阅读说明：本技术 戈氏副拟杆菌及其用于制备预防或治疗肥胖的组合物的用途 (Parabacteroides gomerdae and use thereof for preparing composition for preventing or treating obesity ) 是由 张志荣 蔡佑灵 林稚容 吴柏毅 于 2019-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及微生物领域,尤其是关于一种戈氏副拟杆菌及其用于制备防或治疗肥胖的组合物的用途。该新颖戈氏副拟杆菌的菌株是源自于个体肠胃道,且具有更佳良好的气动耐受性、以及更佳良好的耐酸性,而使其具有较佳的环境耐受性,以能使其能够更佳地适应不同的生存环境,尤其是具有强酸环境的个体的肠胃道；同时,该新颖戈氏副拟杆菌的菌株不仅能够有效的预防个体的体重上升,亦能够有效的减缓肥胖个体的体重上升,以达到治疗肥胖的功效；因此,本发明新颖戈氏副拟杆菌的菌株可用于制备预防及/或治疗肥胖的医药组合物。(The invention relates to the field of microorganisms, in particular to parabacteroides gomerdae and application thereof in preparing a composition for preventing or treating obesity. The novel strain of parabacteroides gasseri is originated from the gastrointestinal tract of an individual, has better pneumatic tolerance and better acid resistance, and has better environmental tolerance so as to be capable of better adapting to different living environments, particularly the gastrointestinal tract of the individual with a strong acid environment; meanwhile, the novel paradisella gasseri strain not only can effectively prevent the weight rise of an individual, but also can effectively slow down the weight rise of an obese individual so as to achieve the effect of treating obesity; therefore, the novel strain of paradisella gasseri of the present invention can be used for the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of obesity.)

戈氏副拟杆菌及其用于制备预防或治疗肥胖的组合物的用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其是关于一种戈氏副拟杆菌(Parabacteroidesgoldsteinii)及其用于制备预防或治疗肥胖的组合物的用途。

背景技术

近年来全球肥胖的发病率已经逐渐的增加，世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)更以「传染病」形容快速蔓延的肥胖，并称其为「全球肥胖症」(Globesity)，根据2014年世界卫生组织的估计，全球约有39％的人口超重(约19亿人)，更有13％的人口肥胖(约6亿人)。肥胖的个体会使多种健康问题的风险增加，并可能导致多种并发症的发生，包括高血压、高血脂、心血管疾病、睡眠呼吸中止、狭心症、退化性关节炎、尿酸过高骨关节炎、第二型糖尿病、及癌症等疾病。因此，肥胖会降低生活质量并可能导致过早的死亡，因此病态性肥胖病患的平均寿命比起正常体重者少了许多。虽然，基因可能参与肥胖的发展，但肥胖流行病主要归因于高热量饮食和久坐的生活方式。因此，生活方式的改变可以预防肥胖及其并发症。

虽然低卡路里饮食和定期运动能够用于减轻体重和治疗肥胖，但这些方法难以实施且其功效受到限制，主要是因为维持体内能量储存的适应性生理机制导致。另外，有部分药物已被批准用于长期肥胖症治疗(例如奥利司他、芬特明、或托吡酯)，然而该些药物常造成严重的副作用，因而限制了治疗功效及患者依从性；再者，减肥手术能够大幅的造成体重减轻，但这种干预式的手术并不适合所有超重的人；基于以上该些原因，研究安全且有效的方式减少体重及脂肪积累确实有其需求性。

因此，综上所述，找寻一源自于肠胃道且可良好适应肠胃道环境，又同时可有效达到戈氏副拟杆菌于减肥功效的新菌株，着实有其必要性。

发明内容

本发明的一目的在提供一种新颖戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii)菌株、其代谢产物、或其细菌成分的用途，藉由该戈氏副拟杆菌的作用，调整受施用者个体的生理作用，达到抑制或治疗个体肥胖的目的。

为了达成前述的目的，本发明提供一种戈氏副拟杆菌(Parabacteroidesgoldsteinii)MTS01菌株、该代谢产物、或该细菌成分用于制备预防及/或治疗肥胖的医药组合物的用途，其中该戈氏副拟杆菌的寄存编号为DSM 32939；且该医药组合物是包含该戈氏副拟杆菌的代谢产物。

在本发明的一实施例中，该新颖的戈氏副拟杆菌的菌株是提升其本身的环境耐受性，其中该环境耐受性是为气动耐受性(Aero-tolerance)及/或耐酸性(Acid-tolerance)，以能使本发明的戈氏副拟杆菌新颖菌株可更佳地适应不同的生存环境，尤其是具有强酸环境的个体的肠胃道。

在本发明的又一实施例中，包含本发明戈氏副拟杆菌新颖菌株的该医药组合物能够有效地直接抑制正常(即非肥胖)个体的体重上升，以有效的预防个体的肥胖；同时，其亦能够有效的抑制肥胖个体的体重上升，以有效的达到治疗肥胖的功效。

在本发明的又一实施例中，该戈氏副拟杆菌是一活菌；且该医药组合物可进一步包含除该戈氏副拟杆菌的外的它种细菌。

在本发明的另一实施例中，该戈氏副拟杆菌的有效剂量是每一个体每日至少给予2×10⁹CFUs/kg，且其给药期间可为8-16周。

利用本发明实施例的戈氏副拟杆菌MTS01菌株于预防或治疗个体肥胖时，可以口服方式给药。其给药时可与一般食物一同食用，因此制备包含戈氏副拟杆菌MTS01菌株医药组合物时，该医药组合物可进一步包括蛋白质、单醣、双醣、寡醣、多醣、碳水化合物、胺基酸、脂质、维他命或其任意组合的成分。

此外，于制备包含本发明实施例的戈氏副拟杆菌MTS01菌株的医药组合物时，亦可进一步加入所属技术领域所熟知的一医药学上可接受的赋形剂、载剂、辅剂及/或食品添加剂。而其剂型，可为但不限于一喷雾气体、一溶液、一半固态、一固态、一明胶胶囊、一软胶囊、一锭剂、一***片、一口香糖及/或一冷冻干燥粉末制剂，以便于将本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株传递至肠道及/或部分或全部定殖于肠道。同时，本发明实施例的戈氏副拟杆菌MTS01菌株或包含其他成分的医药组合物，亦可添加于食品、保健食品或膳食补充品中。

于先前的研究发现，在喂食高脂肪饮食(High Fat Diet,HFD)的小鼠中，使其口服戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii,P.goldsteinii)的JCM13446菌株可显著减少个体的肥胖情形。然而，该戈氏副拟杆菌的JCM13446菌株是购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC BAA-1180，且其是从临床的人肠源性腹腔液培养中所分离出的菌株，并非是直接源自于个体肠胃道中的分离菌株；因此，该菌株可能具有无法实际的良好适应于个体肠胃道环境的疑虑，且在作为口服益生菌的实际应用上亦可能会大幅减低其效用，例如无法通过胃脏及肠道的强酸或强碱环境，而使实际殖入于肠胃道菌丛的菌量较预期为低。

于全基因组分析结果可知，相较于先前自人肠源性腹腔液培养中所分离出的戈氏副拟杆菌JCM13446菌株，本发明从C57BL/6小鼠的粪便中所分离出的一戈氏副拟杆菌的新颖菌株MTS01中，预测共有5,498个编码蛋白质的基因，其中该5,498个编码蛋白质的基因中，有586个基因与JCM13446菌株仅具有70％以下的同一性，并且本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，更具有610个不存在于JCM13446菌株的基因，显示该二菌株之间具有高度的基因组变异性，且本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中独特的基因簇可能是藉由水平基因转移所获得的。

再者，于全基因组的蛋白质注释(Annotation)分析结果可知，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，编码与噬菌体、前噬菌体、转位、质体、编码多醣合成、及多醣利用的相关的基因数量都显著的多于JCM13446菌株；而由该结果进一步分析本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的中，与多醣相关的基因的种类后，发现在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，编码多醣、单醣、二糖与寡糖、中心碳水化合物代谢、及氨基糖相关的基因数量均显著的较高于JCM13446菌株，且亦发现在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，糖基转移酶的数量显著高于JCM13446菌株，此些结果显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株可能因为具有更佳地多醣利用能力，而具有更多的生长适应性基因，并使本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株能够更佳地适应个体肠胃道的环境。

而进一步测试该二菌株于环境耐受性，发现相较于JCM13446菌株，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株具有更佳良好的气动耐受性、以及更佳良好的耐酸性，而使其具有较佳的环境耐受性，以能使本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株更佳地适应不同的生存环境，尤其是具有强酸环境的个体的肠胃道。

最后，于预防肥胖的功效测试结果可知，相较于JCM13446菌株，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株能更显著的抑制喂食高脂饮食的个体体重的上升，并更有效减缓体重的改变率，且本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株亦能更显著的减缓喂食高脂饮食的个体的皮下脂肪重量的增加；显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株相较于JCM13446菌株具有更佳的预防肥胖的功效，能更有效的抑制个体肥胖，并达到减缓肥胖的效果；同时，于减缓个体肥胖体重上升的功效测试结果可知，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株不仅能够有效的预防个体的体重上升，亦能够有效的减缓肥胖个体的体重上升，以达到治疗肥胖的功效。

本发明实施例所提供一种新颖的戈氏副拟杆菌的菌株MTS01用于制备预防或治疗肥胖的医药组合物的用途；其中，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株为源自于肠胃道且可良好适应肠胃道环境的益生菌株，能够提高该益生菌株于实际应用上的效益，且该益生菌株又同时可更有效的达到预防及治疗肥胖的功效；因此，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株可有效地应用于肥胖的预防或治疗以及相关医药组合物的制备。

以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株的全基因序列分析结果的环状基因组图谱；

图2A是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株于蛋白质注释分析结果的同一性分布的柱形图；

图2B是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株于氨基酸序列的同一性分布的全视图；

图3A是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株的全基因的功能注释的柱形图；

图3B是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株的碳水化合物活性酶家族注释的柱形图；

图4是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株的糖基水解酶、糖基转移酶、及碳水化合物结合模块是列的箱线图；

图5是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株的气动耐受性的柱形图；

图6是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株的耐酸性的柱形图；

图7A是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株于减缓小鼠体重变化率的功效的折线图；#是比较组与喂食JCM13446菌株的组别比较具有显著差异的结果，*则是喂食JCM13446菌株的组别，与喂食本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株比较具有显著差异的结果；其中，#或*p值<0.05；##或**p值<0.01；###或***p值<0.001；

图7B是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株于改善小鼠体重增加的功效的柱形图。***p值<0.001；

图7C是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株于减缓小鼠皮下脂肪重量增加的功效的柱形图；**p值<0.01；***p值<0.001；

图7D是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株与JCM13446菌株于减缓小鼠附睪白色脂肪重量增加的功效的柱形图；**p值<0.01；

图8A是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株于减缓肥胖个体的体重变化率的功效的折线图；*p值<0.05；**p值<0.01；

图8B是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌(P.goldsteinii)MTS01菌株于减缓肥胖个体的体重增加的功效的柱形图；**p值<0.01。

具体实施方式

使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以单变量变异数分析(One-way ANOVA)进行统计分析。

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

定义

本文所述的「有效剂量」是表示能直接减缓哺乳动物或人类体重上升、或减缓肥胖的哺乳动物或人类体重上升所需戈氏副拟杆菌的数量。有效剂量依所治疗的生物种类或个体差异而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(dose escalation)以实验决定其有效剂量。

依据本发明，有关细菌培养的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

如本文中所使用的，用语「代谢产物」意为培养细菌时，经该细菌代谢后所分泌至细菌培养液中的物质，包含培养该菌的培养液。

如本文中所使用的，用语「细菌成分」意为培养细菌时，该菌直接或间接相关的衍生物质，包括但不限于该细菌的代谢产物、该细菌的结构、细菌相关活性及非活性成分等。

本发明提供一种以戈氏副拟杆菌MTS01菌株用于制备预防或治疗肥胖的医药组合物的用途。以下全基因组分析结果显示相较于已知的戈氏副拟杆菌JCM13446菌株，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株具有高度的基因组变异性；而全基因组的蛋白质注释分析结果显示，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株可能因为具有更佳地多醣利用能力，而具有更多的生长适应性基因，并使本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株能够更佳地适应个体肠胃道的环境；进一步步地，细胞实验测试结果显示，相较于已知的戈氏副拟杆菌JCM13446菌株，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株具有更佳良好的气动耐受性、以及更佳良好的耐酸性，而使其具有较佳的环境耐受性；而由动物实验测试结果显示，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株相较于JCM13446菌株具有更佳的预防肥胖的功效，能更有效的抑制个体肥胖，并达到减缓肥胖的效果，且本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株不仅能够有效的预防个体肥胖的功效，亦能够有效的减缓肥胖个体的体重上升，以达到治疗肥胖的功效。一般而言，每日给予一哺乳动物或一人类本发明的戈氏副拟杆菌的有效剂量为至少2×10⁹CFUs/kg，详细说明如下。

戈氏副拟杆菌菌株

本发明实施例中所用的戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii,P.goldsteinii)MTS01是一种能预防或治疗个体肥胖的是从C57BL/6小鼠的粪便中分离出一新颖的益生菌株(Probiotic bacteria)。该戈氏副拟杆菌是寄存于DSMZ德国微生物保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)；2018年10月29日；编号DSM 32939。戈氏副拟杆菌为绝对厌氧细菌，需于37℃的无氧培养箱培养约48小时；其中，该是统包含10％的二氧化碳、10％的氢气、及80％的氮气。该菌的液态培养液为NIH thioglycollate broth(TGC II)(购自BD，美国，编号为225710)，固态培养基则为Anaerobic blood agar plate(Ana.BAP)(购自启新生物科技公司，中国台湾)。该菌长期保存于-80度冰箱，保护液为25％的甘油，无须特殊降温处理，且可经由冷冻干燥进行保存，以稳定其活性。

以下以习知的同种戈氏副拟杆菌JCM13446菌株作为对照，分析与比较本发明新颖的戈氏副拟杆菌MTS01菌株具有何种特征及微生物学性质。

于全基因组分析结果可知，相较于先前自人肠源性腹腔液培养中所分离出的JCM13446菌株，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株的5,498个编码蛋白质的基因中，586个基因与JCM13446菌株仅具有70％以下的同一性，且MTS01菌株中更具有610个不存在于JCM13446菌株的基因，显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株相较于已知的戈氏副拟杆菌的菌株具有高度的基因组变异性；且于全基因组的蛋白质注释分析结果亦可知本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，编码与噬菌体、前噬菌体、转位、质体、编码多醣合成、及多醣利用的相关的基因数量都显著的多于JCM13446菌株，且编码多醣、单醣、二糖与寡糖、中心碳水化合物代谢、及氨基糖相关的基因数量均显著的较高于JCM13446菌株，且亦发现在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，糖基转移酶的数量显著高于JCM13446菌株，此些结果显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株，相较于已知的戈氏副拟杆菌的菌株具有更佳地多醣利用能力，而具有更多的生长适应性基因，并使本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株能够更佳地适应个体肠胃道的环境。

同时，由细胞实验亦得知本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株，相较于JCM13446菌株，具有更佳良好的气动耐受性、以及更佳良好的耐酸性，而使其具有较佳的环境耐受性，以能使本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株可更佳地适应不同的生存环境，尤其是具有强酸环境的个体的肠胃道。而由动物实验亦证实本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株，相较于JCM13446菌株，具能更显著的抑制喂食高脂饮食的个体体重的上升，并更有效减缓体重的改变率，且亦能更显著的减缓喂食高脂饮食的个体的皮下脂肪重量的增加，显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株，相较于已知的戈氏副拟杆菌的菌株，具有更佳的预防肥胖的功效；且本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株不仅能够有效的预防个体肥胖的功效，亦能够有效的减缓肥胖个体的体重上升，以达到治疗肥胖的功效；显示，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株可有效地应用于制备预防或治疗肥胖的相关医药组合物的用途。

益生菌株(Probiotic或Probiotic bacteria)为一微生物，其菌体、混合菌株、萃取物或代谢产物对于宿主本身是具有正面影响，通常源自于人体内、有益于肠道健康的活菌，亦可指外来补充、对身体可能有益的某些微生物；其中，该益生菌株的代谢产物为培养该益生菌株时，经该细菌代谢后所分泌至细菌培养液中的物质，包含培养该菌的培养液等。

依据本发明，有关细菌培养的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

实验小鼠

本发明实施例中使用4周龄且无特定病原体的C57BL/6J雄性小鼠，该小鼠是购自中国台湾实验研究院，且该所有小鼠自由得获取食物和无菌饮用水(DW，逆渗透等级的水)，并以每笼四至五只的数量，将小鼠饲养于室温(19-23℃)、12小时白天黑暗周期(12-hourday-dark cycle)的环境中。该小鼠是饲养在无特定病原体的设施中，并按照美国国立卫生研究院的指导原则进行治疗：其中，在实验的时间，该些自由获取食物及饮用水的小鼠于麻醉后，透过心脏穿刺的方法取出全血，并取出内脏脂肪组织(即附睾白色脂肪组织)以及肝脏进行秤重，且将其他器官与组织浸入液氮中，并储存在-80℃下，用于进行后续的各项分析。

实施例1戈氏副拟杆菌的JCM13446与本发明的MTS01菌株的全基因组比较

本发明的一实施例目的为比较本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的全基因组差异性与同一性，其中戈氏副拟杆菌JCM13446菌株的基因组序列已经保存在GenBank中(RefSeq assembly:GCF_000969835.1)；其中，戈氏副拟杆菌JCM13446菌株全基因组中具有7个重迭群(Contigs)，且其总基因组中总共具有6,486,757个核苷酸对(bps)。

为进行本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株的全基因组定序(De novosequencing)，首先使用Illumina与Pacbio的定序平台，以次世代定序(Next GenerationSequencing,NGS)测定本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株的全基因组，并得到数条基因序列的读取片段，接着再进行杂交组装(Hybrid-assembly)以构建MTS01菌株的全基因组；其主要步骤如下：首先，将从Pacbio定序平台所得的序列读取片段以Canu进行组装，接着使用Minimap2将该从Pacbio定序平台所得的序列读取片段绘制成重迭群以进行序列片段的组装，并通过Racon校正该组装的结果，例如将颠倒的重迭群转正或将组装错误的重迭群予以分开，接着再通过BWA将短的读取片段组装至重迭群中以补充空白的间隙，并以Pilon进行序列的校正。

其中，Canu是Celera Assembler的一个分支，专门为由PacBio等定序平台所得的高噪声单分子测序(High-noise single-molecule sequencing)的读取片段的组装而设计，而Celera Assembler则是是一种全基因组散弹枪定序(De novo whole-genomeshotgun,WGS)的DNA序列组装器；而Minimap2是一种通用的比对程序，用于将DNA序列或长mRNA序列与大型参考数据库进行比对，Minimap2的序列比对方式是以分离读取对齐(Split-read alignment)的方式进行，其采用凹形间隔(Concave gap)的方式进行长序列读取片段的***和删除，并以引入新的算法(heuristics)的方法以减少虚假对齐(Spurious alignments))；BWA则是专门针对较大的参考基因组(例如人类基因组)绘制低发散序列(Low-divergent sequences)的程序；Pilon则是用以比对分析所输入的基因组与读取片段之间的不一致性的程序，常用于手动校正所欲分析的全基因组序列。

接着，将所得的本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株的全基因组定序分析结果，以MetaGeneMark预测其中的开放读序框架(Open reading frame)，即预测全基因组序列中是否含有编码产生蛋白质的基因，而该些所预测的基因会再分别经由KEGG、COG、NCBI-NR三个数据数据库进行注释(Annotation)；其中，Blast(Basic Local Alignment Search Tool，其是一种用来比对生物序列的一级结构，例如不同蛋白质的氨基酸序列或不同基因的DNA序列的算法，主要是透过与一个已知包含若干序列的数据库中的信息进行比较，BLAST是用于寻找与待分析的序列相同或类似的已存在序列，藉以预测其功效或角色等)是于KEGG和NCBI-NR的数据数据库中进行搜索；而COG数据数据库的搜索则是透过CD搜索(ConservedDomain Search Service)完成；其中，该些数据数据库是内建于该些软件程序中的。最后，使用Circos制备本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株的环状基因组图(Circular genomeplot)，结果如图1所示；其中，Circos是一种用于可视化数据和讯息的软件，其是以环状分布的方式以可视化所得的基因组数据与讯息。

得到本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株的全基因定序以及基因序列分析后，接着利用BLASTP(Protein BLAST)比较与分析本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的于氨基酸及蛋白质阶层的差异性与同一性；其中，进行BLASTP时-evalue的设定值为1^-10、-max_target_seqs的设定值为1、-outfmt的设定值则为6。接着，利用The R Foundation网站(参见以下网址：https://www.r-project.org/)绘制戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株，于氨基酸的同一性分布的柱形图，结果如图2A所示；并再次使用Circos以制备两菌株的环状氨基酸同一性基因组的分布图，结果如图2B所示。

本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株的全基因序列分析结果的环状基因组图谱如图1所示；其中，由外侧至内侧的第一个圆圈表示基因组的位置、第二个圆圈表示正向股(Direct strand)上的预测基因、第三个圆圈表示互补股(Complementary strand)上的预测基因、第四个圆圈代表tRNA的位置、第五个圆圈代表rRNA的位置、最内圈则表示该菌株全基因组的GC含量(GC content)；由图1中可知，透过Illumina与Pacbio的定序平台完成本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株的全基因组序列总长度为6,881,351个碱基对，且基因组的注释结果显示，本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株中预测应含有5,498个编码蛋白质的预测基因。

本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株于蛋白质注释分析结果的分析结果如图2A所示；两菌株的环状氨基酸同一性的全基因组分布的全视图分析结果如图2B所示；其中，图2B是以戈氏副拟杆菌MTS01菌株的染色体组成的氨基酸序列为基础，与JCM13446菌株进行相似性的比较，图中颜色代表同一性(Identity)的分数(％)，包含几个具有低同一性(较浅的灰色)的簇(Clusters)的鉴定结果。

由图2A中可知，基于蛋白质注释分析的比较结果，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株的5,498个编码蛋白质的基因中，有586个基因与JCM13446菌株仅具有70％以下的同一性，并且本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中有610个基因，无法在JCM13446中找到相对应的基因，此结果显示该610个基因在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株是独特的；而由图2B中可知，观察两菌株中各基因于全基因组中的位置分布，发现在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的间有较低同一性的基因，以及前述该些不存在于JCM13446菌株的610个基因，在全基因组中是聚集在一起的，此结果暗示该些只存在于本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中的基因，可能是经由水平基因转移(Horizontal gene transfer)而获得的。而由以上该些全基因组分析的结果揭示，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株之间，具有高度的基因组变异性。

实施例2戈氏副拟杆菌的JCM13446与本发明的MTS01菌株的蛋白质注释比较

本发明的一实施例目的为比较本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株于编码的蛋白质的差异性与同一性。首先，使用RAST(Rapid Annotation using SubsystemTechnology)服务器(参见以下网址：http://rast.theseed.org/)以产生SEED蛋白质家族注释(SEED protein family annotation)，结果如图3A所示；其中，RAST是一种全自动服务，用于注释完整或接近完整的细菌和古细菌基因组，以在数千个基因组中提供一致和准确的基因组注释，其为整个谱系学发育树中的这些基因组提供高质量的基因组注释。

使用SEED蛋白质家族注释功能，分析比较本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的全基因的功能注释(Functional annotations)结果图如3A所示；根据实施例1结果所推测，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中独特的基因簇可能是藉由水平基因转移所获得的，而由图3A的结果可见，在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，编码与噬菌体(Phages)、前噬菌体(Prophages)、转位(Transposable elements)、及质体(Plasmids)相关的基因数量都显著的多于JCM13446菌株；此外，在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，编码多醣合成(Polysaccharides synthesis)及多醣利用(Polysaccharides utilization)的基因也多于JCM13446菌株。

基于以上结果，本实施例进一步分析本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的中与多醣相关的基因的种类；其中，是使用dbCAN2进行CAZy(Carbohydrate-active enzyme，碳水化合物活性酶)家族注释，结果如图3B所示；其中，dbCAN2是一种用于自动化进行碳水化合物活性酶注释的程序碳水化合物活性酶，而CAZy数据数据库中记载酵素家族的结构相关的催化(Structurally-related catalytic)、碳水化合物结合模块(Carbohydrate-binding modules)或其功能结构域(Functional domains)的降解、修饰、或糖苷键产生等信息。

分析比较本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株之间与多糖或碳水化合物相关的基因的注释结果如图3B所示；由图3B的结果可见，在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，编码多醣(Polysaccharides)、单醣(Monosaccharides)、二糖与寡糖(Di-andoligo-saccharides)、中心碳水化合物代谢(Central carbohydrate metabolism)、及氨基糖(Amino-sugars)相关的基因数量均显著的较高于JCM13446菌株；因此，该些结果显示与多醣相关的功能，是本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株之间的主要差异之一。

基于以上结果，本实施例进一步将前述透过CAZy数据数据库得出的碳水化合物活性酶注释的分析结果，以R分别产生本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的糖基水解酶(Glycosyl hydrolase,GH)、糖基转移酶(Glycosyltransferase,GT)、及碳水化合物结合模块(Carbohydrate-binding modules,CBM)系列的箱线图，结果如图4所示。

分析比较本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株之间碳水化合物活性酶的结果如图4所示；由图4的结果可见，在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，糖基转移酶的数量显著高于JCM13446菌株；因此，该结果显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株可能因为具有更佳地多醣利用能力，而具有更多的生长适应性基因，并使本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株能够更佳地适应个体肠胃道的环境。

实施例3戈氏副拟杆菌的JCM13446与本发明的MTS01菌株的气动耐受性比较

因戈氏副拟杆菌为绝对厌氧菌(Anaerobic bacterium)，因此本发明的一实施例为比较本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的气动耐受性(Aero-tolerance)，藉由观察该二菌株于供氧环境下的生存能力，比较该二菌株对环境的耐受性；首先，分别将相同菌数(1.0x10⁸ CFU)的本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株悬浮于生理食盐水(Normal saline)中，并于供氧环境(Aerobic condition)下于37℃培养，并分别于培养3小时及6小时后，测定本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株个别的存活率(即存活的菌数)，结果如图5所示。

本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的气动耐受性的实验结果如图5所示；其中以原始培养菌数为100％。由图5中可知，在供氧环境的条件下进行培养3小时后，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株的存活率约为18％，JCM13446菌株则仅有12％；而在供氧环境的条件下进行培养6小时后，仍可侦测到本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株的存活率，相反地JCM13446菌株则几乎已全数死亡；即本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株在供氧环境下的存活率明显高于JCM13446菌株，此结果显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株相较于JCM13446菌株，具有更佳良好的气动耐受性，而具有较佳的环境耐受性，能使本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株更佳地适应不同的生存环境，例如个体的肠胃道。

实施例4戈氏副拟杆菌的JCM13446与本发明的MTS01菌株的耐酸性比较

因戈氏副拟杆菌属于肠道细菌(Enteric bacterium)，因此本发明的一实施例为比较本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的耐酸性(Acid-tolerance)，藉由观察该二菌株于强酸环境下的生存能力，比较该二菌株对环境的耐受性；首先，分别将相同菌数(1.0x10⁸CFU)的本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株悬浮于pH值为3的如前所述的戈氏副拟杆菌液态培养液中，于37℃的无氧培养箱进行培养，并分别于培养1小时及2小时后，测定本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株个别的存活率(即存活的菌数)，结果如图6所示。

本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株的耐酸性的实验结果如图6所示。由图6中可知，在pH值为3的条件下进行培养1小时后，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株仍有约10⁷CFU的活菌数，而JCM13446菌株则仅有10³CFU的活菌数；在pH值为3的条件下进行培养2小时后，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株仍可维持有约5x10⁶CFU的活菌数，而JCM13446菌株则仅存有5x10²CFU的活菌数；即本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株在酸性环境下的存活率远高于JCM13446菌株，此结果显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株相较于JCM13446菌株，具有更佳良好的耐酸性，而具有较佳的环境耐受性，能使本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株更佳地适应不同的生存环境，尤其是具有强酸环境的个体的肠胃道。

实施例5本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株较JCM13446菌株有更佳地预防肥胖的功效

本发明的一实施例为比较本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株于预防肥胖的功效差异；首先，将4周龄的C57BL/6Narl雄性小鼠经过1周的饲养期后，分为以下四组(各组n＝5)：(1)喂食标准食物饲料(Standard chow diet，其中含有13.5％来自脂肪的能量来源，购买自LabDiet，美国，编号为LabDiet 5001)，并每日以胃内灌食(Intragastric gavage)的方式给予100μL的无菌磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebuffered saline,PBS,Vehicle)持续共八周的控制组、(2)喂食高脂肪食物饲料(High-fatdiet,HFD，其中含有60％来自脂肪的能量来源，购买自LabDiet，美国，编号为TestDiet58Y1)，并每日以胃内灌食的方式给予100μL的无菌磷酸盐缓冲生理盐水持续共八周的比较组、(3)喂食高脂肪食物饲料，并每日以胃内灌食的方式给予100μL的含有2x10⁹CFUs/kg的本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株的PBS持续共八周的实验组、及(4)喂食高脂肪食物饲料，并每日以胃内灌食的方式给予100μL的含有2x10⁹CFUs/kg的戈氏副拟杆菌JCM13446菌株的PBS持续共八周的实验组。

接着，于喂食的8周中，每周监测各组小鼠的体重，并将第8周的最终体重减去第0周的起始体重，以作为各组中各只小鼠的体重增加的数值并以百分比表示，其结果如图7B所示；再将体重增加的数值除以起始体重并以百分比表示，以计算出各组中各只小鼠的体重变化率，其结果如图7A所示；于喂食8周后将各组小鼠牺牲，并取出皮下脂肪秤重，以计算各组中各只小鼠的皮下脂肪重量(Subcutaneous fat mass)，其结果如图7C所示；另外亦取出内脏脂肪组织(即附睪白色脂肪组织)秤重，以计算各组中各只小鼠的附睪白色脂肪重量(Epididymal fat mass)，其结果如图7D所示。实验结果的数据以平均值±标准偏差显示，并以单变量变异数分析(One-way ANOVA)进行统计分析(#是比较组与喂食JCM13446菌株的组别比较具有显著差异的结果，*则是喂食JCM13446菌株的组别，与喂食本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株比较具有显著差异的结果；其中，#或*p值<0.05；##或**p值<0.01；###或***p值<0.001)。

本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株于减缓小鼠体重变化率的功效的实验结果如图7A所示；而本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株于改善小鼠体重增加的功效的实验结果如图7B所示；由图7A及图7B中可知，于喂食高脂饮食第四周开始至第八周，单纯喂食高脂饮食的比较组的体重变化率，皆显著的高于喂食本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株或喂食JCM13446菌株的小鼠，且喂食高脂饮食八周后，单纯喂食高脂饮食的比较组的体重增加量，亦皆显著的高于喂食两种戈氏副拟杆菌的菌株的小鼠，此些结果显示不论是本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株或是JCM13446菌株皆能有效地减缓个体的体重上升；然而，于喂食高脂饮食第五周开始至第八周，则可发现喂食本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株的小鼠，其体重变化率皆显著的低于喂食JCM13446菌株的小鼠，且喂食高脂饮食八周后，喂食本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株的小鼠，其体重增加量显著的低于喂食JCM13446菌株的小鼠，此些结果显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株相较于JCM13446菌株，能更有效的减缓个体的体重上升。

本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株于减缓小鼠皮下脂肪重量增加的功效的实验结果如图7C所示；由图7C中可知，单纯喂食高脂饮食八周后的比较组的皮下脂肪重量增加量，皆显著的高于喂食本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株或喂食JCM13446菌株的小鼠，此结果显示不论是本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株或是JCM13446菌株皆能有效地减缓个体的皮下脂肪重量的增加；然而亦可发现喂食本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株八周后的小鼠，其皮下脂肪重量增加的量显著的低于喂食JCM13446菌株的小鼠，此结果显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株相较于JCM13446菌株，能更有效的减缓个体的皮下脂肪重量的增加。

本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株于减缓小鼠附睪白色脂肪重量增加的功效的实验结果如图7D所示；由图7D中可知，单纯喂食高脂饮食八周后的比较组的附睪白色脂肪重量增加量，皆显著的高于喂食本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株或喂食JCM13446菌株的小鼠，此结果显示不论是本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株或是JCM13446菌株皆能有效地减缓个体的附睪白色脂肪重量的增加；而喂食本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株八周后的小鼠，其附睪白色脂肪重量增加的量与喂食JCM13446菌株的小鼠差异不大。

综合以上结果显示，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株相较于JCM13446菌株能更显著的抑制喂食高脂饮食的个体体重的上升，并更有效减缓体重的改变率，且本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株亦能更显著的减缓喂食高脂饮食的个体的皮下脂肪重量的增加；该些结果显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株相较于JCM13446菌株具有更佳的预防肥胖的功效，能更有效的抑制个体肥胖，并达到减缓肥胖的效果。

实施例6本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株减缓肥胖个体体重上升的功效

本发明的一实施例为测试本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株于减缓个体肥胖体重上升的功效；首先，将4周龄的C57BL/6Narl雄性小鼠经过1周的饲养期后，分为以下三组(各组n＝5)：(1)喂食标准食物饲料六周后，再于每日以胃内灌食的方式给予100μL的无菌磷酸盐缓冲生理盐水持续共十周的控制组、(2)喂食高脂肪食物饲料六周后，再于每日以胃内灌食的方式给予100μL的无菌磷酸盐缓冲生理盐水持续共十周的比较组、及(3)喂食高脂肪食物饲料六周后，再于每日以胃内灌食的方式给予100μL的含有2x10⁹CFUs/kg的本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株的PBS持续共十周的实验组。

于喂食的16周中，每周监测各组小鼠的体重，并将第16周的最终体重减去第0周的起始体重，以作为各组中各只小鼠的体重增加的数值并以百分比表示，其结果如图8B所示；再将体重增加的数值除以起始体重并以百分比表示，以计算出各组中各只小鼠的体重变化率，其结果如图8A所示。实验结果的数据以平均值±标准偏差显示，并以单变量变异数分析(One-way ANOVA)进行统计分析(其中，*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株于减缓肥胖个体的体重变化率的功效的实验结果如图8A所示：本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株于减缓肥胖个体的体重增加的功效的实验结果如图8B所示。由图8A及8B中可知，在喂食高脂饮食六周后，确实能增加小鼠的体重，以建立肥胖的动物模型，而在开始喂食本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株三周后，能显著减缓肥胖小鼠体重上的的情况，且在持续喂食本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株共十周后，能够显著的抑制肥胖小鼠约40％的体重增加；此些结果显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株不仅能够有效的预防个体肥胖的功效，亦能够有效的减缓肥胖个体的体重上升，以达到治疗肥胖的功效。

利用本发明实施例的戈氏副拟杆菌MTS01菌株于预防或治疗个体肥胖时，可以口服方式给药。其给药时可与一般食物一同食用，因此制备包含戈氏副拟杆菌MTS01菌株医药组合物时，该医药组合物可进一步包括蛋白质、单醣、双醣、寡醣、多醣、碳水化合物、氨基酸、脂质、维他命或其任意组合的成分。

此外，于制备包含本发明实施例的戈氏副拟杆菌MTS01菌株的医药组合物时，亦可进一步加入所属技术领域所熟知的一医药学上可接受的赋形剂、载剂、辅剂及/或食品添加剂。而其剂型，可为但不限于一喷雾气体、一溶液、一半固态、一固态、一明胶胶囊、一软胶囊、一锭剂、一***片、一口香糖及/或一冷冻干燥粉末制剂，以便于将本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株传递至肠道及/或部分或全部定殖于肠道。同时，本发明实施例的戈氏副拟杆菌MTS01菌株或包含其他成分的医药组合物，亦可添加于食品、保健食品或膳食补充品中。

综上所述，于全基因组分析结果可知，相较于先前自人肠源性腹腔液培养中所分离出的戈氏副拟杆菌JCM13446菌株，本发明从C57BL/6小鼠的粪便中所分离出的一戈氏副拟杆菌的新颖菌株MTS01中，预测共有5,498个编码蛋白质的基因，其中该5,498个编码蛋白质的基因中，有586个基因与JCM13446菌株仅具有70％以下的同一性，并且本发明戈氏副拟杆菌MTS01菌株中更具有610个不存在于JCM13446菌株的基因，显示该二菌株之间具有高度的基因组变异性，且本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中独特的基因簇可能是藉由水平基因转移所获得的。

再者，于全基因组的蛋白质注释分析结果可知，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，编码与噬菌体、前噬菌体、转位、质体、编码多醣合成、及多醣利用的相关的基因数量都显著的多于JCM13446菌株；而由该结果进一步分析本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株与JCM13446菌株之中，与多醣相关的基因的种类后，发现在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，编码多醣、单醣、二糖与寡糖、中心碳水化合物代谢、及氨基糖相关的基因数量均显著的较高于JCM13446菌株，且亦发现在本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株中，糖基转移酶的数量显著高于JCM13446菌株，此些结果显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株可能因为具有更佳地多醣利用能力，而具有更多的生长适应性基因，并使本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株能够更佳地适应个体肠胃道的环境。

而进一步测试该二菌株于环境耐受性，发现相较于JCM13446菌株，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株具有更佳良好的气动耐受性、以及更佳良好的耐酸性，而使其具有较佳的环境耐受性，以能使本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株更佳地适应不同的生存环境，尤其是具有强酸环境的个体的肠胃道。

最后，于预防肥胖的功效测试结果可知，相较于JCM13446菌株，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株能更显著的抑制喂食高脂饮食的个体体重的上升，并更有效减缓体重的改变率，且本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株亦能更显著的减缓喂食高脂饮食的个体的皮下脂肪重量的增加；显示本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株相较于JCM13446菌株具有更佳的预防肥胖的功效，能更有效的抑制个体肥胖，并达到减缓肥胖的效果；同时，于减缓个体肥胖体重上升的功效测试结果可知，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株不仅能够有效的预防个体的体重上升，亦能够有效的减缓肥胖个体的体重上升，以达到治疗肥胖的功效。

本发明实施例所提供一种新颖的戈氏副拟杆菌的菌株MTS01用于制备预防或治疗肥胖的医药组合物的用途；其中，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株为源自于肠胃道且可良好适应肠胃道环境的益生菌株，能够提高该益生菌株于实际应用上的效益，且该益生菌株又同时可更有效的达到预防及治疗肥胖的功效；因此，本发明的戈氏副拟杆菌MTS01菌株可有效地应用于肥胖的预防或治疗以及相关医药组合物的制备。

【生物材料寄存】

DSMZ-德国微生物保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen,DSMZ)；地址：德国布伦瑞克市38124因霍芬大街7B；2018年10月29日；编号DSM 32939。