阅读说明：本技术 植物衰老相关蛋白GhWRKY91及其编码基因和应用 (Plant senescence-associated protein GhWRKY91, and coding gene and application thereof ) 是由 喻树迅 顾丽姣 魏恒玲 王寒涛 王聪聪 马亮 苏政政 于 2018-08-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种植物衰老相关蛋白GhWRKY91及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质为序列表中序列1所示的蛋白质。编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。本发明还保护所述蛋白的应用：调控植物衰老进程；调控植物叶片衰老进程；抑制植物衰老进程；抑制植物叶片衰老进程；调控植物干旱胁迫环境中的衰老进程；调控植物叶片干旱胁迫环境中的衰老进程；调控植物的抗旱性；提高植物的抗旱性。本发明还保护一种制备转基因植物的方法,包括如下步骤：在出发植物中导入所述基因,得到衰老进程延缓的转基因植物。本发明对于植物衰老机制的研究具有重大的理论价值。对于培育抗早衰植物,特别是培育抗早衰棉花具有重大的应用价值。(The invention discloses a plant senescence-associated protein GhWRKY91, and a coding gene and application thereof. The protein provided by the invention is the protein shown in a sequence 1 in a sequence table. Nucleic acid molecules encoding such proteins are also within the scope of the invention. The invention also protects the application of the protein: regulating the senescence process of plants; regulating and controlling the aging process of plant leaves; inhibiting the senescence process of plants; inhibiting the aging process of plant leaves; regulating and controlling the aging process in the drought stress environment of the plant; regulating and controlling the aging process of plant leaves in drought stress environment; regulating and controlling the drought resistance of the plant; improve the drought resistance of the plants. The invention also provides a method for preparing a transgenic plant, which comprises the following steps: the gene is introduced into the original plant to obtain the transgenic plant with the senescence process being delayed. The invention has great theoretical value for the research of plant senescence mechanism. Has great application value for cultivating premature senility resistant plants, in particular to premature senility resistant cotton.)

植物衰老相关蛋白GhWRKY91及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物衰老相关蛋白GhWRKY91及其编码基因和应用。

背景技术

衰老是植物发育不可分割的一部分，是发育的最后阶段。在衰老过程中，叶片细胞在结构、代谢、基因表达方面发生高度协调的变化。细胞结构最早、最明显的变化是叶绿体分解。代谢方面，碳代谢(光合作用)被叶绿体和大分子物质物质如蛋白质、膜脂、RNA等的分解代谢所取代。在分子水平上，上述变化伴随着基因表达的变化。

衰老是细胞程序化死亡。叶片衰老在营养元素的循环和再利用等生理活动中起着重要作用。衰老引起的叶片同化功能减退限制了作物产量的发挥。

棉花是中国重要的经济作物和纺织原料，对中国国民经济的发展具有无可替代的作用。我国粮棉争地的矛盾突出，短季棉品种的选育和推广，可以缓解粮棉争地的矛盾，但短季棉早熟往往伴随着早衰。在棉花生产中，棉花早衰现象的发生，造成铃重减轻、衣分下降、纤维强度和成熟度下降，使棉花减产降质。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物衰老相关蛋白GhWRKY91及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，获自陆地棉(Gossypium hirsutum)，命名为GhWRKY91蛋白，为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的植物衰老相关的蛋白质；

(a4)来源于陆地棉且与(a1)具有98％以上同一性且与植物衰老相关的蛋白质。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL
HA	9	YPYDVPDYA

蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子为DNA分子或RNA分子。

编码所述蛋白质的DNA分子(命名为GhWRKY91基因)为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)来源于陆地棉且与(b1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

含有GhWRKY91基因的表达盒、重组载体或重组微生物均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。

所述重组表达载体具体可为：在pBI121质粒的XbaI和SmaI酶切位点之间***序列表的序列2所示的DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护GhWRKY91蛋白的应用，为如下(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、(c6)、(c7)、(c8)、(c9)或(c10)：

(c1)调控植物衰老进程；

(c2)调控植物叶片衰老进程；

(c3)抑制植物衰老进程；

(c4)抑制植物叶片衰老进程；

(c5)调控植物干旱胁迫环境中的衰老进程；

(c6)调控植物叶片干旱胁迫环境中的衰老进程；

(c7)抑制植物干旱胁迫环境中的衰老进程；

(c8)抑制植物叶片干旱胁迫环境中的衰老进程；

(c9)调控植物的抗旱性；

(c10)提高植物的抗旱性。

所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为棉属植物或拟南芥属植物。所述棉属植物具体可为陆地棉。所述拟南芥属植物具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明还保护GhWRKY91基因的应用，为如下(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)、(d6)、(d7)、(d8)、(d9)或(d10)：

(d1)培育衰老性状改变的转基因植物；

(d2)培育叶片衰老性状改变的转基因植物；

(d3)培育衰老进程延缓的转基因植物；

(d4)培育叶片衰老进程延缓的转基因植物；

(d5)培育早衰改善的转基因植物；

(d6)培育叶片早衰改善的转基因植物；

(d7)培育在干旱胁迫环境中衰老进程延缓的转基因植物；

(d8)培育在干旱胁迫环境中叶片衰老进程延缓的转基因植物；

(d9)培育抗旱性改变的转基因植物；

(d10)培育抗旱性增强的的转基因植物。

所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为棉属植物或拟南芥属植物。所述棉属植物具体可为陆地棉。所述拟南芥属植物具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入GhWRKY91基因，得到衰老进程延缓的转基因植物。所述基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物。携带有所述基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到出发植物中。所述出发植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为棉属植物或拟南芥属植物。所述棉属植物具体可为陆地棉。所述拟南芥属植物具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。所述衰老进程延缓具体可为叶片衰老进程延缓。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中GhWRKY91蛋白的含量和/或活性，从而延缓目的植物的衰老进程。所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为棉属植物或拟南芥属植物。所述棉属植物具体可为陆地棉。所述拟南芥属植物具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。所述延缓目的植物的衰老进程具体可为延缓目的植物叶片的衰老进程。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入GhWRKY91基因，得到抗旱性增强的转基因植物。所述基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物。携带有所述基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到出发植物中。所述出发植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为棉属植物或拟南芥属植物。所述棉属植物具体可为陆地棉。所述拟南芥属植物具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。所述抗旱性增强具体体现为在干旱胁迫环境中衰老进程延缓。所述衰老进程延缓具体可为叶片衰老进程延缓。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中GhWRKY91蛋白的含量和/或活性，从而增强目的植物的抗旱性。所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为棉属植物或拟南芥属植物。所述棉属植物具体可为陆地棉。所述拟南芥属植物具体可为哥伦比亚生态型拟南芥。所述增强目的植物的抗旱性具体体现为在使目的植物在干旱胁迫环境中的衰老进程延缓。所述衰老进程延缓具体可为叶片衰老进程延缓。

本发明对于植物衰老机制的研究具有重大的理论价值。对于培育抗早衰植物，特别是培育抗早衰棉花具有重大的应用价值。

附图说明

图1为GhWRKY91基因的相对表达水平。

图2为步骤四中的自然衰老表型照片。

图3为步骤四中AtSAG12基因和AtSAG13基因的相对表达量。

图4为营养钵中的区域划分示意图。

图5为步骤五中的干旱处理表型照片。

图6为步骤五AtSAG12基因和AtSAG13基因的相对表达量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

从陆地棉中棉所74号中发现一个新蛋白，如序列表的序列1所示(273aa)，将其命名为GhWRKY91蛋白。GhWRKY91蛋白的相对分子量为29.82kDa，等电点为5.13。将编码GhWRKY91蛋白的基因命名为GhWRKY91基因。陆地棉中棉所74号的cDNA中，GhWRKY91基因的编码框如序列表的序列2所示(822bp)。

实施例、

一、重组表达载体的构建

1、提取盛花期陆地棉中棉所74号的植株的成熟叶片，提取总RNA。

2、将步骤1得到的总RNA进行反转录，得到cDNA。

3、以步骤2得到的cDNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

F1：5’-CTAGTCTAGAATGGACAGCGGTGGTAG-3’；

R1：5’-TCCCCCGGGTCAGCAGATCCCAACCTG-3’。

4、用限制性内切酶XbaI和SmaI双酶切步骤3得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。

5、用限制性内切酶XbaI和SmaI双酶切pBI121质粒，回收载体骨架。

6、将步骤4得到的酶切产物和步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pBI121-GhWRKY91。根据测序结果，对重组质粒pBI121-GhWRKY91进行结构描述如下：在pBI121质粒的XbaI和SmaI酶切位点之间***了序列表的序列2所示的DNA分子。

二、转基因植物的获得

1、将重组质粒pBI121-GhWRKY91导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌采用花序浸染法转化哥伦比亚型拟南芥，然后培养植株，收获成熟种子，即为T0代种子。

3、将T0代种子消毒后播种于含50mg/L的1/2MS培养基平板上，先4℃春化3天，然后转移到人工气候试验箱中培养10天左右(正常生长的为阳性植株，叶片变黄且不再生长的植株为阴性植株)，将阳性植株移栽到花盆中培养1个月后进行PCR鉴定(采用F2和R2组成的引物对，如果得到扩增产物植株为阳性，如果未得到任何扩增产物植株为阴性)，得到T0代PCR阳性植株。

F2：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’；

R2：5’-TCAGCAGATCCCAACCTG-3’。

4、T0代PCR阳性植株自交并获得种子，得到T1代种子；将T1代种子按照步骤3的方法进行培养和鉴定，得到T1代PCR阳性植株。

5、T1代PCR阳性植株自交并获得种子，得到T2代种子；将T2代种子按照步骤3的方法进行培养和鉴定，得到T2代PCR阳性植株。

6、T2代PCR阳性植株自交并获得种子，得到T3代种子；随机抽样有统计学意义的T3代种子按照步骤3的方法进行培养和鉴定。

对于某一T2代PCR阳性植株来说，如果其自交得到T3代种子(抽样)长成的植株均为PCR阳性，该T2代PCR阳性植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系。

7、随机对3个纯合的转基因株系(OE91-12、OE91-13、OE91-20)的T3代植株进行检测：提取总RNA并反转录得到cDNA，以拟南芥UBQ10基因为内参基因，通过荧光定量PCR检测GhWRKY91基因的相对表达水平。将哥伦比亚型拟南芥作为转基因株系的对照。

用于检测GhWRKY91基因的引物对如下：

F3：5’-GCTGAATCTCCTCCTCCTTCT-3’；

R3：5’-CGGGAACCTTCAACGTCCTT-3’。

用于检测UBQ10基因的引物对如下：

F4：5’-AGATCCAGGACAAGGAAGGTATTC-3’；

R4：5’-CGCAGGACCAAGTGAAGAGTAG-3’。

GhWRKY91基因的相对表达水平见图1。哥伦比亚生态型拟南芥(用WT表示)中无表达，各个转基因植株中GhWRKY91基因高表达。

三、转空载体植物的获得

用pBI121质粒代替重组质粒pBI121-GhWRKY91，按照步骤二操作，得到转空载体植株。

四、在正常培养条件下的鉴定

对3个纯合的转基因株系(OE91-12、OE91-13、OE91-20)的T3代种子(每个株系20粒)、转空载体株系的T3代种子(20粒)、哥伦比亚生态型拟南芥的种子(20粒)进行检测：

1、种子春化3天，然后播种于1/2MS培养基平板培养10天。

2、完成步骤1后，幼苗移栽至装有培养基质(由1体积份营养土和1体积份蛭石混匀得到)的营养钵中(每个营养钵4株)，然后进行培养。培养条件：22℃、16小时光照/8小时黑暗、光强为100μmol m^-2s^-1。

分别于步骤2中培养25天后和培养39天后拍照。照片见图2，WT表示哥伦比亚生态型拟南芥。培养25天后，哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体植株可以观察到黄色衰老叶片，转基因株系植株未观察到黄色衰老叶片。培养39天后，哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体植株均可以观察到大量黄色衰老叶片(两者表型无显著差异)，转基因株系植株的黄色衰老叶片数量远远少于哥伦比亚生态型拟南芥。

于步骤2中培养25天后，取植株的莲座叶，提取总RNA并反转录成cDNA，以拟南芥UBQ10基因为内参基因，采用荧光定量PCR检测AtSAG12基因和AtSAG13基因的相对表达量。用于检测AtSAG12基因的引物对：TCCAATTCTATTCGTCTGGTGTGT；CCACTTTCTCCCCATTTTGTTC。用于检测AtSAG13基因的引物对：GTGCCAGAGACGAAACTC；R6：GCTGTAAACTCTGTGGTC。结果见图3，WT表示哥伦比亚生态型拟南芥。哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体植株中两个衰老基因的相对表达水平无显著差异。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，转基因株系植株的两个衰老基因的相对表达水平显著降低。

结果表明，过表达GhWRKY91基因可以抑制叶片的自然衰老。

五、在干旱条件下的鉴定

对3个纯合的转基因株系(OE91-12、OE91-13、OE91-20)的T3代种子(每个株系24粒)、哥伦比亚生态型拟南芥的种子(24粒)进行检测：

1、种子春化3天，然后播种于1/2MS培养基平板培养10天。

2、正常条件处理(即对照处理)

完成步骤1后，幼苗移栽至装有培养基质(由1体积份营养土和1体积份蛭石混匀得到)的营养钵中并培养11天，然后正常浇水管理，并培养5天。培养条件：22℃、16小时光照/8小时黑暗、光强为100μmol m^-2s^-1。设置1个营养钵(营养钵1)，营养钵划分为4个区域，区域划分示意见图4(WT表示哥伦比亚生态型拟南芥)，每个区域每个株系8株。

3、干旱处理

完成步骤1后，幼苗移栽至装有培养基质(由1体积份营养土和1体积份蛭石混匀得到)的营养钵中并培养11天，然后浇灌15％PEG600溶液(一次性浇透)并培养5天。培养条件：22℃、16小时光照/8小时黑暗、光强为100μmol m^-2s^-1。设置2个营养钵(营养钵2和营养钵3)，每个营养钵划分为4个区域，区域划分示意见图4(WT表示哥伦比亚生态型拟南芥)，每个区域每个株系8株。

完成步骤2和步骤3后，拍照。照片见图5。正常条件下，哥伦比亚生态型拟南芥和转基因植株的表型无明显差异。干旱处理后，哥伦比亚生态型拟南芥出现叶片黄化等衰老表型，转基因拟南芥未出现衰老表型。

完成步骤2和步骤3后，取植株的莲座叶，提取总RNA并反转录成cDNA，以拟南芥UBQ10基因为内参基因，采用荧光定量PCR检测AtSAG12基因和AtSAG13基因的相对表达量。用于检测AtSAG12基因的引物对：TCCAATTCTATTCGTCTGGTGTGT；CCACTTTCTCCCCATTTTGTTC。用于检测AtSAG13基因的引物对：GTGCCAGAGACGAAACTC；R6：GCTGTAAACTCTGTGGTC。结果见图6。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，转基因株系植株的两个衰老基因的相对表达水平显著降低。

结果表明，过表达GhWRKY91基因可以抑制干旱诱导的叶片衰老。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 植物衰老相关蛋白GhWRKY91及其编码基因和应用

<130> GNCYX181716

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 1

Met Asp Ser Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Phe Arg Lys Val Arg Asn

1 5 10 15

Pro Phe Val Thr Asp Gln Glu Leu Glu Glu Ser Asp Asn Val Ser Ser

20 25 30

Val Thr Gly Ala Glu Ser Pro Pro Pro Ser Thr Thr Lys Lys Gly Lys

35 40 45

Arg Ser Met Gln Lys Arg Val Val Ser Val Pro Ile Lys Asp Val Glu

50 55 60

Gly Ser Arg Leu Lys Gly Glu Gly Ala Pro Pro Ser Asp Ser Trp Ala

65 70 75 80

Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Pro Ile Lys Gly Ser Pro Tyr Pro Arg

85 90 95

Gly Tyr Tyr Arg Cys Ser Ser Ser Lys Gly Cys Pro Ala Arg Lys Gln

100 105 110

Val Glu Arg Ser Arg Val Asn Pro Thr Met Leu Val Ile Thr Tyr Ser

115 120 125

Cys Glu His Asn His Ala Trp Pro Ala Ser Arg His Asn Asn Thr Ser

130 135 140

Ala Lys Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Glu Ala Ser Glu Ser Pro

145 150 155 160

Thr Lys Ser Ser Thr Ala Val Lys His Glu Pro Ser Thr Ser Gln Pro

165 170 175

Asp Thr Glu Pro Asp Ser Gly Met Glu Asp Gly Phe Ala Cys Leu Thr

180 185 190

Glu Asp Ser Ile Leu Thr Thr Gly Asp Glu Phe Ala Trp Phe Gly Glu

195 200 205

Met Glu Thr Thr Ser Ser Thr Val Leu Glu Ser Pro Leu Phe Ser Glu

210 215 220

Arg Asp Asn Ser Glu Ala Asp Asp Thr Ala Met Ile Phe Pro Met Arg

225 230 235 240

Glu Glu Asp Glu Ser Leu Phe Ala Asp Leu Glu Glu Leu Pro Glu Cys

245 250 255

Ser Phe Val Phe Arg His Gln Arg Asn Val Gly Pro Gln Val Gly Ile

260 265 270

Cys

<210> 2

<211> 822

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 2

atggacagcg gtggtagtag cagcagcagt ttcaggaaag ttaggaaccc ttttgtcact 60

gaccaagaat tagaagaaag tgacaacgtt tcgtcagtaa ctggagctga atctcctcct 120

ccttctacta ctaaaaaagg taaaagatcc atgcagaaaa gagtggtgtc agtaccaatc 180

aaggacgttg aaggttcccg ccttaaaggt gagggtgctc caccgtctga ttcttgggca 240

tggcggaagt acggccaaaa acctatcaaa gggtcacctt acccgagggg ttattaccgg 300

tgtagtagct caaagggatg tccggcgagg aaacaagtcg agaggagccg tgtaaaccct 360

acaatgttag tgatcacata ctcttgcgaa cacaatcacg cttggcctgc ttctagacac 420

aacaacacat ccgctaaaca agcggcggcg gcggcggcgg gggaagcttc cgagtcaccg 480

actaaatcca gcacagctgt aaagcacgag ccgtccacgt cgcaaccgga tacggaaccg 540

gattcaggga tggaagatgg cttcgcttgt ctgacggagg attcgattct tacgacgggg 600

gatgaattcg cttggttcgg ggagatggaa accacgtcgt cgacggtatt ggagagcccg 660

ttgttttcgg aaagggataa cagtgaggcg gatgacacgg cgatgatttt ccccatgagg 720

gaagaagacg aatcgttatt cgctgatctc gaagagttgc cggagtgctc gtttgtgttt 780

cggcaccaac ggaatgtggg accacaggtt gggatctgct ga 822