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工程化多肽及其在合成β-羟基-α-氨基酸中的应用

文档序号：1409163 发布日期：2020-03-06 浏览：27次 >En<

阅读说明：本技术 工程化多肽及其在合成β-羟基-α-氨基酸中的应用 (Engineered polypeptide and application thereof in synthesis of β -hydroxy- α -amino acid ) 是由陈海滨黄勇开徐青周阿蒙沈天然杨家栋杨朱红于 2018-05-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了可用于在工业相关条件下不对称合成β-羟基-α-氨基酸的工程化多肽,这些工程化多肽是以催化合成(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的能力为指标,进过定向进化过程开发而得到的。本公开内容还提供了编码工程化多肽的多核苷酸、能够表达工程化多肽的宿主细胞和使用工程化多肽产生β-羟基-α-氨基酸的方法。与其他制备方法相比,使用本发明的工程化多肽用于β-羟基-α-氨基酸的制备,所得产物中立体异构体纯度高,反应条件温和,污染小,能耗低,因此具有很好的工业应用前景。(The invention provides engineered polypeptides for asymmetrically synthesizing β -hydroxy- α -amino acid under industrially relevant conditions, which are obtained by developing a directed evolution process with the ability of catalytically synthesizing (2S,3R) -2-amino-3-hydroxy-3- (4-nitrophenyl) propionic acid as an index, polynucleotides encoding the engineered polypeptides, host cells capable of expressing the engineered polypeptides and a method for producing β -hydroxy- α -amino acid by using the engineered polypeptides.)

工程化多肽及其在合成β-羟基-α-氨基酸中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种工程化醛缩酶多肽及其在工业生物催化中的应用。

背景技术

β-羟基-α-氨基酸是一类重要的氨基酸，是构筑多种天然产物和药物的重要中间体，其本身也具有很多重要的生物活性。该类化合物的化学结构上一般具有两个手性中心，存在有多个立体异构体(如图1所示)。(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸(如图2所示结构式A2的化合物)就是一种β-羟基-α-氨基酸，并且可以作为合成精制左旋氨基物的中间体。

目前精制左旋氨基物的合成工艺，主要有两条路线：分别以对硝基苯甲醛和对硝基苯乙酮为起始原料。第一条路线以对硝基苯甲醛为起始原料的工艺，路线短，原子经济性强，所需的物料品种和设备少，备受关注。但是合成过程中，由于异构体结构的选择，需要过量的对硝基苯甲醛，消耗较大；且还原剂硼氢化钙价格昂贵、不易得。所以目前实际生产中主要采用第二条路线，对硝基苯乙酮经溴化、胺化、酰基化、甲醛缩合、还原、水解得到消旋体，随后用酒石酸拆分得到精制左旋氨基物。该过程用到大量刺激性有机溶剂如醋酐、氯苄、醋酸、溴素，使得环境影响较大，生产现场的控制难度增加。且合成过程用到保护、脱保护、拆分等冗长繁琐。而最终产品往往需要化学拆分，总收率偏低。而且随着环保要求的逐步提高，对生产厂家而言，解决劳动保护和“三废”治理就成为棘手的问题。

据报道，醛缩酶可以将醛类化合物和氨基酸类化合物缩合生成β-羟基-α-氨基酸，虽然酶催化反应条件温和、污染小，但野生型酶的其立体选择性还是达不到工业化应用的要求。本发明以一个野生型的醛缩酶为起点，经过基因工程的改造以及针对(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的筛选，开发出了一系列高立体选择性的工程化多肽。本发明所公开的酶催化法，以对硝基苯甲醛为起始原料，利用工程化醛缩酶作为催化剂将对硝基苯甲醛与甘氨酸直接缩合而成(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸，这样进过一步反应就确定两个手性中心。(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸可以再通过酯化、还原直接得到左旋氨基物。这整个过程简单易操作，且不需要化学拆分，有效降低生产成本。同时酶催化的反应过程条件温和，无需强酸、强碱、高温或高压的环境，减轻了对生产设备的要求，能有效保障产品质量，有利于实现生产的连续化、自动化和提高劳动生产率。

图1β-羟基-α-氨基酸(*指手性中心)。

图2通过本发明工程化醛缩酶多肽催化的不对称反应合成A2。

发明内容

1.概述

本发明提供了一种立体选择性高、催化活性高、稳定性好的工程化醛缩酶多肽，能够不对称地合成β-羟基-α-氨基酸，特别是不对称地合成(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。还提供了工程化多肽的基因，含有该基因的重组表达载体，工程菌株及其高效制备方法，以及使用工程化多肽不对称合成β-羟基-α-氨基酸的反应工艺。

本发明的第一方面提供了一种改进的工程化醛缩酶多肽。这种工程化多肽是由一种对产物立体选择性不高的野生型的醛缩酶经过人为的定向进化过程的改造，发生一定数量的氨基酸残基置换、***或缺失等突变而来。野生型的醛缩酶源自于Pseudomonasputida，由357个氨基酸组成，其序列如SEQ ID No：2所示。该野生型的醛缩酶对产物的立体选择性不高，经过发明人检测，使用SEQ ID No：2将图2中的对硝基苯甲醛(即A1)与甘氨酸转化形成的产物中，A2的非对映体过量数值de≤40％。

在一些实施方案中，本公开内容中改进的醛缩酶多肽能够以至少等于或大于SEQID No：2对A2的立体选择性将A1与甘氨酸转化为A2。在指定的反应条件下，本公开内容中改进的醛缩酶多肽能够形成至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大非对映体过量的A2。在一些实施方案中，反应条件包括温度为30℃、20％的有机溶剂(包括但不限于二甲基亚砜，乙醇或甲醇)，pH约为6.0.

在一些实施方案中，在指定的反应条件下，改进的醛缩酶多肽能够以比SEQ IDNO：2的多肽更高的立体选择性转化A1与甘氨酸为A2，并包括与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236的参考序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。

两条氨基酸序列或两条核苷酸序列之间的同一性均可通过本领域常用的算法得到，可采用NCBI Blastp和Blastn软件根据默认参数计算得到，也可采用采用Clustal W算法(Nucleic Acid Research,22(22):4673-4680,1994)。比如用采用Clustal W算法，SEQID NO：2与SEQ ID NO：184的氨基酸序列同一性为93.3％。

在一些实施方案中，改进的醛缩酶多肽可包括在对应以下的残基位置与SEQ IDNO：2序列相比的一个或多个残基差异的氨基酸序列：X16，X17，X19，X26，X32，X33，X37，X38，X39，X41，X42，X43，X44，X45，X46，X47，X48，X49，X91，X92，X118，X132，X134，X154，X164，X168，X176，X182，X185，X189，X191，X216，X217，X218，X227，X234，X237，X244，X247，X262，X282，X284，X285，X288，X291，X292，X293，X294，X295，X302，X305，X316，X318，X319，X320，X324，X352；更具体的，改进的醛缩酶多肽包括包含以下特征至少之一的氨基酸序列(这些特征是以SEQ ID NO：2为参考序列的氨基酸残基的置换)：D16E，N17G，N17E，A19W，A19N，A26V，A26L，H32V，S33N，A37T，A37M，A37K，G38D，G38P，G38S，G38E，G38A，P39L，P39A，G41Y，T42M，D43P，D43Y，E44D，L45I，T46H，A47H，Q48L，V49S，P91H，P91S，P91L，P91K，P91N，A92W，P118R，P118I，P118G，R132S，K134Q，V154G，V154S，V154A，V154F，V154R，E164R，D168N，G176P，S182A，A185T，V189S，L191H，V216C，L217W，A218C，A218S，T227P，S234R，R237T，S244I，S244V，M247Y，M247H，L262I，E282R，E282Y，E282K，L284K，L284F，L284A，L284V，G285P，G285S，G285K，E288I，E288T，G291F，G291V，G291W，G291Y，G292K，G292V，T293P，E294K，E294M，A295G，A295Q，L302M，A305T，A305P，G316K，G316S，G316V，G316R，Y318G，Y318L，H319Y，H319V，D320K，D320E，P324L，D352Y，D352Q，D352A；或同时在这些差异的基础上，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24、25或30个氨基酸残基的***或缺失。

更具体的，在一些实施方案中，在SEQ ID NO：2基础上进一步改进的工程化醛缩酶多肽包括对应SEQ ID No：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236所示序列的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了编码工程化醛缩酶多肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸可以是具有用于表达工程化醛缩酶多肽的一种或多种控制序列的表达载体的部分。在一些实施方案中，多核苷酸可包括对应SEQ ID No：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235所示序列的多核苷酸序列。

如本领域技术人员所知，由于核苷酸密码子的简并性，编码SEQ ID No：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236的氨基酸序列的核酸序列不仅仅局限于SEQ ID No：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235。本发明的醛缩酶基因的核酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。

在另一方面，本公开内容提供包含编码工程化醛缩酶的多核苷酸或能够表达工程化醛缩酶的表达载体和宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是细菌宿主细胞，比如大肠杆菌。宿主细胞可用于表达和分离本文所述的工程化醛缩酶，或可选地直接用于反应转化底物为产物。

在一些实施方案中，以完整细胞、粗提取物、分离的多肽或纯化的多肽形式的工程化醛缩酶可单独使用，或以固定化形式(比如固定在树脂上)使用。

本公开内容还提供了使用本文公开的工程化醛缩酶多肽不对称合成β-羟基-α-氨基酸化合物的方法，所得到的β-羟基-α-氨基酸产物具有结构式(I)所示的结构：

所述结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物在标为*的手性中心具有所示的立体化学构型；所示结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物与相应的非对映异构体相比过量，其中

R¹是任选地取代的芳基或杂芳基，或是任选地取代的C₁-C₈烃基；

R²是-H、-CH₂OH、-CH₂SH、-CH₂SCH₃或任选地取代的C₁-C₄烃基，所述方法包括在适于转化醛底物和氨基酸底物为β-羟基-α-氨基酸产物的反应条件下，将结构式(II)的醛底物和结构式(III)的氨基酸底物：

与醛缩酶多肽接触，其中所述醛缩酶多肽是本文所述的工程化醛缩酶多肽。在一些实施方案中，所述工程化醛缩酶多肽与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并能够以与SEQ ID NO：2相比更高的转化率或更高的立体选择性缩合结构式(II)的醛底物和结构式(III)的氨基酸底物为结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物。

在一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物以至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的非对映体过量产生。

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是：

其中R³是C₁-C₄烃基、-H、卤素(如-F、-Cl、-Br和-I)、-NO₂、-NO、-SO₂R’或-SOR’、-SR’、-NR’R’、-OR’、-CO₂R’或-COR’、-C(O)NR’、-SO₂ NH₂或-SO NH₂、-CN、CF₃，其中每个R’独立地选自-H或(C₁-C₄)烃基；

R³也可以是

R²是-H、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂OH、-CH₂SH或-CH₂SCH₃，且结构式(II)的醛底物是：

在一些实施方案中，R³在苯基环的对位。在一些实施方案中，R³在苯基环的间位。在一些实施方案中，R³在苯基环的邻位。在一些实施方案中，R³同时在苯基环的对位和间位。在一些实施方案中，R³同时在苯基环的对位和邻位。在一些实施方案中，R³同时在苯基环的间位和邻位。

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是：

其中R⁴是如以上定义的R³，R³和R²如上定义，且结构式(II)的醛底物是：

在一些实施方案中，R³在苯基环的间位。在一些实施方案中，R³在苯基环的邻位。

在一些实施方案中，改进的工程化醛缩酶多肽可以用在制备非对映体过量的式A2化合物(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的方法中：

在这些实施方案中，所述方法包括在适于转化式A1化合物为式A2化合物的反应条件下，在适当的有机溶剂中，在甘氨酸存在下，将结构式A1：

与本文公开的改进的工程化醛缩酶多肽接触的步骤。

在以上方法的一些实施方案中，式(I)化合物或式A2化合物以至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大非对映体过量产生。

用于该方法的工程化的醛缩酶多肽的具体实施方案在详述中进一步提供。可用在以上方法中的改进的工程化醛缩酶多肽可包括选自对应SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236的氨基酸序列。

在另一方面，本公开内容提供利用本文公开的工程化醛缩酶制备(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的方法。在一些实施方案中，该方法包括在适于转化对硝基苯甲醛为(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的反应条件下，在甘氨酸存在下，将对硝基苯甲醛与本文所述的工程化醛缩酶接触。

如本文公开的使用工程化多肽用于制备式(I)化合物或式A2化合物的方法中的任一种可在一系列合适的反应条件下被执行，所述一系列合适的反应条件包括但不限于氨基供体、pH、温度、缓冲液、溶剂系统、底物载量、多肽载量、辅因子载量、压力和反应时间的范围。例如，在一些实施方案中，制备式(I)化合物或式A2化合物可被执行，其中合适的反应条件包括：(a)约10g/L至200g/L底物化合物(例如，化合物(II)或A1)的底物载量；(b)约0.5g/L至10g/L工程化多肽；(c)约30g/L至300g/L的甘氨酸载量；(d)约0.1mM至5mM的PLP辅因子浓度；(e)约0％(v/v)至约60％(v/v)的有机溶剂，这里所述的有机溶剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸异丙酯、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇(IPA)；(f)约4.0至约8.0的pH；和(g)约10℃至60℃的温度。

在一些实施方案中，该方法能够形成至少60％对映体过量的产物(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。

在一些实施方案中，该方法能够形成至少70％对映体过量的产物(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。

在一些实施方案中，该方法能够形成至少80％对映体过量的产物(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。

在一些实施方案中，该方法能够形成至少85％对映体过量的产物(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。

在一些实施方案中，该方法能够形成至少90％对映体过量的产物(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。

在一些实施方案中，该方法能够形成至少95％对映体过量的产物(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。

在一些实施方案中，该方法能够形成至少99％对映体过量的产物(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸。

2.详述

2.1定义

关于本公开内容，除非另外明确定义，否则本文说明书中使用的技术术语和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用，表示由酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，而不论长度或翻译后修饰(如，糖基化、磷酸化、脂质化、豆蔻酰化、泛素化等等)。该定义包括D-氨基酸和L-氨基酸、以及D-氨基酸和L-氨基酸的混合物。

“工程化醛缩酶”、“工程化醛缩酶多肽”、“改进的醛缩酶多肽”和“工程化多肽”在本文可互换使用。

“多核苷酸”和“核酸”在本文可互换使用。

如本文使用的“辅因子”指在催化反应中与酶联合起作用的非蛋白化合物。如本文使用的，“辅因子”意图包括维生素B6家族化合物PLP、PN、PL、PM、PNP和PMP，其有时也被称作辅酶。

“磷酸吡哆醛”、“PLP”、“吡哆醛5’-磷酸”、“PYP”和“P5P”在本文可互换地使用，来指在醛缩酶反应中用作辅因子的化合物。

“编码序列”指编码蛋白的氨基酸序列的核酸部分(例如，基因)。

“天然存在的”或“野生型”是指在自然界发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中、可分离自自然界中的来源且未通过人工操作有意地修饰的序列。

“重组的”或“工程化的”或“非天然存在的”当用于指例如细胞、核酸或多肽时，是指如下材料或与该材料的天然形式或固有形式相对应的材料：所述材料以自然界中不会存在的方式被改变，或与其相同但是从合成材料和/或通过使用重组技术操作而产生或获取。

“序列同一性”和“同源性”在本文可互换地用于指多核苷酸之间或多肽之间的对比(“序列同一性”和“同源性”通常以百分比的形式来表示)，且通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列来确定，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分与参照序列相比可包括添加或缺失(即，空位)，用于两个序列的最佳对齐。百分比可以通过如下计算：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置总数并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。可选地，该百分比可通过以下计算：确定相同核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中都存在的位置数或核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的位置数以得到匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。本领域技术人员将认识到，存在许多可用于比对两个序列的建立的算法。用于比较的序列最佳比对可例如通过Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机实现(GCGWisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA或TFASTA)或通过直观检查(一般参见，Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等编著，Current Protocols,Greene Publishing Associates Inc.和John Wiley&Sons,Inc.之间的合资企业,(1995年增刊)(Ausubel))。适宜于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等,1977,Nucleic Acids Res.3389-3402中。用于执行BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站公开可用的。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值的阀值得分T。T被称作邻近字评分阈值(Altschul等，如上述)。这些初始相邻字匹配(word hit)充当用于启始搜索的种子来寻找包含它们的更长的HSP。然后字匹配沿着每个序列在两个方向延伸到累积比对得分不能够增加的程度。对于核苷酸序列，累积得分使用参数M(对于匹配残基对的奖励得分；永远＞0)和N(对于错配残基的惩罚得分；永远＜0)计算。对于氨基酸序列，得分矩阵被用于计算累计得分。当以下情况时，每个方向中的字匹配字串的延伸被终止：累积比对得分从其最大达到值下降了量X；由于累积一个或多个负得分残基比对，累积得分达到0或以下；或到达任一序列末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为缺省值：字长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff和Henikoff,1989,Proc Natl Acad Sci USA89：10915)。序列比对和序列同一性％的示例性确定可使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys,Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序，使用所提供的缺省参数。

“参考序列”是指用作序列比较的基础的限定序列。参考序列可以是较大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的片段。一般而言，参考序列为至少20个核苷酸或氨基酸残基长，至少25个残基长，至少50个残基长，或者核酸或多肽的全长。因为两种多核苷酸或多肽可以各自(1)包括在两种序列之间相似的序列(即，完整序列的一部分)，且(2)可以进一步包括在两种序列之间不同的序列，两种(或更多)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过在“比较窗口”内比较两种多核苷酸或多肽的序列来进行以鉴定和比较序列相似性的局部区域。在一些实施方案中，“参照序列”不意为限于野生型序列，且可包括工程化或改变的序列。例如，“在对应于X39的残基处具有亮氨酸的基于SEQ ID NO:2的参考序列”指其中在SEQ ID NO:2中的X39处相应的残基(是脯氨酸)已经改变成亮氨酸的参考序列。

“比较窗口”指至少约20个相邻核苷酸位置或者氨基酸残基的概念性片段，其中序列可以与至少20个相邻核苷酸或氨基酸的参考序列相比较，并且其中比较窗口中的序列的部分可以包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比20％或更少的添加或缺失(即，空位)，用于两序列的最佳比对。比较窗口可以长于20个相邻残基，并且包括任选地30、40、50、100或更长的窗口。

在用于指定的氨基酸或多核苷酸序列的编号的情况下，"相应于"、"参考于"或"相对于"指当指定的氨基酸或多核苷酸序列与参考序列相比较时指定的参考序列残基的编号。换言之，给定序列的残基编号或残基位置是根据参考序列指定的，而不是给定氨基酸或多核苷酸序列内的残基的实际数字位置指定的。例如，可以将给定的氨基酸序列诸如工程化醛缩酶的氨基酸序列与参考序列进行比对，这是通过引入空位以优化这两条序列之间的残基匹配而实现的。在这些情况下，虽然存在空位，但是给定氨基酸或多核苷酸序列中的残基编号相对于已与其比对的参考序列制定。

“氨基酸差异”或“残基差异”指在多肽序列的一个位置处氨基酸残基相对于参考序列中相应位置处的氨基酸残基的差异。本文中氨基酸差异的位置一般被称为“Xn”，其中n指残基差异基于其的参考序列中的相应位置。例如，“与SEQ ID NO:2相比在位置X39处的残基差异”指在相应于SEQ ID NO:2的位置39的多肽位置处的氨基酸残基的差异。因此，如果SEQ ID NO:2的参考多肽在位置39处具有脯氨酸，那么“与SEQ ID NO:2相比在位置X39处的残基差异”是指在相应于SEQ ID NO:2的位置39的多肽位置处除了脯氨酸之外的任何残基的氨基酸取代。在本文的大多数实例中，在一个位置处的特定氨基酸残基差异表示为“XnY”，其中“Xn”指如以上描述的对应位置，并且“Y”为在工程化多肽中发现的氨基酸的一字母标识符(即，与参考多肽中的不同的残基)。在一些实例中(例如，在表1中)，本公开内容还提供由常规符号“AnB”表示的特定氨基酸差异，其中A为参考序列中的残基的一字母标识符，“n”为在参考序列中的残基位置的编号，并且B为工程化多肽的序列中残基取代的单字母标识符。在一些实例中，本公开内容的多肽可包含相对于参考序列的一个或更多个氨基酸残基差异，其通过相对于参考序列存在残基差异处的特定位置的列表表示。在一些实施方案中，当多于一个氨基酸可被用于多肽的特定残基位置时，可使用的多个氨基酸残基通过“/”分隔开(例如，X39L/X39A)。

“缺失”指通过从参考多肽去除一个或更多个氨基酸而对多肽的修饰。缺失可以包括除去1个或多个、2个或多个氨基酸，5个或多个氨基酸，10个或多个氨基酸，15个或多个氨基酸，或20个或多个氨基酸，多达组成参照酶的氨基酸总数的10％，或多达组成参照酶的氨基酸总数的20％，同时保留工程化醛缩酶的酶活性和/或保留工程化醛缩酶的改进的性质。缺失可以涉及多肽的内部部分和/或末端部分。在各种实施方案中，缺失可以包括连续的区段或者可以是不连续的。

"***"指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸的多肽的修饰。在一些实施方案中，改进的工程化醛缩酶包括一个或更多个氨基酸***天然存在的醛缩酶多肽，以及一个或更多个氨基酸***其他改进的醛缩酶多肽。可在多肽的内部部分***，或***到羧基或氨基末端。如本文所用的，***包括本领域中已知的融合蛋白。***可以是氨基酸的连续区段，或者被在天然存在的多肽中一个或更多个氨基酸分隔。

如本文所用的"片段"指具有氨基末端和/或羧基末端缺失、但是其中保留的氨基酸序列与序列中相应的位置相同的多肽。片段可以为至少10个氨基酸长、至少20个氨基酸长，至少50个氨基酸长或更长，以及高达全长醛缩酶多肽的70％、80％、90％、95％、98％和99％。

“分离的多肽”是指如下多肽：所述多肽基本上与其天然伴随的其他物质例如蛋白、脂质和多核苷酸分离。该术语包括已从其天然存在的环境或表达系统(例如，宿主细胞或体外合成中)移去或纯化的多肽。改进的醛缩酶多肽可以存在于细胞内、存在于细胞培养基中或者以各种形式制备，诸如裂解物或分离的制备物。像这样，在一些实施方案中，改进的醛缩酶多肽可以是分离的多肽。

“手性中心”是指连接四个不同基团的碳原子。

“立体选择性”(stereoselectivity)指在化学或酶促反应中一种立体异构体相对于另一种或多种异构体的优先形成。立体选择性可以是部分的，其中一种立体异构体的形成优于另一种异构体；或可以是完全的，其中仅形成一种立体异构体。当立体异构体是对映异构体时(enantiomers)，立体选择性被称为对映异构体选择性(enantioselectivity)，一种对映异构体在两种对映异构体的混合物之中的过量分数(通常被报告为百分比)通常被可选地报告为“对映异构体过量”(enantiomeric excess，简称为ee)。当立体异构体是非对映异构体时(diastereoisomers)，立体选择性被称为非对映异构体选择性(diastereoselectivity)，即一种非对映异构体在两种非对映异构体的混合物之中的过量分数(通常被报告为百分比)，通常被可选地报告为“非对映异构体过量”(diastereoisomeric excess，简称为de)。在本领域内该分数(典型地为百分比)通常可选择地报道为根据下式从中计算的非对映异构体过量(即de)：[主要非对映异构体–次要非对映异构体]/[主要非对映异构体+次要非对映异构体]。在一些实例中，本公开内容的工程化醛缩酶生成的产物中，只检测到两种非对映异构体：(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸(即A2)和(2S,3S)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸(即A3)，所以产物中A2的de值计算如下：[A2–A3]/[A2+A3]。

“立体异构体”、“立体异构形式”和类似表述在本文可互换使用，是指分子差异仅在其原子在空间中的方位不同所造成的所有异构体。其包括对映异构体和具有多于一个手性中心、且彼此不是镜像的化合物的异构体(即“非对映异构体”)。

“改进的酶性质”指与参考醛缩酶相比显示任何酶性质的改进的醛缩酶多肽，所述参考醛缩酶诸如野生型醛缩酶或另一种改进的工程化醛缩酶。期望改进的酶性质包括，但不限于，酶活性(其可以底物的转化百分比的方式被表示)、热稳定性、溶剂稳定性、pH活性特征、辅因子需求、对抑制物的耐受性(例如，底物或产物抑制)、立体特异性和立体选择性(包括对映体选择性或非对映体选择性)。

“转化”指底物向相应的产物的酶转化。“转化百分比”或“转化率”是指在指定条件下在一段时间内被转化为产物的底物的百分比。因此，醛缩酶多肽的“酶活性”或“活性”可以被表示为底物向产物的“转化百分比”。

“热稳定的”指与野生型酶相比醛缩酶多肽在暴露于升高的温度(例如30-50℃)持续一段时间(例如0.5-24小时)之后维持相似活性(例如多于50％)。

“溶剂稳定的”指与野生型酶相比醛缩酶多肽在暴露于不同浓度(例如5-99％)的溶剂(乙醇、异丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、甲苯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚等)持续一段时间(例如0.5-24小时)之后维持相似的活性(多于例如50％至80％)。

“合适的反应条件”指生物催化反应溶液中的那些条件(例如，酶载量、底物载量、辅因子载量、温度、pH、缓冲液、共溶剂等的范围)，在该条件下本公开内容的醛缩酶多肽能将底物转化成期望的产物化合物。示例性“合适的反应条件”被提供于本公开内容并通过实施例例证。

“烃基”是指直链或支链的烃基团。符号“C”后出现下标的数字规定了特定基团可包含的碳原子数。例如，“C₁-C₈”是指具有1至8个碳原子的直链或支链烃基基团。烃基基团可任选第被一个或多个取代基基团取代。“芳基”是指6至约20个碳原子的单价芳香族烃基。“杂芳基”和“杂芳族”是指其中母体芳环系统的一个或多个碳原子被杂原子(O，N或S)代替的芳基基团。“取代的”当用于修饰指定基团或自由基时，是指指定基团或自由基的一个或多个氢原子各自彼此独立地被相同或不同的取代基代替。“取代的烃基、芳基或杂芳基”指其中一个或多个氢原子用另一取代基代替的烃基、芳基或杂芳基基团。“任选”或“任选地”是指所描述的事件或情况可能发生或不发生；例如“任选地取代的芳基”是指可能被取代或可能未被取代的芳基基团，这一描述包括取代的芳基基团和未取代的芳基基团二者。

本文所用的“化合物”是指伴随本文公开的化合物标明的结构式和/或化学名涵盖的任何化合物。化合物可以其化学结构和/或化学名标明。当化学结构与化学名冲突时，化学结构决定化合物的身份。除非另外具体地描述或指出，否则本文描述的化学结构涵盖所描述化合物的所有可能异构体形式。

2.2改进的工程化醛缩酶

以下表1举例说明本发明所开发的工程化醛缩酶多肽。每一行给出一个具体的工程化醛缩酶多肽的核苷酸序列编号和氨基酸序列编号，以及与SEQ ID No:2相比较的残基差异。每个举例的工程化醛缩酶多肽的活性或立体选择性水平以“+”表示，具体的含义见表2。

表1

表2

表1所列的氨基酸序列(即SEQ ID NO:2-230的偶数序列标识符)都含有357个氨基酸残基。SEQ ID NO:232、234、236所示氨基酸序列，与SEQ ID No:2相比较有不同数目的氨基酸残基的缺失或置换，SEQ ID NO:232、234、236所示工程化醛缩酶多肽在表2所示的+、++、+++、++++或+++++的反应条件下，表现出比SEQ ID No:2高的立体选择性和/或活性。

2.3可用于制备工程化醛缩酶多肽的多核苷酸、控制序列、表达载体和宿主细胞

在另一方面，本公开内容提供了编码本文描述的具有醛缩酶活性的工程化多肽的多核苷酸。多核苷酸可与控制基因表达的一种或多种异源调控序列可操作地连接以产生能够表达多肽的重组多核苷酸。包含编码工程化的醛缩酶的异源多核苷酸的表达构建体可被引入合适的宿主细胞以表达相应的工程化醛缩酶多肽。

如对本领域技术人员明显的是，蛋白序列的可得性和相应于多种氨基酸的密码子的知识提供能够编码目标蛋白序列的所有多核苷酸的说明。其中相同氨基酸由可选择的或同义密码子编码的遗传密码的简并性允许产生极大数目的核酸，所有这些核酸编码本文公开的改进的醛缩酶多肽。因此，确定特定的氨基酸序列后，本领域的技术人员可以以不改变蛋白质的氨基酸序列的方式通过仅仅修饰一个或多个密码子的序列来产生任何数目的不同的核酸。在这点上，本公开内容特别地构思了可通过基于可能的密码子选取而选择组合来制备的多核苷酸的各个和每个可能的改变，并且对于本文公开的任何多肽，包括在表1中提供的示例性工程化多肽的氨基酸序列，以及在通过引用并入本文的序列表中作为SEQ IDNO:4-236的偶数序列标识符的序列公开的任何多肽，所有这些改变被认为特别地公开。

在多种实施方案中，密码子被优选地选择以适应在其中产生蛋白的宿主细胞。例如，用于细菌的优选密码子用于表达细菌中的基因；用于酵母中的优选密码子用于在酵母中表达；且用于哺乳动物的优选密码子用于在哺乳动物细胞中表达。

在一些实施方案中，所述多核苷酸编码包含与选自SEQ ID NO:4-236的偶数序列标识符的参考序列至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列的醛缩酶多肽，其中所述多肽具有醛缩酶活性以及本文描述的改进的特性中的一种或更多种，例如以与SEQ ID NO:2的多肽相比增加的立体选择性将化合物A1转化成产物化合物A2的能力。

在一些实施方案中，所述多核苷酸编码工程化醛缩酶多肽，所述工程化醛缩酶多肽包含与SEQ ID NO:2相比具有以上描述的同一性百分比并且具有选自的一个或更多个氨基酸残基差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容提供了具有醛缩酶活性的工程化多肽，所述工程化多肽包含与SEQ ID NO:2的参考序列具有至少80％的序列同一性以及具有选自以下位置的残基差异的组合：X16，X17，X19，X26，X32，X33，X37，X38，X39，X41，X42，X43，X44，X45，X46，X47，X48，X49，X91，X92，X118，X132，X134，X154，X164，X168，X176，X182，X185，X189，X191，X216，X217，X218，X227，X234，X237，X244，X247，X262，X282，X284，X285，X288，X291，X292，X293，X294，X295，X302，X305，X316，X318，X319，X320，X324，X352。

在一些实施方案中，编码工程化醛缩酶多肽的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:3-235的奇数序列标识符的序列。

在一些实施方案中，所述多核苷酸编码本文所述的多肽，但是在核苷酸水平上与编码工程化醛缩酶的参考多核苷酸具有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，参考多核苷酸序列选自具有SEQ ID NO:3-235的奇数序列标识符的序列。

编码工程化醛缩酶多肽的分离的多核苷酸可以多种方法***作以提供多肽的表达，所述方法包括通过密码子优化来进一步改变序列以改进表达、在合适的有或无另外的控制序列的表达元件中***、和转化入适于表达并产生多肽的宿主细胞。

取决于表达载体，在分离的多核苷酸***载体之前对分离的多核苷酸的操作可以是期望的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术在本领域中是公知的。在以下中提供了指导：Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；和Current Protocols inMolecular Biology,Ausubel.F.编著,GreenePub.Associates,1998,2010年更新。

在另一个方面，本公开还涉及重组表达载体，根据它们将被导入的宿主的类型，其包括编码工程化醛缩酶多肽或其变体的多核苷酸，和一个或多个表达调节区，诸如启动子和终止子、复制起点等等。可选地，本公开内容的核酸序列可以通过使核酸序列或包括该序列的核酸构建体***到适当的表达载体中来表达。在产生表达载体时，编码序列位于载体中以使编码序列被可操作地连接于用于表达的合适的控制序列上。

重组表达载体可为任何载体(例如，质粒或病毒)，其可方便地应用于重组DNA步骤中并且可带来多核苷酸序列的表达。载体的选择通常将取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状的质粒。表达载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外的实体而存在的载体，它的复制独立于染色体的复制，如质粒、染色体外的元件、微小染色体、或人工染色体。载体可以包含用于保证自我复制的任何工具。可选地，载体可以是在被引入到宿主细胞中时整合到基因组中并且与其所整合到的染色体一起复制的载体。而且，可以使用单一载体或质粒或者一起包含待引入到宿主细胞基因组中的总DNA的两种或多种载体或质粒。

对本公开内容的实施方案有用的很多表达载体是商业上可得的。示例性表达载体可通过将编码改进的醛缩酶多肽的多核苷酸可操作地连接到质粒pACYC-Duet-1(Novagen)中来制备。

在另一方面，本公开内容提供包含编码本公开内容的改进的醛缩酶多肽的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸被可操作地连接至在宿主细胞中用于醛缩酶的表达的一个或更多个控制序列。用于表达由本公开内容的表达载体编码的多肽的宿主细胞在本领域是公知的，并且包括但不局限于诸如大肠杆菌、节杆菌属种KNK168、链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞的细菌细胞；诸如酵母细胞(例如，酿酒酵母或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris))的真菌细胞；诸如果蝇S2以及灰翅夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞的昆虫细胞；诸如CHO、COS、BHK、293和Bowes黑色素瘤细胞的动物细胞；以及植物细胞。示例性的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。上述宿主细胞可以是野生型的，也可以是经过基因组编辑的工程细胞，比如把宿主细胞基因组中所携带的野生型的醛缩酶基因敲除。上述宿主细胞的合适的培养基以及生长条件在本领域内是公知的。

用于表达醛缩酶的多核苷酸可通过本领域已知的多种方法被引入至细胞。技术包括，除了其他以外，电穿孔、生物颗粒轰击法、脂质体介导的转染、氯化钙转染和原生质体融合。将多核苷酸引入细胞的不同方法对于本领域技术人员是明显的。

2.4产生工程化醛缩酶多肽的方法

通过将编码醛缩酶的多核苷酸经历诱变和/或定向进化方法，可以获得工程化醛缩酶。示例性的定向进化技术可见《Biocatalysis for the Pharmaceutical Industry:Discovery,Development,and Manufacturing》(2009John Wiley&Sons Asia(Pte)Ltd.ISBN:978-0-470-82314-9)。

当工程化多肽的序列为已知时，编码酶的多核苷酸可根据已知的合成方法通过标准的固相方法制备。在一些实施方案中，多达约100个碱基的片段可单独地合成，然后连接(例如，通过酶促或化学的连接方法或聚合酶介导的方法)以形成任何需要的连续序列。例如，本公开内容的多核苷酸和寡核苷酸可通过化学合成制备，使用，例如，描述于Beaucage等人,1981,TetLett22：1859-69的经典的亚磷酰胺方法，或描述于Matthes等人,1984,EMBOJ.3:801-05的方法，例如，如在自动化合成方法中典型地实践的。根据亚磷酰胺方法，寡核苷酸在例如，在自动化DNA合成仪中合成、纯化、退火、连接以及克隆至合适的载体中。另外，基本上任何核酸可从多种商业来源的任一个获得。

在一些实施方案中，本公开内容还提供了用于制备或制作能在合适的反应条件下将化合物A1转化成化合物A2的工程化醛缩酶多肽的方法，其中该方法包括在适于表达多肽的培养条件下培养能够表达编码工程化多肽的多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，制备多肽的方法还包括分离多肽。工程化多肽可在合适的细胞中表达，并利用所熟知的用于蛋白纯化的技术中的任何一种或更多种从宿主细胞和/或培养基分离(或回收)，所述用于蛋白纯化的技术包括，除了其他以外，溶菌酶处理、超声、过滤、盐析、超速离心和色谱。

2.5利用工程化醛缩酶的方法以及用其制备的化合物

在另一方面，本文所述的改进的工程化醛缩酶多肽，可将醛底物和氨基酸底物进行不对称缩合。本公开内容还提供了使用本文公开的工程化醛缩酶多肽制备广泛范围的化合物(I)或其结构类似物的方法。在一些实施方案中，工程化醛缩酶多肽可用在制备结构式(I)的化合物的方法中：

R¹是任选地取代的芳基或杂芳基，或是任选地取代的C₁-C₈烃基；

与醛缩酶多肽接触，其中所述醛缩酶多肽是本文所述的工程化醛缩酶多肽。在一些实施方案中，所述工程化醛缩酶多肽与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并能够以与SEQ ID NO：2相比更高的转化率和/或更高的立体选择性缩合结构式(II)的醛底物和结构式(III)的氨基酸底物为结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物。

如上所述，可用于本公开内容的方法中的醛缩酶多肽可按照其缩合对硝基苯甲醛和甘氨酸为(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的能力来表征。因此，在本文公开的方法的任何实施方案中，可进行该方法，其中醛缩酶多肽能够以与SEQ ID NO：2相比更高的转化率和/或更高的立体选择性缩合对硝基苯甲醛和甘氨酸为(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸，并与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的氨基酸序列同一性。

在上述方法的一些实施方案中，R¹是任选地取代的C₁-C₈烃基。在一些实施方案中，R¹是任选地取代的苯基。在一些实施方案中，R¹是任选地取代的吡啶基。在一些实施方案中，R¹是任选地取代的芳基或杂芳基。在一些实施方案中，R¹是任选地取代的苯基，且取代发生在苯基环上的任一位(邻位、间位或对位)或取代同时发生在苯基环上的任两位，取代基团选自C₁-C₄烃基、卤素(如-F、-Cl、-Br和-I)、-NO₂、-NO、-SO₂R’或-SOR’、-SR’、-NR’R’、-OR’、-CO₂R’或-COR’、-C(O)NR’、-SO₂NH₂或-SONH₂、-CN、CF₃，其中每个R’独立地选自-H或(C₁-C₄)烃基。在一些实施方案中，(C₁-C₄)烃基是卤素取代的烃基。

在上述方法的一些实施方案中，R²是-H、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂OH、-CH₂SH或-CH₂SCH₃。

在一些实施方案中，在上述方法中产生的结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物以至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的非对映体过量产生。

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-(+)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是L-丙氨酸，结构式(II)的醛底物是异丁醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-(+)-2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是异丁醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基癸酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是正辛醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R,4E)-2-氨基-3-羟基-4-己烯酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是巴豆醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3S)-2-氨基-3-[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂戊环-4-基]-3-羟基丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3S)-2-氨基-3-羟基-3-(1H-咪唑-2-基)丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是1H-咪唑-2-甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(吡啶-3-基)丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是吡啶甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是3-苯丙醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-5-(苄氧基)-3-羟基戊酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是3-(苄氧基)丙醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-(1,3-1,3-苯并二氧戊环-5-基)-3-羟基丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是亚甲二氧基苯-5-甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-4-(2-氨基-6-羟基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基丁酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是(2-氨基-6-羟基-9H-嘌呤-9-基)乙醛：

在一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是：

其中R³是C₁-C₄烃基、-H、卤素(如-F、-Cl、-Br和-I)、-NO₂、-NO、-SO₂R’或-SOR’、-SR’、-NR’R’、-OR’、-CO₂R’或-COR’、-C(O)NR’、-SO₂NH₂或-SONH₂、-CN、CF₃，其中每个R’独立地选自-H或(C₁-C₄)烃基；

R³也可以是

R²是-H、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂OH、-CH₂SH或-CH₂SCH₃，且结构式(II)的醛底物是：

在一些实施方案中，R³在苯基环的对位。在一些实施方案中，R³在苯基环的间位。在一些实施方案中，R³在苯基环的邻位。在一些实施方案中，R³同时在苯基环的对位和间位。在一些实施方案中，R³同时在苯基环的对位和邻位。在一些实施方案中，R³同时在苯基环的间位和邻位。在一些实施方案中，在上述方法中产生的结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物以至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的非对映体过量产生。

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是：

其中R⁴是如以上定义的R³，R³和R²如上定义，且结构式(II)的醛底物是：

在一些实施方案中，R³在苯基环的间位。在一些实施方案中，R³在苯基环的邻位。在一些实施方案中，在上述方法中产生的结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物以至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的非对映体过量产生。

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-苯甲酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-甲苯基)丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是4-甲基苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-(2-氯苯基)-3-羟基丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是2-氯苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-(3,4-二羟基苯)-3-羟基丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是3，4-二羟基苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-羟苯基)丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是4-羟基苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(3-硝基苯)丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是3-硝基苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-(4-氟-3-硝基苯)-3-羟基丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是4-氟-3-硝基苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-2-甲基-3-(3-硝基苯)丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是L-丙氨酸，结构式(II)的醛底物是3-硝基苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(2-硝基苯)丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是2-硝基苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-3-[对-(甲砜基)苯基]-3-羟基-2-氨基-丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是对甲砜基苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-巯基苯)丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是4-巯基苯甲醛：

在该方法的一些实施方案中，结构式(I)的β-羟基-α-氨基酸产物是(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-巯甲基苯)丙酸：

且结构式(III)的氨基酸底物是甘氨酸，结构式(II)的醛底物是4-巯甲基苯甲醛：

在一些实施方案中，改进的工程化醛缩酶多肽可以在制备非对映体过量的式A2化合物(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的方法中：

在这些实施方案中，所述方法包括在适于转化式A1化合物为式A2化合物的反应条件下，在适当的有机溶剂中，在甘氨酸存在下，将结构式A1

与本文公开的改进的工程化醛缩酶多肽接触的步骤。

在以上方法的一些实施方案中，式(I)化合物或式A2化合物以至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％或更大非对映体过量产生。

可用在以上方法中的改进的工程化醛缩酶多肽可包括选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236的氨基酸序列。

如本文描述并在实施例中例证的，本公开内容构思了可在本文的方法中使用的合适的反应条件的范围，包括但不限于pH、温度、缓冲液、溶剂系统、底物载量、产物化合物非对映异构体的混合物、多肽载量、辅因子载量、压力和反应时间的范围。用于执行使用本文描述的工程化的醛缩酶多肽将底物化合物生物催化地转化成产物化合物的方法的另外的合适的反应条件可容易地通过常规实验优化，所述常规实验包括但不限于在浓度、pH、温度、溶剂条件的实验反应条件下使工程化醛缩酶多肽与底物化合物接触，并检测产物化合物，例如，利用在本文提供的实施例中描述的方法。

如以上描述的，用于本公开内容的方法的具有醛缩酶活性的工程化多肽通常包含与选自SEQ ID NO:4-236的偶数序列的任一个的参考氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

考虑到例如期望的产物化合物的量、底物浓度对酶活性的影响、反应条件下酶的稳定性、和底物到产物的转化百分比，反应混合物中的底物化合物可以变化。在所述方法的一些实施方案中，合适的反应条件包括至少约0.5至约400g/L、1至约400g/L、5至约400g/L、约10至约400g/L、或约50至约400g/L的底物(II)或底物A1的载量。在一些实施方案中，合适的反应条件包括至少约0.5g/L、至少约1g/L、至少约5g/L、至少约10g/L、至少约15g/L、至少约20g/L、至少约30g/L、至少约50g/L、至少约75g/L、至少约100g/L、至少约150g/L、至少约200g/L、至少约250g/L、至少约300g/L、至少约350g/L、至少约400g/L或甚至更大的底物(II)或底物A1的载量。虽然本文提供的底物载量的值是基于化合物(II)或A1的分子量，但是还预期，也可在方法中使用相等的摩尔量的化合物(II)或A1的多种水合物和盐。

在本文描述的方法中，工程化醛缩酶多肽使用氨基酸与醛类化合物缩合以形成产物化合物。在一些实施方案中，反应条件中的氨基酸包括选自甘氨酸，D,L-丙氨酸、D,L-丝氨酸、D,L-半胱氨酸、D,L-亮氨酸、D,L-异亮氨酸、D,L-蛋氨酸、D,L-苏氨酸或D,L-缬氨酸。在一些实施方案中，氨基酸是甘氨酸。在一些实施方案中，合适的反应条件包括以至少约1倍于底物(II)摩尔载量的载量存在的氨基酸，特别是甘氨酸。在一些实施方案中，甘氨酸以1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍于底物(II)摩尔用量的载量存在。

所述方法的合适的反应条件通常还包括在反应混合物中存在辅因子。因为工程化醛缩酶通常利用维生素B6家族的成员，所以反应条件可包括选自吡哆醛-5’-磷酸(也被称为磷酸吡哆醛、PLP、P5P)、吡哆辛(PN)、吡哆醛(PL)、吡多胺(PM)、和它们的磷酸化对应物磷酸吡哆醇(PNP)、和磷酸吡多胺(PMP)的辅因子。在一些实施方案中，合适的反应条件可包括选自PLP、PN、PL、PM、PNP和PMP的辅因子以约0.1g/L至约10g/L、约0.2g/L至约5g/L、约0.5g/L至约2.5g/L的浓度存在。在一些实施方案中，辅因子是PLP。相应地，在一些实施方案中，合适的反应条件可包括辅因子PLP以约0.1g/L至约10g/L、约0.2g/L至约5g/L、约0.5g/L至约2.5g/L的浓度存在。在一些实施方案中，反应条件包括约10g/L或更少、约5g/L或更少、约2.5g/L或更少、约1.0g/L或更少、约0.5g/L或更少、或约0.2g/L或更少的PLP浓度。

在反应的一些实施方案中(例如，其中使用完整细胞或裂解物)，辅因子天然地存在于细胞提取物且不需要补充。在反应的一些实施方案中(例如，利用部分地纯化的、或纯化的醛缩酶)，所述方法还可包括将辅因子添加至酶反应混合物的步骤。在一些实施方案中，辅因子在反应开始时添加和/或另外的辅因子在反应期间被添加。

在反应的实施方案中，反应条件可包括合适的pH。如以上所述，期望的pH或期望的pH范围可通过使用酸或碱、合适的缓冲剂、或缓冲和添加酸或碱的组合来保持。反应混合物的pH可在反应过程之前和/或期间控制。在一些实施方案中，合适的反应条件包括约4至约8的溶液pH、约5至约7的pH、约6至约7的pH。在一些实施方案中，反应条件包括约4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8的溶液pH。

在本文的方法的实施方案中，例如考虑到在较高的温度下在反应速率上的增加、对于足够久的反应持续时间的酶的活性、以及在以下进一步描述的底物对非对映异构体的差异化的速率增加(为了动态动力学拆分的目的)，合适的温度可被用于反应条件。相应地，在一些实施方案中，合适的反应条件包括约10℃至约60℃、约25℃至约50℃、约25℃至约40℃、或约25℃至约30℃的温度。在一些实施方案中，合适的反应温度包括约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃的温度。在一些实施方案中，酶促反应期间的温度可以贯穿反应过程保持在一定温度。在一些实施方案中，酶促反应期间的温度可以在反应过程期间调整为温度曲线。

使用工程化醛缩酶的方法通常在溶剂中进行。合适的溶剂包括水、水性缓冲溶液、有机溶剂和/或共溶剂系统，共溶剂系统通常包括水性溶剂和有机溶剂。水性溶液(水或水性共溶剂系统)可为pH-缓冲的或非缓冲的。在一些实施方案中，使用工程化醛缩酶多肽的方法通常地于包含以下的水性共溶剂系统中进行：有机溶剂(例如，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇(IPA))、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸异丙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、1-辛醇、庚烷、辛烷、甲基叔-丁基醚(MTBE)、甲苯等)、离子液体(例如，四氟硼酸1-乙基4-甲基咪唑、四氟硼酸1-丁基-3-甲基咪唑、六氟磷酸1-丁基-3-甲基咪唑等)。水性共溶剂系统中的有机溶剂组分可与水性组分混溶，提供单一的液相，或可与水性组分部分混溶或不混溶，提供双液相。示例性的水性共溶剂系统包含水和一种或多种有机溶剂。通常，选择水性共溶剂系统的有机溶剂组分以便其不会完全使醛缩酶失活。通过用候选溶剂系统中的感兴趣的确定的底物并利用诸如本文描述的酶活性测定而测量特定的工程化的醛缩酶的酶活性，合适的共溶剂系统可被容易地鉴定。在方法的一些实施方案中，合适的反应条件包括水性共溶剂，所述水性共溶剂包含约1％至约100％(v/v)、约1％至约60％(v/v)、约2％至约60％(v/v)、约5％至约60％(v/v)、约10％至约60％(v/v)、约10％至约50％(v/v)或约10％至约40％(v/v)的浓度的乙醇。在方法的一些实施方案中，合适的反应条件包括含有至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％(v/v)的浓度的乙醇的水性共溶剂。

合适的反应条件可包括提供将底物化合物生物催化转化成其相应的产物化合物的反应参数的组合。相应地，在方法的一些实施方案中，反应参数的组合包括：(a)约10g/L至200g/L底物A1的载量；(b)约3倍至10倍于底物A1的摩尔用量的甘氨酸的载量；(c)约0.5g/L至10g/L的工程化多肽浓度；(d)约0.1mM至10mM的PLP辅因子浓度；(e)约20％(v/v)至约60％(v/v)的DMSO或乙醇浓度；(f)约4.0至8.0的pH；和(g)约10℃至60℃的温度。

示例性反应条件包括在表2以及实施例3中提供的测定条件。

在进行本文描述的醛缩反应时，工程化的醛缩酶多肽可以部分地纯化的或纯化的酶、用编码酶的基因转化的完整细胞、和/或此类细胞的细胞提取物和/或裂解物的形式加入至反应混合物中。用编码工程化的醛缩酶的基因转化的完整细胞，或其细胞提取物、其裂解物，以及分离的酶可以多种不同的形式使用，包括固体(例如，冻干的、喷雾干燥的等)或半固体(例如，粗糊状物)。细胞提取物或细胞裂解物可通过沉淀(例如，硫酸铵、聚乙烯亚胺、热处理或类似处理)部分纯化，之后在冻干前进行除盐程序(例如，超滤、透析及类似程序)。任何酶制品可通过使用已知的交联剂诸如，例如戊二醛交联或固定到固相材料(例如树脂)而被稳定化。

在本文描述的醛缩反应的一些实施方案中，反应在本文描述的合适的反应条件下进行，其中工程化醛缩酶多肽被固定至固体支持物上。可用于固定进行醛缩反应的工程化醛缩酶的固体支持物包括但不限于微球或树脂，所述微球或树脂包含具有环氧官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有氨基环氧官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有十八烷基官能团的苯乙烯/DVB共聚物或具有十八烷基官能团的聚甲基丙烯酸酯。示例性固体支持物包括但不限于壳聚糖珠、EupergitC和SEPABEAD(Mitsubishi)，包括以下不同类型的SEPABEAD：EC-EP、EC-HFA/S、EXA252、EXE119和EXE120。

在一些实施方案中，其中工程化多肽可以分泌多肽的形式被表达，含有该分泌多肽的培养基可被用于本文的方法中。

在一些实施方案中，固体反应物(例如，酶、盐等)可以各种不同的形式提供给反应，包括粉末(例如，冻干的、喷雾干燥的等)、溶液、乳液、悬浮液等。反应物可使用为本领域普通技术人员共知的方法和仪器容易地冻干或喷雾干燥。例如，蛋白质溶液可以小量冷冻于-80℃，然后加入至预冷却的冻干室内，之后应用真空。

在一些实施方案中，加入反应物的顺序并不关键。反应物可同时一起加入至溶剂中(例如，单相溶剂、双相水性共溶剂体系等)，或者可选择地，一些反应物可分别地加入，以及一些在不同的时间点一起加入。例如，辅因子、醛缩酶和醛缩酶底物可首先加入溶剂中。为了当使用水性共溶剂系统时的改进的混合效率，醛缩酶和辅因子可首先加入并混合入水相中。然后可加入并混合有机相，然后添加醛缩酶底物。可选择地，醛缩酶底物可在添加至水相之前在有机相中预混合。

本公开内容的不同的特征和实施方案示例于以下代表性的实施例中，其意图是例证性的而不是限制性的。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：基因克隆和表达载体的构建

源自于Pseudomonas putida的野生型的醛缩酶的氨基酸序列，可从NCBI上检索得到，然后通过本领域的常见技术将其对应的核酸合成出来并克隆到表达载体pACYC-Duet-1上。将重组表达质粒转化到E.coil BL21(DE3)的感受态细胞中，转化条件42℃，热击90秒，转化液涂布到含有氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得重组转化体。

实施例2：重组醛缩酶的表达

将得到的重组E.coli BL21(DE3)等转化体，接种至含氯霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，30℃振荡培养过夜，按5％(v/v)的接种量接入装有250mL TB培养基(胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4mL/L，PBS)的1L锥形瓶中，至30℃、250rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，低温诱导过夜后，将培养液离心，收集细胞，用缓冲液洗涤一次得到静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH7.4的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组醛缩酶的粗酶液。可进一步用冷冻干燥机冻干，即为冻干粗酶粉。

按照摇瓶制备方式，同比例缩小至96孔板进行培养得到培养液，离心去除上清培养基得到静息细胞，通过化学液破碎得到粗酶液。

实施例3：检测醛缩酶多肽活性和立体选择性的反应条件及分析方法

在96孔板中加入终浓度为7.5g/L的对硝基苯甲醛，其中对硝基苯甲醛加入孔板前需用乙醇(EtOH)进行溶解，体系中乙醇的最终浓度为40％(v/v)，同时加入10倍于对硝基苯甲醛摩尔用量的甘氨酸(即为37.4/L)，以及终浓度为0.05mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)，最后加入粗酶液。反应总体积为200微升。反应至4小时后用50％乙腈进行灭活，取上清稀释后分析测定底物转化率与产物A2的de值。

酶粉反应在上述96孔板微反应的基础上进行扩大，总体系体积为5mL，对硝基苯甲醛的载量为40g/L，甘氨酸的载量为199.2g/L，PLP终浓度为0.05mmol/L，乙醇终浓度为30％(v/v)，粗酶粉载量为4g/L,反应结束后用50％乙腈灭活后取上清分析反应过程中转化率与de值的变化。

测定转化率和产物的de值的分析方法为：反应液离心后上清液用50％乙腈稀释至浓度低于1g/L，取10微升在Agilent 1260 HPLC上分析转化率，分析色谱柱为PhenomenexChirex 3126(D)-penicillamine 150*4.6mm，流动相为3mM硫酸铜：甲醇＝90:10，流速为每分钟1mL柱温为50℃，检测波长为235nm。(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的保留时间为22.531分钟，(2R,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的保留时间为24.17分钟，对硝基苯甲醛保留时间为28.65分钟，(2S,3S)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸与(2R,3S)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸的保留时间为64.19分钟，分析总时长70分钟。

实施例4：醛缩酶突变文库的构建

这里所用到的都是商业试剂，较佳地选用Quikchange试剂盒(供应商：Agilent)。突变引物的序列设计按照试剂盒的说明进行。PCR体系为：5xBuffer 10ul，10mM dNTP 1ul，质粒DNA模板1ul(50ng/ul),上下游引物各取0.75ul(10uM)，高保真酶0.5ul,ddH2O36ul.PCR引物在突变位置的密码子为NNK。

PCR扩增步骤为：(1)98℃，预变性3min；(2)98℃，变性10s；(3)72℃退火和延伸3min；步骤(2)～(3)重复25次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。在PCR产物中加入2ulDpnI，37℃过夜酶切消除质粒模板。酶切后的PCR产物按转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布到含氯霉素的LB平板上即得NNK突变文库。

实施例5：醛缩酶突变文库的高通量筛选

从突变文库选取突变菌落，接种至96孔浅板的200微升LB培养基(含氯霉素)中，30℃培养过夜。取20微升上述培养物接种至含400微升TB培养基(含氯霉素)的深孔板中，培养OD₆₀₀至0.6～0.8时，加入终浓度1mMIPTG诱导，30℃培养过夜。4000rpm进行离心10分钟，加入200微升化学裂解液(1g/L溶菌酶，0.5g/L PMBS)使其悬浮，振荡使细胞破碎。4000rpm离心10分钟，每孔取60微升上清到含有实施例3所述反应液的深孔板中，在30～50℃摇床中振荡反应24小时，用50％乙腈水溶液进行灭活后，取样进行分析。

实施例6：发酵表达工程化醛缩酶

将包含带有目标醛缩酶基因的质粒的大肠杆菌的单个微生物菌落接种到含30μg/mL氯霉素50mL LB肉汤(5.0g/L Yeast Extract LP0021、10g/L Tryptone LP0042、10g/L氯化钠)中。细胞在30℃摇床中250rpm摇动培养过夜(至少16小时)。当细胞的OD600达到1.6至2.2时，从培养摇床取出细胞，立即使用。

将含有2.0L生长培养基的5L发酵罐放在121℃高压蒸汽灭菌锅灭菌30分钟。向发酵罐接种包含编码目标醛缩酶基因质粒的大肠杆菌指数晚期培养液(生长在如上述的摇瓶中至OD600为1.6至2.2)。以夹套循环水控制温度保持在37℃。以200-800rpm搅动发酵罐，以2-8L/min向发酵容器供应空气以保持溶解氧水平为30％饱和或更大。通过加入25-28％v/v氢氧化铵保持培养物的pH在7.0。细胞的生长通过流加含500g/L食用葡萄糖右旋糖一水合物、12g/L氯化铵和5g/L硫酸镁七水合物的补料溶液来维持。细胞OD600达到25±5后，将发酵温度下降并维持在30℃，通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM来诱导转氨酶的表达，发酵继续另外的18小时。使用Thermo Multifuge X3R离心机在4℃以8000rpm离心10分钟来收集细胞。收获的细胞直接用于下游回收工艺，或在-20℃冷冻储存直到使用。

在4℃将6g细胞沉淀用30mL含250μM吡哆醛5’-磷酸(PLP)的100mM磷酸钾盐缓冲液、pH7.5中重悬浮。利用350W超声破碎仪，工作5秒，停止5秒反复30次将细胞破碎来释放醛缩酶。使用Thermo Multifuge X3R离心机在4℃以8000rpm离心10分钟来澄清所得的细胞破碎液。澄清上清液分配到浅容器中，在-20℃冷冻并冻干为粉末。将醛缩酶酶粉末放置在-20℃冷冻储存。

实施例7：醛缩酶多肽催化醛与氨基酸不对称合成(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸

以1.0L的反应总体积为例，在反应容器中加入以下物质：178g甘氨酸，30g对硝基苯甲醛，942mL的25％(v/v)乙醇水溶液，4g的SEQ ID NO：6的酶粉，5mL的PLP母液(10mM)。设定反应温度为30℃，搅拌转速为400rpm，反应8小时后，底物的总转化率≥20％，产物A2的de≥95％。抽滤得滤液上清，将上清浓缩后析出固体粗品；固体粗品经300mL纯水，25℃搅拌打浆30分钟，抽滤，将滤饼真空干燥即得纯品(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸(化学纯度99.5％、de≥99％)。

实施例8：(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸经过酯化、还原制备精制左旋氨基物

反应瓶中依次加入1000mL无水甲醇，冰浴搅拌1小时。控制反应瓶内温度为5℃，1小时内缓慢滴加128mL氯化亚砜，滴加完毕之后冰浴搅拌1小时，再加100g(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-3-(4-硝基苯)丙酸,然后升温至25℃搅拌3小时，缓慢升温至至65℃(回流)。回流反应约24小时。取样检测酯化完全后，在40℃下减压除SO₂、HCl、甲醇，直至无液体流出。然后加入1000mL冰水，冰浴降温下滴加KOH溶液调pH至8.0左右，继续搅拌1小时后，过滤，用水淋洗滤饼。将滤饼在真空下干燥，得约80g白色固体即为酯化物。

反应瓶中依次加入1200mL THF、75g酯化物，搅拌30min后缓慢加12g NaBH₄，搅拌1小时候升温回流(50-55℃),然后30min内缓慢滴加160mL甲醇。滴加结束后继续搅拌反应，3小时后反应结束。浓盐酸调pH≤2,搅拌过夜。过滤，滤液减压除去THF和甲醇，加500mL纯水搅拌溶解，然后加KOH调pH≥10，滤液放置4℃冰箱中降温结晶，过滤滤饼干燥即为精制左旋氨基物粗品，粗品再溶于酸水中脱色、过滤、调碱得到精制品，真空干燥得约55g精制左旋氨基物。

实施例9：醛缩酶多肽催化醛与氨基酸不对称合成(2S,3R)-3-[对-(甲砜基)苯基]-3-羟基-2-氨基-丙酸

以1.0L的反应总体积为例，在反应容器中加入以下物质：178g甘氨酸，40g对甲砜基苯甲醛，958mL的40％(v/v)乙醇水溶液，4g的SEQ ID NO：18的酶粉，5mL的PLP母液(10mM)。设定反应温度为30℃，搅拌转速为400rpm，反应6小时后，底物的总转化率≥40％，产物(2S,3R)-3-[对-(甲砜基)苯基]-3-羟基-2-氨基-丙酸的de≥90％。

实施例10：醛缩酶多肽催化醛与氨基酸不对称合成(2S,3R)-2-氨基-3-(3,4-二羟基苯)-3-羟基丙酸

以1.0L的反应总体积为例，在反应容器中加入以下物质：55g甘氨酸，10g 3,4-二羟基苯甲醛，960mL的去离子水，10g的SEQ ID NO：44的酶粉，5mL的PLP母液(10mM)。设定反应温度为30℃，搅拌转速为400rpm，反应2小时后，底物的总转化率≥40％。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 宁波酶赛生物工程有限公司

<120> 工程化多肽及其在合成β-羟基-α-氨基酸中的应用

<130> EMP038

<150> 201710386994.9

<151> 2017-05-27

<160> 236

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1071

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgaacggtg aaacctcgcg tccgccggcg ctgggtttta gctctgataa tattgctggt 60

gcaagcccgg aagtcgcaca ggcactggtg aaacatagtt ccggccaagc gggtccgtat 120

ggcaccgatg aactgacggc ccaggtgaaa cgtaaatttt gcgaaatctt cgaacgcgac 180

gtcgaagtgt tcctggttcc gaccggtacg gcagcaaacg cactgtgtct gtccgcaatg 240

accccgccgt ggggtaatat ttactgccat ccggcgtccc acatcaacaa tgatgaatgt 300

ggtgcgccgg aatttttctc aaacggcgcc aaactgatga ccgttgatgg tccggcagct 360

aaactggaca ttgtccgtct gcgcgaacgt acgcgcgaaa aagtgggtga tgttcatacc 420

acgcagccgg catgcgtctc tattacccaa gctacggaag tgggcagtat ctataccctg 480

gatgaaattg aagccatcgg tgacgtgtgc aaatcatcga gcctgggtct gcacatggat 540

ggctctcgtt ttgctaatgc gctggtgtcc ctgggctgtt caccggcaga aatgacctgg 600

aaagccggtg ttgacgcact gagttttggt gcgacgaaaa acggcgttct ggcggccgaa 660

gcaattgtcc tgttcaatac ctcgctggct acggaaatga gctatcgtcg caaacgtgcc 720

ggccacctgt ctagtaaaat gcgctttctg agcgctcaga tcgatgcgta cctgaccgat 780

gacctgtggc tgcgtaacgc ccgcaaagca aatgcagctg cgcagcgtct ggcccaaggt 840

ctggaaggcc tgggcggtgt tgaagtcctg ggcggtaccg aagcaaacat tctgttctgt 900

cgcctggatt ctgccatgat cgacgcactg ctgaaagctg gctttggttt ctaccatgat 960

cgttggggtc cgaacgtggt tcgctttgtt accagcttcg ctaccacggc ggaagatgtg 1020

gaccacctgc tgaatcaggt tcgcctggcc gcagaccgta cgcaagaacg c 1071

<210> 2

<211> 357

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)

<400> 2

Met Asn Gly Glu Thr Ser Arg Pro Pro Ala Leu Gly Phe Ser Ser Asp

1 5 10 15

Asn Ile Ala Gly Ala Ser Pro Glu Val Ala Gln Ala Leu Val Lys His

20 25 30

Ser Ser Gly Gln Ala Gly Pro Tyr Gly Thr Asp Glu Leu Thr Ala Gln

35 40 45

Val Lys Arg Lys Phe Cys Glu Ile Phe Glu Arg Asp Val Glu Val Phe

50 55 60

Leu Val Pro Thr Gly Thr Ala Ala Asn Ala Leu Cys Leu Ser Ala Met

65 70 75 80

Thr Pro Pro Trp Gly Asn Ile Tyr Cys His Pro Ala Ser His Ile Asn

85 90 95

Asn Asp Glu Cys Gly Ala Pro Glu Phe Phe Ser Asn Gly Ala Lys Leu

100 105 110

Met Thr Val Asp Gly Pro Ala Ala Lys Leu Asp Ile Val Arg Leu Arg

115 120 125

Glu Arg Thr Arg Glu Lys Val Gly Asp Val His Thr Thr Gln Pro Ala

130 135 140

Cys Val Ser Ile Thr Gln Ala Thr Glu Val Gly Ser Ile Tyr Thr Leu

145 150 155 160

Asp Glu Ile Glu Ala Ile Gly Asp Val Cys Lys Ser Ser Ser Leu Gly

165 170 175

Leu His Met Asp Gly Ser Arg Phe Ala Asn Ala Leu Val Ser Leu Gly

180 185 190

Cys Ser Pro Ala Glu Met Thr Trp Lys Ala Gly Val Asp Ala Leu Ser

195 200 205

Phe Gly Ala Thr Lys Asn Gly Val Leu Ala Ala Glu Ala Ile Val Leu

210 215 220

Phe Asn Thr Ser Leu Ala Thr Glu Met Ser Tyr Arg Arg Lys Arg Ala

225 230 235 240

Gly His Leu Ser Ser Lys Met Arg Phe Leu Ser Ala Gln Ile Asp Ala

245 250 255

Tyr Leu Thr Asp Asp Leu Trp Leu Arg Asn Ala Arg Lys Ala Asn Ala

260 265 270

Ala Ala Gln Arg Leu Ala Gln Gly Leu Glu Gly Leu Gly Gly Val Glu

275 280 285

Val Leu Gly Gly Thr Glu Ala Asn Ile Leu Phe Cys Arg Leu Asp Ser

290 295 300

Ala Met Ile Asp Ala Leu Leu Lys Ala Gly Phe Gly Phe Tyr His Asp

305 310 315 320

Arg Trp Gly Pro Asn Val Val Arg Phe Val Thr Ser Phe Ala Thr Thr

325 330 335

Ala Glu Asp Val Asp His Leu Leu Asn Gln Val Arg Leu Ala Ala Asp

340 345 350

Arg Thr Gln Glu Arg

355

<210> 3

<211> 1071

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atgaacggtg aaacctcgcg tccgccggcg ctgggtttta gctctgatgg gattgctggt 60