10数两者之间的差值计算得出的抗菌值。

如图4A中的大肠杆菌和图4B中的SA所示，两种细菌的生长均被完全抑制，这表明添加多巴胺不会影响抗菌功效，而多巴胺涂覆的表面可能有助于/加快抗菌剂粘附蛋白对感兴趣的表面的涂覆。

示例7.室温下对粉扑表面的抗菌涂覆

如示例5所述制备抗菌涂层溶液和多巴胺溶液。

分别将制备的5ml的涂覆溶液分配到单独的60mm×15mm的聚苯乙烯皮氏培养皿中。由Dessin生产和销售的基于聚氨酯泡沫的化妆品粉扑是从韩国首尔的一家便利店购买的。将每个化妆品粉扑浸入多巴胺溶液中，然后立即分别浸入抗菌涂层溶液中10秒、30秒、60秒和180秒。浸涂后，将所有粉扑在60℃干燥10分钟。

如图4所示，在涂覆的化妆品粉扑中未观察到颜色变化。

示例8.高速抗菌化妆品粉扑的抗菌活性测定

根据JIS Z 2801，对根据示例7制备的一系列涂覆有抗菌粘附蛋白的化妆品粉扑进行抗菌测试。

用大肠杆菌接种粉扑后，计数细菌的菌落形成单位(CFU)。如图5所示，裸化妆品粉扑(对照)没有抑制细菌的生长，而抗菌化妆品粉扑在短的涂覆时间内显示出显著地抑制了细菌的生长。

即使在该测试中不能完全抑制细菌的生长，也可以通过增加涂覆时间或增加抗菌粘附蛋白的浓度来增强抗菌功效，如示例6中所示。

示例9.耐久性测试

将根据示例7制备的抗菌涂覆的化妆品粉扑切成4cm×4cm，并暴露于不同数量的有或没有洗涤剂的水洗循环(3次和10次)。使用可商购的抗菌化妆品粉扑作为对照。一个水洗循环相当于用洗衣机进行一次家庭洗涤。

按照示例8所述的程序进行抗菌活性的测定，结果示于图中；5A中是没有抗菌涂层的粉扑，5B中是抗菌粘附蛋白涂覆的粉扑，5C中是商用抗菌粉扑。没有抗菌涂覆的粉扑显示细菌生长，而两种抗菌化妆品粉扑抑制了细菌生长。水洗后，取决于洗涤循环的次数，抗菌粘附蛋白涂覆的粉扑即使在10次水洗后也显示出显著的抗菌活性，而商用抗菌粉扑则显示出较小的抗菌活性。

<110> 拜欧维特股份有限公司

<120> 用于快速合成抗菌化妆品粉扑的生物相容性组合物

及其制备方法

<130> 2018-OPA-1460/PCT

<150> KR 10-2017-0084822

<151> 2017-07-04

<160> 27

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 衍生自足蛋白1（FP-1，可食贻贝）的串联重复十肽的模型肽

<400> 1

Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 衍生自足蛋白1（FP-1，可食贻贝）的2次重复序列

<400> 2

Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro

1 5 10 15

Pro Thr Tyr Lys

20

<210> 3

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 衍生自足蛋白1（FP-1，可食贻贝）的6次重复序列

<400> 3

Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro

1 5 10 15

Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys

20 25 30

Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr

35 40 45

Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys

50 55 60

<210> 4

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 足蛋白型2（FP-2，加州贻贝）的部分序列

<400> 4

Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly Arg Cys

1 5 10 15

Tyr Pro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Ser Gly Pro Thr Cys Ala Cys

35

<210> 5

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 足蛋白型3 (FP-3，可食贻贝)

<400> 5

Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys

20 25 30

Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr

35 40 45

Glu Phe Glu Phe

50

<210> 6

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 足蛋白型3 （FP-3，地中海贻贝：mgfp-3A）

<400> 6

Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp

20 25 30

Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr

35 40 45

<210> 7

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 来自足蛋白型4的部分序列（加州贻贝）

<400> 7

Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His

1 5 10 15

Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His

20 25 30

Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val

35 40 45

Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His

50 55 60

<210> 8

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 足蛋白型5 (FP-5，可食贻贝)

<400> 8

Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His

1 5 10 15

Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr

20 25 30

Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys

35 40 45

Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg

50 55 60

Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser

65 70 75

<210> 9

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 足蛋白5 (FP-5，可食贻贝)

<400> 9

Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His

1 5 10 15

Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr

20 25 30

Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys

35 40 45

Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg

50 55 60

Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser

65 70 75

<210> 10

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 足蛋白5 (FP-5，厚壳贻贝)

<400> 10

Tyr Asp Asp Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

Pro Ser Gly Ser His Trp His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr

20 25 30

Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Phe Lys Arg Thr Gly Lys Tyr

35 40 45

Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys

50 55 60

His Tyr Gly Gly Ser Ser Ser

65 70

<210> 11

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 贻贝粘附蛋白足蛋白型5来自（地中海贻贝）

<400> 11

Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His

1 5 10 15

Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr

20 25 30

Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys

35 40 45

Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg

50 55 60

Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser

65 70 75

<210> 12

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 贻贝粘附蛋白足蛋白型6

<400> 12

Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg Ser

1 5 10 15

Gly Tyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Lys Tyr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro Arg

35 40 45

Asn Pro Tyr Gly Arg Val Lys Tyr Tyr Cys Thr Lys Lys Tyr Ser Cys

50 55 60

Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn

65 70 75 80

Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr Asn Gly Cys Cys Leu Arg

85 90 95

Ser Gly Tyr

<210> 13

<211> 194

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 混合贻贝粘附蛋白（基于FP-151、MEFP-5：Kollodis）

<400> 13

Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro

1 5 10 15

Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys

20 25 30

Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr

35 40 45

Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu

50 55 60

Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly

65 70 75 80

Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr

85 90 95

Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys

100 105 110

Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys

115 120 125

Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys

130 135 140

Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro

145 150 155 160

Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys

165 170 175

Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr

180 185 190

Tyr Lys

<210> 14

<211> 196

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 混合贻贝粘附蛋白（基于FP-151、MGFP-5）

<400> 14

Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro

1 5 10 15

Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys

20 25 30

Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr

35 40 45

Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu

50 55 60

Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly

65 70 75 80

Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr

85 90 95

Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys

100 105 110

Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys

115 120 125

Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr

130 135 140

Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys

165 170 175

Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro

180 185 190

Pro Thr Tyr Lys

195

<210> 15

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 来自Semibalanus balanoides的粘附肽

<400> 15

Met Arg Val Ile Leu Phe Ala Met Leu Ile Gly Gly Ser Leu Ala Cys

1 5 10 15

Gln Asn Arg Leu Glu Thr Leu Val Gln Glu Ala Thr Gly Asn Ala Gly

20 25 30

Asp Leu Ser Thr Asn Val His Glu Glu Cys Asn Ser Gln Val Gly Thr

35 40 45

Phe Asn Ala Val His Ala Pro Gln

50 55

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽（KLWKKWAKKWLKLWKA）

<400> 16

Lys Leu Trp Lys Lys Trp Ala Lys Lys Trp Leu Lys Leu Trp Lys Ala

1 5 10 15

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽（FALALKALKKL）

<400> 17

Phe Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Leu

1 5 10

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽(ILRWPWWPWRRK)

<400> 18

Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽(AKRHHGYKRKFH)

<400> 19

Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys Phe His

1 5 10

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽(KWKLFKKIGAVLKVL)

<400> 20

Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu

1 5 10 15

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽(LVKLVAGIKKFLKWK)

<400> 21

Leu Val Lys Leu Val Ala Gly Ile Lys Lys Phe Leu Lys Trp Lys

1 5 10 15

<210> 22

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽(IWSILAPLGTTLVKLVAGIGQQKRK)

<400> 22

Ile Trp Ser Ile Leu Ala Pro Leu Gly Thr Thr Leu Val Lys Leu Val

1 5 10 15

Ala Gly Ile Gly Gln Gln Lys Arg Lys

20 25

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽(GIGAVLKVLTTGLPALISWI)

<400> 23

Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu

1 5 10 15

Ile Ser Trp Ile

20

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽(SWLSKTAKKGAVLKVL)

<400> 24

Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Gly Ala Val Leu Lys Val Leu

1 5 10 15

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽(KKLFKKILKYL)

<400> 25

Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Tyr Leu

1 5 10

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽(GLKKLISWIKRAAQQG)

<400> 26

Gly Leu Lys Lys Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Ala Ala Gln Gln Gly

1 5 10 15

<210> 27

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 抗菌肽

(GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR)

<400> 27

Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln His

1 5 10 15

Thr Arg Asp Ala Thr Ile Gln Gly Leu Gly Ile Ala Gln Gln Ala Ala

20 25 30

Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg

35