一种提高植物抗病性的铜绿假单胞菌鞭毛蛋白及其编码基因和应用
阅读说明：本技术 一种提高植物抗病性的铜绿假单胞菌鞭毛蛋白及其编码基因和应用 (Pseudomonas aeruginosa flagellin for improving plant disease resistance and coding gene and application thereof ) 是由 蔡易 李琦 郭晋雅 李雍 周鑫琼 张丽梅 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高植物抗病性的铜绿假单胞菌鞭毛蛋白及其编码基因和应用,该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸,且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列；编码该蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸,且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。该蛋白可作为免疫激发子可以明显的提高植物的抗性病,其使用浓度低,起效快,可有效降低农业生产成本。(The invention discloses pseudomonas aeruginosa flagellin for improving plant disease resistance, and a coding gene and application thereof, wherein the amino acid sequence of the protein is shown as SEQ ID NO:1 or SEQ ID NO:1, one or more amino acids are substituted, deleted and/or added, and the amino acid sequences of the proteins with the same function are expressed; the nucleotide sequence of the gene for coding the protein is shown as SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:2 is substituted, deleted and/or added with one or more nucleotides, and can code the nucleotide sequence of the same functional protein. The protein can be used as an immune exciton, can obviously improve the resistance disease of plants, has low use concentration and quick response, and can effectively reduce the agricultural production cost.)
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种提高植物抗病性的铜绿假单胞菌鞭毛蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
目前世界上已有多个生物农药产品获得广泛应用，其中最广泛的是细菌性生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌(Bt)和井冈霉素、中生菌素、芸苔素等农用抗生素。这些产品通过生物来源的抑菌和杀虫物质来达到抗虫抗病的目的。与化学杀虫抗菌药剂相比，这些产品的降解周期短，环境相容性大。然而病虫害的发生是植物与病原相互作用的过程，过去生物农药的研究开发往往忽略了植物本身的免疫力在植物抗病虫害过程中的作用。近年来，随着植物抗病机制的研究进展，植物免疫诱导技术成为生物农药发展中的一个新亮点。有关激发植物免疫抗病和促生增产作用的微生物蛋白农药的研究，已引起国内外的广泛关注和重视。早在2001年，美国EDEN公司从细菌源过敏蛋白中开发出的Messenger农药产品，然而其本质仍是一种杀菌剂。2016年，中国农科院植物保护研究所邱德文教授课题组从极细链格孢菌中提取出了一种激活蛋白，这种蛋白被证明能极大提高植物对病毒病的抗性，由此研发出了全球首个植物免疫类蛋白农药——阿泰灵，通过增强植物自身免疫力实现了农产品的抗病增产，开创了“植物免疫”的先河。
然而从宏观来看，市场上的植物免疫类农药种类较少，仅有阿泰灵，Harpin蛋白等几种类型。从微观上说，这些产品依然存在着局限性。首先，极细链格孢菌激活蛋白和Harpin蛋白的受体尚不清晰，这意味着难以对他们的使用，在理论上做出科学有效的指导，只能通过实验经验来判断其适用范围和使用浓度，这需要一个长期不断的探索过程；第二，植物对这些植物免疫类农药的敏感性较低，其最终的使用浓度为100μmol，每亩地使用量达100g，成本也超过了40元/亩。为了减少农业生产成本，依旧需要研究和开发新的产品。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种提高植物抗病性的铜绿假单胞菌鞭毛蛋白及其编码基因和应用，该蛋白首次用于农业生产病害的防治，发明人发现能有效降低农业生产中的使用成本。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种提高植物抗病性的铜绿假单胞菌鞭毛蛋白flagellin，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示，或SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。
编码上述铜绿假单胞菌鞭毛蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
一种重组载体，包含上述编码铜绿假单胞菌鞭毛蛋白的基因。
一种重组菌，包含上述编码铜绿假单胞菌鞭毛蛋白的基因。
一种宿主细胞，包含上述编码铜绿假单胞菌鞭毛蛋白的基因。
上述铜绿假单胞菌鞭毛蛋白flagellin在提高植物抗病性和诱导植物防御反应中的应用，具体为：在提高植物抗丁香假单胞菌侵染、稻瘟病菌侵染和禾谷镰刀菌侵染方面的应用，更进一步地，这些植物为十字花科植物(如拟南芥、油菜等)、茄科植物(如烟草和番茄等)和禾本科植物(如水稻、玉米、小麦等)。更具体为：铜绿假单胞菌鞭毛蛋白flagellin在提高十字花科和茄科植物抗丁香假单胞菌侵染方面的应用，在提高水稻抗稻瘟病菌侵染方面的应用，在提高玉米、小麦抗禾谷镰刀菌侵染方面的应用。
当铜绿假单胞菌鞭毛蛋白flagellin在上述应用过程中，其使用浓度为0.1-2μM，优选为1μM。
此外，还可以将铜绿假单胞菌鞭毛蛋白flagellin制成植物抗病性药物，用于农业生产病害的防治，有效降低农业生产中的使用成本。
本发明提供的提高植物抗病性的铜绿假单胞菌鞭毛蛋白及其编码基因和应用，具有以下有益效果：
铜绿假单胞菌鞭毛蛋白flagellin作为免疫激发子可以明显的提高植物的抗性病，其使用浓度低，起效快，可有效降低农业生产成本。
附图说明
图1为蛋白表达条件优化的实验结果。
图2为蛋白的可溶性分析及纯化结果。
图3为蛋白激发植物免疫力的胼胝质检测结果。
图4为蛋白激发相关抗病基因的检测结果。
图5为蛋白抑制丁香假单胞菌侵染拟南芥的实验结果。
图6
a为蛋白抑制禾谷镰刀菌侵染玉米的生长实测对比结果
b为蛋白抑制禾谷镰刀菌侵染玉米的实验结果
图7
a为蛋白抑制稻瘟病菌侵染水稻的生长实测对比结果
b为蛋白抑制稻瘟病菌侵染水稻的实验结果
具体实施方式
下列实施例所用实验材料如下：
1、水稻材料
水稻(OryzasativaL.)：短粒粳稻品种日本晴(NPB)(NPB为已经全基因组测序的国际通用品种)。
2、玉米材料：
浚单20由种子公司购买。
3、拟南芥材料
哥伦比亚野生型拟南芥col-0由四川农业大学生命科学学院蔡易教授课题组保存。
4、菌种材料：
丁香假单胞菌DC3000为四川农业大学生命科学学院蔡易教授课题组保存，稻瘟病ZB15小种菌体材料为四川农业大学水稻研究所赠予，玉米禾谷镰刀菌材料为四川农业大学农学院赠予。
实施例1flagellin表达载体的构建
利用生物信息学软件Geneious R9分析铜绿假单胞菌鞭毛蛋白基因flagellin的基因序列，结合pET-28b原核表达载体的限制性内切酶酶切位点，根据开放性阅读框码ORF的原则，设计带有NdeI酶切位点的上游引物和含有XholⅠ酶切位点的下游引物。
正向引物：5’-GACCATATGATGGCTCTTACTGTTAAT-3’(SEQ ID NO:3),其中下划线为NdeI的酶切序列；
反向引物：5’-TCACTCGAGTTATCTAAGCAAAGACAACACAGA-3’(SEQ ID NO:4)，其中下划线为XholⅠ的酶切序列。
PCR扩增全长flagellin基因，扩增程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，55℃ 10s，72℃30s，34个循环；72℃ 2min；4℃保存。
对PCR产物进行回收，然后连接到载体上，并进行筛选和鉴定，得重组质粒。
将重组质粒与原核表达载体pET-28b(+)双酶切后回收并纯化，用连接酶过夜连接后，采用热激法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,挑取阳性克隆，摇菌并提取质粒，酶切并测序验证，获得重组质粒pET-28b-flagellin表达载体。
实施例2蛋白质表达条件优化
将重组质粒pET-28b-flagellin表达载体用热激法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到含有重组质粒pET-28b-flagellin的重组大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET-28b-flagellin。质粒提取及转化表达宿主菌株的方法同实施例1，验证正确后，进行表达。将验证正确的表达菌株过夜活化，同时取含有pET-28b空质粒的菌株作为对照。分别取1mL过夜培养液加入到含有100μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中(1％接种量)，37℃，200r/min振荡培养2-3h培养至OD600为0.6-0.8。此时设置诱导剂IPTG浓度梯度(分别加入终浓度为0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L的IPTG)，同时设置温度梯度(诱导表达温度分别为25℃、28℃、37℃)，进行正交实验以探索最佳表达条件。分别在上述条件下，220r/min继续振荡培养12h，诱导表达目的蛋白，然后高速离心，收集菌体加入缓冲液。经超声破碎菌体后，4℃高速离心，收集上清，得到表达蛋白液。取20μL上清液，加入5μL 5×SDS上样缓冲液(变性)重悬菌体，沸水浴中加热10min，13000r/min离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，观察表达情况如图1所示。图1中的标注为温度+IPTG浓度(mM)。
由图1可知，当菌液培养至OD600值为0.6，加入IPTG的终浓度为0.5mmol/L，28℃条件下诱导培养12h时，为蛋白质表达的最佳条件。
实施例3蛋白质的表达和纯化
1、将BL21(DE3)/pET-28b-flagellin接种于LB液体培养基，37℃、200rpm/min振荡培养过夜。
2、按实施例2所示方法与条件诱导蛋白表达，即：将过夜的菌液以1:100的体积比转接至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm/min振荡培养至OD600值为0.6，然后加入终浓度为0.1mmol/LIPTG，于30℃、200rpm/min振荡培养12h，收集菌体。
3、取步骤2得到的菌体，用PBS缓冲液重悬后进行超声破碎(超声破碎的参数：总超声时间30min，每工作5s停5s，功率200W)，然后12000rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀。
4、分别将步骤3得到的上清液、步骤4得到的沉淀和未加IPTG诱导的菌体进行SDS-PAGE，结果见图2。
图2中：1泳道为Marker；2泳道为破碎离心后的上清液；3泳道为破碎离心后的沉淀；4泳道为蛋白纯化过程中的杂质洗涤液。5泳道为最后纯化出的flagellin蛋白样品。由图2可以看出，BL21(DE3)/pET-28b-flagellin经过IPTG诱导后，表达的flagellin蛋白既有可溶性蛋白(44KDa)存在，也有包涵体蛋白存在。
5、取步骤4得到的上清液，采用His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)(康为世纪公司产品，产品货号CW0894)，具体操作如下：
先将5mlNi-Agarose填料装入亲和柱空柱，将步骤4得到的上清液缓慢流过亲和柱，再用含有10mM咪唑的PBS缓冲液洗脱6个柱体积以去杂质，最后用含500mM咪唑的PBS缓冲液洗脱5个柱体积并收集过柱后洗脱液，即为flagellin蛋白溶液。利用BCA法蛋白质浓度测定试剂盒(Solarbio公司产品，产品目录号PC0020-500微孔(50T))检测，flagellin蛋白溶液中的蛋白浓度为1.2mg/mL。
6、上清液和沉淀重悬液，以及纯化后的蛋白各取20μL上清液，分别加入5μL 5×SDS上样缓冲液(变性)重悬菌体，沸水浴中加热10min，13000r/min离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，结果见图2。
由图2可知，经过SDS-PAGE检测，纯化后获得一个分子量约42-kDa的包含组氨酸的表达蛋白(His-flagellin)。
实施例4表达蛋白flagellin蛋白激发植物免疫力的检测实验
拟南芥与油菜同为十字花科植物，flagellin引起拟南芥的抗性反应，对flagellin在油菜上的使用具有指导意义。现以拟南芥以实验对象，其具体实验过程如下：
(1)表达蛋白flagellin引起植物活性氧爆发(ROS)免疫反应
活性氧爆发(ROS)是植物早期免疫的重要手段，即在受到感染的部位产生一些具有氧化活性的物质如H2O2、氧负离子等，并通过其氧化作用达到杀毒抑菌的目的。调整flagellin蛋白终浓度为1μM，以水为空白对照，通过注射器渗透法侵染四周龄的拟南芥叶片，处理4h后。分别采集处理过的叶片放入六孔板，加入2ml 0.5mg/ml的DAB染色液染色六小时，更换洗脱液(体积比为3:1的酒精和乙酸的混合物)在95℃水浴脱色两次每次15min，再更换洗脱液放置30min后直接观察。每个处理三个生物学重复，结果见图3。
(2)表达蛋白flagellin引起植物的胼胝质积累免疫反应
细胞会产生胼胝质的积累来加强细胞壁的机械强度和堵塞病原体在细胞间扩散的通道，从而限制病原体进一步入侵。调整flagellin蛋白终浓度为1μM，以水为空白对照，通过注射器渗透法侵染四周龄的拟南芥叶片，处理12h后，采集处理过的叶片放入六孔板，加入适量洗脱液水平孵育4h。用终浓度0.1mg/ml的苯胺蓝染色液替换洗脱液，避光室温染色1h，通过荧光显微镜观察胼胝质积累情况。每个处理三个生物学重复，结果见图3。
(3)表达蛋白flagellin引起植物的细胞程序性死亡(PCD)免疫反应
样品处理同上，但是仅浸染拟南芥叶的叶脉左侧部分，叶脉右测作为空白对照。处理24小时后采用，加入终浓度为0.1mg/ml的台盼蓝染色液煮沸2min，室温静置染色8h。用1g/ml三氯乙醇脱色3天后，直接观察细胞死亡情况。每个处理三个生物学重复，结果见图3。
图3中A为蛋白激发植物的活性氧爆发免疫反应；B为蛋白激发植物的细胞程序性死亡免疫反应；C为蛋白激发植物的胼胝质积累免疫反应。
由图3可知，表达蛋白flagellin均可引起植物活性氧爆发(ROS)免疫反应、胼胝质积累免疫反应和细胞程序性死亡(PCD)免疫反应，即引起植物的抗性反应，进而用于农业生产病害的防治。
实施例5表达蛋白flagellin引起拟南芥相关抗病基因的表达
采用酶解法制备拟南芥原生质体，采用PEG转化法将抗病相关报告基因FRK1转化进入拟南芥原生质体中。分别向拟南芥原生质体培养液中加入1μM表达蛋白flagellin和水，在25℃，2200Lux培养12h后离心，然后收集培养的原生质体，经葡萄糖苷酸酶和荧光素酶报告基因检测试剂盒处理，并用酶标仪对葡萄糖苷酶和荧光素酶的酶活进行定量检测，每个处理三个生物学重复，具体操作过程如下：
①向EP管中加入50μl原生质体细胞裂解液，置于旋涡振荡器上振荡裂解原生质体细胞。
②将5μl步骤①所得的原生质体细胞裂解液与100μl Luc工作液依次加入96孔板，用酶标仪定量检测荧光素酶的活性。
将2μl步骤①所得的原生质体细胞裂解液与250μl MuG工作液依次加入96孔板，37℃静置0.5h，加入225μl 0.2mol/L Na2CO3使反应终止，用酶标仪定量检测葡萄糖苷酸酶的活性。
Luc值用LAV(Luciferase activity value，LAV)表示；Gus值用GAV(Gus activityvalue，GAV)表示；FRK1基因的相对表达强度用下列公式计算：
FRK1基因的相对表达强度＝(LAV/GAV)×1000
表达蛋白flagellin激发拟南芥相关抗病基因表达的结果见图4。
由图4可知，水处理的拟南芥原生质体FRK1基因的相对表达强度为0.22，flagellin处理的拟南芥原生质体FRK1基因的相对表达强度为1.18，抗病相关FRK1基因相对表达量上调5.33倍，flagellin明显激活植物免疫反应。
实施例6拟南芥活体抗DC3000实验
取丁香假单胞菌DC3000菌体接入20ml SOC+str(链霉素)液体培养基，于28℃过夜培养14-16h，测定其OD600值，梯度稀释至OD＝0.00005。将其注射四周龄健康的拟南芥叶片，一株4片，于第0天采样，记为T0，5株每株两片，于第3天采样，记为T3。每片叶子用打孔器打孔，取打孔的小圆片一片，T0天加入500μl 10mM MgCl2，在1.5ml ep管中磨碎，同一处理的四个样，各取50μl点在同一个SOC+str(链霉素)固体平板上(平板必须吹干才能保持点样形状)，28℃培养16-24h，拍照观察，并统计菌落生长情况。T3天5株每株的两片叶子作为一个样本，同样打孔取小圆片，加入250μl 10mM MgCl2，在1.5ml ep管中磨碎并用MgCl2逐级稀释至1×10-5。同一处理的五个样，包括稀释的每个样品(一个处理30个样品)各取10μl点在同一个SOC+str(链霉素)固体平板上(用方皿，平板必须吹干才能保持点样形状)，28℃培养16-24h，拍照观察，并统计菌落生长情况，结果见图5。
由图5可知，与未处理相比，添加1μM flagellin处理的拟南芥，其丁香假单胞菌DC3000的生长量被抑制29.8％。
此外，引起拟南芥、烟草和番茄病害的病原菌均为DC3000，添加了flagellin的拟南芥可抑制DC3000的生长，这可为烟草和番茄由DC3000引起的病害做参考。
实施例7表达蛋白flagellin诱导植物提高抗病性
(1)提高玉米对禾谷镰刀的抗性
将禾谷镰刀菌菌丝从平板接入CMC液体培养基，25℃避光培养3-7天，用纱布过滤，10000rpm/10min离心收集孢子，血球计数板统计孢子数目，调整浓度至2×105，放4℃冰箱保存(一个月内使用)。
取两周龄玉米叶片，取中间部分剪成5cm长度浸入1μg/ml生长素6BA溶液中，每个处理取12-13片叶子。加入终浓度为1μM的flagellin蛋白，以生长素6BA溶液为空白对照。分别将禾谷镰刀菌孢子液体均匀点在叶片上，28℃，12h光照12h黑暗条件下培养3-4天，观察发病情况。通过imageJ软件统计病斑面积百分比，结果见图6和图7。
由图6a和6b可知，该蛋白激发子显著提高了小麦对禾谷镰刀菌的抗性，使禾谷镰刀菌的侵染率降低58％。
(2)提高水稻对稻瘟病的抗性
稻瘟病菌接种在CM固体培养基上，28℃正置培养13-15天，用枪头将菌丝全部刮下，取少量5-10ml无菌水冲洗，用纱布过滤至50ml离心管，10000rpm离心10min，收集孢子，血球计数板统计孢子数目，调整浓度至1×106放常温保存(一周内使用)。
取四周龄的水稻叶片，取中间部分剪成5cm长度浸入1μg/ml生长素6BA溶液中，每个处理取12-13片叶子。加入终浓度为1μM的flagellin蛋白，以生长素6BA溶液为空白对照。分别将稻瘟菌孢子液体均匀点在叶片上，28℃，12h光照12h黑暗条件下培养3-4天，观察发病情况。通过imageJ软件统计病斑面积百分比，结果见图8和图9。
由图7a和7b可知，该蛋白激发子显著提高了水稻对稻瘟病的抗性，使稻瘟病菌的侵染率降低71％。
序列表
<110> 成都绿信诺生物科技有限公司
四川农业大学
<120> 一种提高植物抗病性的铜绿假单胞菌鞭毛蛋白及其编码基因和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Thr Val Asn Thr Asn Ile Ala Ser Leu Asn Thr Gln Arg
1 5 10 15
Asn Leu Asn Asn Ser Ser Ala Ser Leu Asn Thr Ser Leu Gln Arg Leu
20 25 30
Ser Thr Gly Ser Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu
35 40 45
Gln Ile Ala Asn Arg Leu Thr Ser Gln Val Asn Gly Leu Asn Val Ala
50 55 60
Thr Lys Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Leu Ala Gln Thr Ala Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Gln Gln Ser Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp Leu Ser
85 90 95
Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Asp Ser Glu Arg Thr Ala Leu
100 105 110
Asn Gly Glu Val Lys Gln Leu Gln Lys Glu Leu Asp Arg Ile Ser Asn
115 120 125
Thr Thr Thr Phe Gly Gly Arg Lys Leu Leu Asp Gly Ser Phe Gly Val
130 135 140
Ala Ser Phe Gln Val Gly Ser Ala Ala Asn Glu Ile Ile Ser Val Gly
145 150 155 160
Ile Asp Glu Met Ser Ala Glu Ser Leu Asn Gly Thr Tyr Phe Lys Ala
165 170 175
Asp Gly Gly Gly Ala Val Thr Ala Ala Thr Ala Ser Gly Thr Val Asp
180 185 190
Ile Ala Ile Gly Ile Thr Gly Gly Ser Ala Val Asn Val Lys Val Asp
195 200 205
Met Lys Gly Asn Glu Thr Ala Glu Gln Ala Ala Ala Lys Ile Ala Ala
210 215 220
Ala Val Asn Asp Ala Asn Val Gly Ile Gly Ala Phe Ser Asp Gly Asp
225 230 235 240
Thr Ile Ser Tyr Val Ser Lys Ala Gly Lys Asp Gly Ser Gly Ala Ile
245 250 255
Thr Ser Ala Val Ser Gly Val Val Ile Ala Asp Thr Gly Ser Thr Gly
260 265 270
Val Gly Thr Ala Ala Gly Val Ala Pro Ser Ala Thr Ala Phe Ala Lys
275 280 285
Thr Asn Asp Thr Val Ala Lys Ile Asp Ile Ser Thr Ala Lys Gly Ala
290 295 300
Gln Ser Ala Val Leu Val Ile Asp Glu Ala Ile Lys Gln Ile Asp Ala
305 310 315 320
Gln Arg Ala Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asp Asn Thr Ile
325 330 335
Asn Asn Leu Lys Asn Ile Gly Glu Asn Val Ser Ala Ala Arg Gly Arg
340 345 350
Ile Glu Asp Thr Asp Phe Ala Ala Glu Thr Ala Asn Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ala Ile Leu Ala Gln Ala Asn Gln
370 375 380
Leu Pro Gln Ser Val Leu Ser Leu Leu Arg
385 390
<210> 2
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccttga ccgtcaacac caacatcgct tcgctgaaca ctcagcggaa cctgaacaac 60
tcttccgcgt cgctgaacac ttcgctgcag cgtctgtcca ccggttcgcg catcaacagc 120
gccaaggacg acgccgccgg cctgcagatc gccaaccgtc tgaccagcca ggtcaacggc 180
ctgaacgtgg ctaccaagaa cgccaacgac ggtatctccc tggcgcagac cgctgaaggc 240
gccctgcagc agtcgaccaa catcctgcag cgtatgcgtg acctgtccct gcagtcggcc 300
aacggctcca acagcgactc cgagcgtacc gctctgaacg gcgaagtgaa gcaactgcag 360
aaagaactgg atcgtatcag caacaccacc accttcggtg gccgcaagct gctcgacggt 420
tccttcggcg tcgccagctt ccaggtgggt tcggccgcca acgaaatcat cagcgtcggc 480
atcgacgaga tgagcgcaga gtcgctgaac ggcacctact tcaaggctga tggcggcggt 540
gcggtcactg ctgcaaccgc ttcgggcacc gtcgacatcg cgatcggcat caccggcggc 600
agcgccgtga acgtcaaggt cgacatgaag ggcaacgaaa ccgccgagca ggcggctgcc 660
aagatcgccg cagcggtcaa cgacgccaac gtcggcatcg gtgccttcag cgacggcgat 720
accatcagct atgtttccaa agctggcaag gatggctccg gtgcgatcac tagcgcggtt 780
tccggcgttg tcatcgctga caccggcagc accggcgtag gcaccgcggc tggcgtagcc 840
ccttccgcta ccgctttcgc caagaccaac gacaccgtcg ccaagatcga catctccacc 900
gcgaagggcg ctcagtccgc cgtgctggtg atcgacgagg cgatcaagca gatcgacgcc 960
cagcgtgccg acctcggtgc ggtgcagaac cgcttcgaca acaccatcaa caacctgaag 1020
aacatcggtg agaacgtatc ggctgctcgc ggccggatcg aagacaccga cttcgcagcc 1080
gaaaccgcca acctgaccaa gaaccaagtg ctgcaacaag ccggcaccgc gatcctggcc 1140
caggccaacc agctgccgca gtcggttctg agcctgctgc gctaa 1185
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacaagctta tggctcttac tgttaat 27
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcactcgagt ctaagcaaag acaacacaga 30