阅读说明：本技术 Ataf2蛋白及其相关生物材料在调控植物对橡胶树白粉菌的抗病性中的应用 (Application of ATAF2 protein and related biological materials thereof in regulation and control of disease resistance of plants to rubber tree powdery mildew ) 是由 梅双双 戎伟 于 2019-12-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了ATAF2蛋白及其相关生物材料在调控植物对橡胶树白粉菌的抗病性中的应用。本发明首先对接种橡胶树白粉菌的拟南芥野生型进行分析,发现接种4天后拟南芥转录因子ATAF2发生显著上调表达,推测ATAF2受橡胶树白粉菌的诱导表达,接下来通过对拟南芥突变体ataf2进行橡胶树白粉菌接种实验进一步验证,发现ataf2突变体表现出对橡胶树白粉菌感病的表型,可正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性,并且利用GST pull-down和免疫共沉淀实验发现ATAF2与EDS1二者可以直接发生相互作用,为将来进一步探讨EDS1参与的植物抗病信号通路奠定了很好的基础。(The invention discloses application of ATAF2 protein and related biological materials thereof in regulating and controlling disease resistance of plants to rubber tree powdery mildew. According to the invention, firstly, the wild type of arabidopsis thaliana inoculated with powdery mildew is analyzed, the fact that the transcription factor ATAF2 of arabidopsis thaliana is remarkably up-regulated and expressed 4 days after inoculation is found, the fact that ATAF2 is induced and expressed by powdery mildew is presumed, then, the experiment of inoculating the powdery mildew to arabidopsis thaliana mutant ATAF2 is further verified, the fact that the ATAF2 mutant shows the phenotype of the powdery mildew infection of the rubber tree is found, the disease resistance of arabidopsis thaliana to the powdery mildew can be positively regulated, GST pull-down and co-immunoprecipitation experiments are utilized to find that ATAF2 and EDS1 can directly interact, and a good foundation is laid for further discussing a plant disease resistance signal path involved in EDS1 in the future.)

ATAF2蛋白及其相关生物材料在调控植物对橡胶树白粉菌的 抗病性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及ATAF2蛋白及其相关生物材料在调控植物对橡胶树白粉菌的抗病性中的应用。

背景技术

自然界中，植物利用自身的2道免疫防线来抵御病原微生物的侵染。第1道免疫防线是病原菌相关分子模式或微生物相关因子(PAMPs/MAMPs，pathogen or microbeassociated molecular patterns)激发的免疫反应(PTI，PAMPs triggered immunity)。第2道免疫防线是植物抗病基因(R gene，resistance)识别病原微生物的效应蛋白后激发免疫反应(ETI，effectors triggered immunity)，该免疫反应在侵染部位产生大量的细胞死亡，又称为超敏反应(HR，Hypersensitive Response)。

EDS1(enhanced disease susceptibility 1)在植物的2道免疫防线中都发挥着非常重要的作用。尤其在第2道免疫防线中，植物大多数TIR-NB-LRR(Toll-Interleukin1Receptor-nucleotide binding-leucine-rich repeat)类抗病基因功能的正常发挥都需要EDS1的参与。EDS1不仅可以与病原菌效应蛋白发生相互作用，还可以与植物体内TIR-NB-LRR类蛋白形成复合体，从而实现抗病信号通路的正常传递。同时，植物体内存在与EDS1结构同源的另外两个蛋白PAD4(Phytoalexin Deficient 4)和SAG101(Senescence Associated Gene 101)，三者都含有一个酰基酯酶结构域和一个EP(EDS1-PAD4)结构域。EDS1可以分别与另外两个蛋白发生相互作用，介导不同的抗病信号通路。最近研究发现，三者还可以形成复合体来发挥功能。目前，关于EDS1下游信号通路了解的还比较少，EDS1正调控水杨酸的合成，但具体的作用元件是什么，有待进一步研究。

橡胶树白粉菌(Oidium Heveae)是一种专性活体寄生真菌，侵染橡胶树引发橡胶树白粉病，对天然橡胶的产量造成了巨大的损失。近期研究发现，橡胶树白粉菌还可以侵染拟南芥，在拟南芥野生型Col-0中激发抗病反应，并且该抗病反应完全依赖于EDS1和PAD4，部分依赖于SAG101以及SA信号通路。

发明内容

本发明的目的是提高植物对橡胶树白粉菌(Oidium Heveae)的抗病性。

本发明首先提供了ATAF2蛋白质的新用途。

本发明提供了ATAF2蛋白质在调控植物对橡胶树白粉菌的抗性中的应用。

本发明又提供了ATAF2蛋白质在与EDS1蛋白质(氨基酸序列如序列表中的序列4所示)互作中的应用。

上述应用中，所述ATAF2蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接表1所示的标签。

表1、标签序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中，所述一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中，所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中，所述蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连接表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

本发明还提供了与ATAF2蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与ATAF2蛋白质相关的生物材料在调控植物对橡胶树白粉菌的抗性中的应用；

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码ATAF2蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或序列7第1501-2532位所示的基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码ATAF2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码ATAF2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ATAF2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码ATAF2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ATAF2蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。

上述应用中，所述调控为提高或降低。所述调控具体体现在：当植物中的ATAF2蛋白质的表达量和/或活性降低时，所述植物对橡胶树白粉菌的抗性降低；当植物中的ATAF2蛋白质的表达量和/或活性提高时，所述植物对橡胶树白粉菌的抗性提高。

本发明还提供了上述ATAF2蛋白质或上述生物材料在培育对橡胶树白粉菌抗性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述ATAF2蛋白质或上述生物材料在培育对橡胶树白粉菌抗性降低的转基因植物中的应用。

上述ATAF2蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种培育对橡胶树白粉菌抗性降低的转基因植物的方法。

本发明提供的培育对橡胶树白粉菌抗性降低的转基因植物的方法包括降低受体植物中ATAF2蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对橡胶树白粉菌的抗性低于所述受体植物。

进一步的，所述降低受体植物中ATAF2蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过沉默或抑制受体植物基因组中ATAF2蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除ATAF2蛋白质的编码基因来实现。

更进一步的，所述沉默或抑制受体植物基因组中ATAF2蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除ATAF2蛋白质的编码基因为突变受体植物基因组中ATAF2蛋白质的编码基因使受体植物基因组中ATAF2蛋白质的编码基因表达量降低或使受体植物基因组中ATAF2蛋白质的编码基因发生缺失突变或***突变或碱基替换；

所述使受体植物基因组中ATAF2蛋白质的编码基因发生缺失突变或***突变或碱基替换的方法可为CRISPR/Cas9或TELLEN或T-DNA***或EMS诱变。

所述ATAF2蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的cDNA分子或序列7第1501-2532位所示的基因组DNA分子。

在本发明的一个具体实施例中，所述使受体植物基因组中ATAF2蛋白质的编码基因发生***突变的方法为T-DNA***。

所述转基因植物对橡胶树白粉菌的抗性低于所述受体植物具体体现在：所述转基因植物在接种橡胶树白粉菌后产生橡胶树白粉菌分生孢子，而受体植物在接种橡胶树白粉菌后并未产生橡胶树白粉菌分生孢子；和/或，所述转基因植物在接种橡胶树白粉菌后出现了微弱的白粉病病斑，而受体植物在接种橡胶树白粉菌后出现明显的抗病发黄的表型。

本发明还提供了一种培育对橡胶树白粉菌抗性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育对橡胶树白粉菌抗性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中ATAF2蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物对橡胶树白粉菌的抗性高于所述受体植物。

进一步的，所述提高受体植物中ATAF2蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达ATAF2蛋白质。

更进一步的，所述过表达的方法为将ATAF2蛋白质的编码基因导入受体植物。

所述ATAF2蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的cDNA分子或序列7第1501-2532位所示的基因组DNA分子。

在本发明的一个具体实施例中，所述ATAF2蛋白质的编码基因通过重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体为重组表达载体pCAMBIA1300-ATAF2。所述重组表达载体pCAMBIA1300-ATAF2为将序列7所示的DNA分子(1.5Kb启动子区域+ATAF2基因组DNA)***pCAMBIA1300载体的Xho I和BstB I酶切位点间，且保持pCAMBIA1300载体的其他序列不变得到的载体。

所述转基因植物对橡胶树白粉菌的抗性高于所述受体植物具体体现在：所述转基因植物在接种橡胶树白粉菌后并未产生橡胶树白粉菌分生孢子，而受体植物在接种橡胶树白粉菌后产生橡胶树白粉菌分生孢子；和/或，所述转基因植物在接种橡胶树白粉菌后出现明显的抗病发黄的表型，而受体植物在接种橡胶树白粉菌后出现了微弱的白粉病病斑。

上述应用或方法中，所述橡胶树白粉菌可为橡胶树白粉菌O.Heveae HN1106菌株。

上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体可为拟南芥；所述拟南芥具体可为野生型拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)或拟南芥突变体ataf2(拟南芥突变体ataf2-1和ataf2-2)。

本发明首先对接种橡胶树白粉菌Oidium heveae HN1106的拟南芥野生型Col-0进行了RNA-seq数据分析，发现接种4天后拟南芥转录因子ATAF2发生了剧烈的上调表达，推测ATAF2受橡胶树白粉菌的诱导表达。接下来通过对拟南芥突变体ataf2进行橡胶树白粉菌接种实验进一步验证，发现ataf2突变体表现出对橡胶树白粉菌感病的表型，可正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性，并且利用GST pull-down和免疫共沉淀实验发现ATAF2与EDS1二者可以直接发生相互作用，为将来进一步探讨EDS1参与的植物抗病信号通路奠定了很好的基础。

附图说明

图1为ATAF2基因受橡胶树白粉菌诱导上调表达。

图2为ATAF2正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性。A为叶片接种结果。B为分生孢子计数结果。

图3为ATAF2与EDS1可以直接发生相互作用。A为ATAF2与EDS1在拟南芥原生质体内相互作用。B为ATAF2与EDS1在体外直接相互作用。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所涉及的突变体ataf2-1购自ABRC种子中心，编号为SALK_136355。

下述实施例中所涉及的突变体ataf2-2购自ABRC种子中心，编号为SALK_015750。

下述实施例中所涉及的橡胶树白粉菌O.Heveae HN1106菌株记载于文献“Mei,S.,Hou,S.,Cui,H.,and Rong W.Characterization of the interaction between Oidiumheveae and Arabidopsis thaliana[J].Molecular plant pathology,2016,17(9):1331-1343.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的ATAF2蛋白的氨基酸序列如序列2所示，ATAF2蛋白的编码基因序列如序列1所示。

下述实施例中的EDS1蛋白的氨基酸序列如序列4所示，EDS1蛋白的编码基因序列如序列3所示。

下述实施例中的XopD蛋白的氨基酸序列如序列6所示，XopD蛋白的编码基因序列如序列5所示。

实施例1、ATAF2基因受橡胶树白粉菌诱导上调表达

一、ATAF2基因受橡胶树白粉菌诱导上调表达的发现

在野生型拟南芥Col-0上接种Oidium heveae HN1106，接种4天后进行RNA-seq数据分析。

RNA-seq数据分析结果发现：野生型拟南芥Col-0上接种Oidium heveae HN1106 4天后，拟南芥NAC家族转录因子ATAF2上调表达6倍。

二、ATAF2基因受橡胶树白粉菌诱导上调表达的验证

1、对培养5周左右的野生型拟南芥Col-0接种Oidium heveae HN1106。

2、分别剪取接种后0天、2天、4天和8天的野生型拟南芥Col-0的叶片。

3、分别提取接种不同时间的野生型拟南芥Col-0的叶片的总RNA。具体步骤如下：液氮预冷研钵，放入拟南芥叶片，反复加入液氮，研磨3次。加入1mL Invitrogen Trizol(Lot No.66223)溶液，提取拟南芥叶片总RNA。

4、向提取的RNA中加入DNA酶，37℃消化1小时后，利用Invitrogen公司的RNA反转录试剂盒III(Lot No.696045)进行反转录，获得cDNA。

5、以cDNA为模板采用

Premix Ex TaqⅡ(Lot No.AK2702)试剂盒进行荧光定量PCR。以ACTIN为内参基因。PCR程序：95℃40s；95℃6s、62℃40s，40个循环。引物序列如下：

ACTIN-F：5′-TGGTGGAAGCACAGAAGTTG-3′；

ACTIN-R：5′-GATCCATGTTTGGCTCCTTC-3′；

ATAF2-F：5′-ACGGACGAGGAGCTTGTGAA-3′；

ATAF2-R：5′-CTCCGGTAGCTTTCCAATAAC-3′。

结果如图1所示。结果表明：在接种后2天，ATAF2基因大约上调表达5倍(图1)，在接种后4天大约上调表达20倍(图1)，在接种后8天大约上调表达15倍(图1)，表达趋势与RNA-seq数据一致，表明ATAF2基因受橡胶树白粉菌诱导上调表达。

实施例2、ATAF2在正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗性中的应用

一、突变体的获得

从ABRC种子中心购买获得ataf2 T-DNA***纯和系突变体ataf2-1和ataf2-2。

与野生型拟南芥Col-0相比，仅突变体ataf2-1中的ATAF2基因发生了T-DNA***突变，***位置为ATAF2基因第二个外显子的第212位和第213位之间。

与野生型拟南芥Col-0相比，仅突变体ataf2-2中的ATAF2基因发生了T-DNA***突变，***位置为ATAF2基因第二个内含子的第42位和第43位之间。

二、ataf2互补拟南芥植株的获得

1、重组表达载体的构建

将序列7所示的DNA分子(1.5Kb启动子区域+ATAF2基因组DNA分子)***pCAMBIA1300载体(北京百诺威生物科技有限公司)的Xho I和BstB I酶切位点间，且保持pCAMBIA1300载体的其他序列不变，得到重组表达载体pCAMBIA1300-ATAF2。其中序列7第1501-2532位为ATAF2基因的基因组DNA分子。

2、重组菌的构建

将步骤1获得的重组表达载体pCAMBIA1300-ATAF2转化农杆菌GV1301(北京百诺威生物科技有限公司)中，经PCR鉴定得到阳性转化子，用于侵染拟南芥植株。

3、转ATAF2拟南芥植株的获得

采用蘸花法用步骤2构建的重组菌(含有重组表达载体pCAMBIA1300-ATAF2的农杆菌GV1301)侵染ataf2-1突变体花序。收获T₁代种子并于筛选培养基上筛选。对筛选得到的幼苗产生的下一代再进行筛选，如此重复，最终获得T₂代转ATAF2拟南芥植株。

4、转ATAF2拟南芥植株的鉴定

采用western blot法利用抗FLAG抗体(购自sigma公司)对步骤3获得的T₂代转ATAF2拟南芥植株进行检测，得到的阳性转ATAF2拟南芥植株即为ataf2互补拟南芥植株，用于检测橡胶树白粉菌抗病性。

三、ATAF2正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性

在野生型拟南芥Col-0、突变体ataf2(ataf2-1和ataf2-2)和阳性ataf2互补拟南芥植株上接种橡胶树白粉菌Oidium heveae HN1106。接种10天后，观察叶片发病表型，并进行分生孢子计数。具体步骤如下：

将生长5周的拟南芥放入40cm×40cm×50μm尼龙膜接种箱中，利用毛笔刷把橡胶树白粉菌刷到尼龙膜上进行接种。接种10天后，对叶片发病症状进行观察并拍照。剪取叶片，进行脱色过夜(脱色液，乙醇：苯酚：H₂O：乳酸＝2：1：1：1)。将脱色后的叶片在考马斯亮蓝染色液(G250，6g/L，乙醇溶液)中染色30s，显微镜观察，计数单个孢子产生的分生孢子数。

结果如图2所示。结果发现：野生型拟南芥和ataf2互补拟南芥植株上出现明显的抗病发黄的表型(图2A)，突变体ataf2-1和ataf2-2出现了微弱的白粉病病斑(图2A)。进一步通过分生孢子计数分析结果表明：橡胶树白粉菌不能在野生型拟南芥和ataf2互补拟南芥植株上产生分生孢子，在突变体ataf2上产生了大量的分生孢子(图2B)，每个成熟的孢子在ataf2-1和ataf2-2突变体上形成的分生孢子平均形成数目分别为28和26个。综上结果表明，ataf2突变体表现出对橡胶树白粉菌感病的表型，说明ATAF2可正向调控植物对橡胶树白粉菌的抗性。

实施例3、ATAF2与EDS1发生直接相互作用

一、免疫共沉淀试验验证ATAF2与EDS1互作

构建带有FLAG标签的ATAF2原生质体表达载体(将ATAF2基因序列连入35S启动子驱动的PUC18载体(北京百诺威生物科技有限公司)的Xho I和BstB I酶切位点间得到的载体)和带有HA标签的EDS1原生质体表达载体(将EDS1基因序列连入35S启动子驱动的PUC18载体(北京百诺威生物科技有限公司)的Kpn I和Sal I酶切位点间得到的载体)，通过氯化铯密度梯度离心提取质粒后，共同转化拟南芥原生质体，以黄单胞菌XopD蛋白作为对照，进行免疫共沉淀试验。具体步骤如下：

利用氯化铯密度梯度离心的方法提取XopD-FLAG，ATAF2-FLAG和EDS1-HA质粒。制备野生型拟南芥Col-0的原生质体，于原生质体中分别转化ATAF2-FLAG和EDS1-HA的混合质粒各60μg以及XopD-FLAG和EDS1-HA的混合质粒各60μg作为对照，弱光下过夜培养。100g离心2min，弃去上清，于原生质体沉淀中加入1mL蛋白提取缓冲液(0.15mol/L KCl，50mMHEPES-KOH(pH 7.5)，1mM EDTA，1mM DTT，0.2％Triton-X 100，cocktail蛋白酶抑制剂)提取原生质体总蛋白。然后分别加入anti-Flag M2 agarose(sigma)20μL。4℃孵育4个小时。500g离心1min，弃去上清，沉淀用1mL漂洗缓冲液(0.15mol/L KCl，50mM HEPES-KOH(pH7.5)，1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Triton-X 100，cocktail蛋白酶抑制剂)漂洗6次后，加入洗脱缓冲液(0.5mM3XFLAG多肽)50μL，4℃孵育1个小时。离心，取上清进行SDA-PAGE电泳，分别用FLAG抗体和HA抗体检测蛋白相互作用。

结果如图3A所示。结果表明：ATAF2可以与EDS1发生相互作用，而对照蛋白XOPD则不能发生相互作用。

二、pull down试验验证ATAF2与EDS1互作

构建GST-ATAF2蛋白表达载体(将ATAF2基因序列***pGEX6p-1载体(北京百诺威生物科技有限公司)的BamH I和Xho I酶切位点间得到的载体)和HIS-EDS1蛋白表达载体(将EDS1基因序列***pET30a载体(北京百诺威生物科技有限公司)的EcoR I和Sal I酶切位点间得到的载体)转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导蛋白表达，分别纯化GST、GST-ATAF2和HIS-EDS1蛋白，进行pull down实验。具体步骤如下：

分别将GST-ATAF2和GST与HIS-EDS1各50μg混合于2个1.5mL离心管中，用缓冲液(0.025mol/L Tris-HCl(pH 7.5)，0.1mol/L NaCl，0.001mol/L DTT)定容至1mL，4℃孵育半小时。然后再分别加入50μL的Glutathione Sepharose^TM4B，4℃孵育1个小时。500g离心1min，弃去上清，沉淀用1mL漂洗缓冲液(0.025mol/L Tris-HCl(pH 7.5)，0.1mol/L NaCl，0.001mol/L DTT，0.2％Triton-X 100)反复清洗离心，洗涤5次。最后加入100μL洗脱缓冲液(10mM还原型谷胱甘肽、50mM pH8.0 Tris-HCl)，4℃孵育10min。离心，取上清进行SDS-PAGE电泳，分别用立春红染色和HIS抗体检测相互作用。

结果如图3B所示。结果表明：GST-ATAF2可以与HIS-EDS1发生相互作用，而对照GST则不能相互作用，说明ATAF2与EDS1是直接相互作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>海南大学

<120>ATAF2蛋白及其相关生物材料在调控植物对橡胶树白粉菌的抗病性中的应用

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>852

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

atgaagtcgg agctaaattt accagctggg ttccgattcc atccaacgga cgaggagctt 60

gtgaaattct acttgtgccg gaaatgtgct tccgagcaga tctcggctcc ggttatcgcc 120

gagattgatc tctacaagtt caatccttgg gagcttccag agatgtctct gtacggagag 180

aaagagtggt acttcttctc acctagagat cggaaatacc caaacggttc gcgtcctaac 240

cgggcagcag gaaccggtta ttggaaagct accggagcag ataaaccgat tggtaaaccg 300

aagacgttgg gtatcaagaa agcactcgtc ttctacgcag ggaaagctcc aaaagggatt 360

aagaccaatt ggataatgca tgagtatcgt ctcgctaatg ttgatagatc agcttctgtt 420

aacaaaaaga acaacctacg acttgatgat tgggttttat gtcgaatata caacaagaaa 480

ggaaccatgg agaagtattt ccccgcggat gagaagccga ggaccacgac aatggctgaa 540

cagtcatcat caccttttga tacatcagac tcgacttacc cgacattgca agaggatgat 600

tccagcagct caggtggtca cggtcacgtg gtgtcaccgg atgttttgga ggttcagagc 660

gagcctaaat ggggagagct tgaggatgct ttggaagctt ttgatacttc aatgtttggt 720

agttccatgg agttgttgca gcctgacgct tttgtccctc agttcttgta tcagtctgat 780

tatttcactt ccttccagga tccgcctgag cagaaaccat tcttgaattg gagttttgct 840

ccacaggggt aa 852

<210>2

<211>283

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>2

Met Lys Ser Glu Leu Asn Leu Pro Ala Gly Phe Arg Phe His Pro Thr

1 5 10 15

Asp Glu Glu Leu Val Lys Phe Tyr Leu Cys Arg Lys Cys Ala Ser Glu

20 25 30

Gln Ile Ser Ala Pro Val Ile Ala Glu Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Asn

35 40 45

Pro Trp Glu Leu Pro Glu Met Ser Leu Tyr Gly Glu Lys Glu Trp Tyr

50 55 60

Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn

65 70 75 80

Arg Ala Ala Gly Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro

85 90 95

Ile Gly Lys Pro Lys Thr Leu Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr

100 105 110

Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Ile Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu

115 120 125

Tyr Arg Leu Ala Asn Val Asp Arg Ser Ala Ser Val Asn Lys Lys Asn

130 135 140

Asn Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys Lys

145 150 155 160

Gly Thr Met Glu Lys Tyr Phe Pro Ala Asp Glu Lys Pro Arg Thr Thr

165 170 175

Thr Met Ala Glu Gln Ser Ser Ser Pro Phe Asp Thr Ser Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Pro Thr Leu Gln Glu Asp Asp Ser Ser Ser Ser Gly Gly His Gly

195 200 205

His Val Val Ser Pro Asp Val Leu Glu Val Gln Ser Glu Pro Lys Trp

210 215 220

Gly Glu Leu Glu Asp Ala Leu Glu Ala Phe Asp Thr Ser Met Phe Gly

225 230 235 240

Ser Ser Met Glu Leu Leu Gln Pro Asp Ala Phe Val Pro Gln Phe Leu

245 250 255

Tyr Gln Ser Asp Tyr Phe Thr Ser Phe Gln Asp Pro Pro Glu Gln Lys

260 265 270

Pro Phe Leu Asn Trp Ser Phe Ala Pro Gln Gly

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<210>3

<211>1872

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

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ttcatacgca atccaaatgt ttaccttgag cctcgttgtg tgacatttgg agctcctttg 480

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aactttgtct caagattcga tattgtccct cggattatgc ttgctcgaaa ggcgtctgta 600

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<212>PRT

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Glu Glu Ala Gly Ala Val Val Ile Phe Ala Phe Gln Pro Ser Phe Ser

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Glu Lys Asp Phe Phe Asp Pro Asp Asn Lys Ser Ser Phe Gly Glu Ile

50 55 60

Lys Leu Asn Arg Val Gln Phe Pro Cys Met Arg Lys Ile Gly Lys Gly

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85 90 95

Ile Asp Pro Arg Thr Ser Phe Gln Ala Ser Val Glu Met Ala Val Arg

100 105 110

Ser Arg Lys Gln Ile Val Phe Thr Gly His Ser Ser Gly Gly Ala Thr

115 120 125

Ala Ile Leu Ala Thr Val Trp Tyr Leu Glu Lys Tyr Phe Ile Arg Asn

130 135 140

Pro Asn Val Tyr Leu Glu Pro Arg Cys Val Thr Phe Gly Ala Pro Leu

145 150 155 160

Val Gly Asp Ser Ile Phe Ser His Ala Leu Gly Arg Glu Lys Trp Ser

165 170 175

Arg Phe Phe Val Asn Phe Val Ser Arg Phe Asp Ile Val Pro Arg Ile

180 185 190

Met Leu Ala Arg Lys Ala Ser Val Glu Glu Thr Leu Pro His Val Leu

195 200 205

Ala Gln Leu Asp Pro Arg Lys Ser Ser Val Gln Glu Ser Glu Gln Arg

210 215 220

Ile Thr Glu Phe Tyr Thr Arg Val Met Arg Asp Thr Ser Thr Val Ala

225 230 235 240

Asn Gln Ala Val Cys Glu Leu Thr Gly Ser Ala Glu Ala Phe Leu Glu

245 250 255

Thr Leu Ser Ser Phe Leu Glu Leu Ser Pro Tyr Arg Pro Ala Gly Thr

260 265 270

Phe Val Phe Ser Thr Glu Lys Arg Leu Val Ala Val Asn Asn Ser Asp

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Glu Trp Ser Leu Ile Pro Phe Arg Ser Ile Arg Asp His His Ser Tyr

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Glu Glu Leu Val Gln Ser Met Gly Lys Lys Leu Phe Asn His Leu Asp

325 330 335

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Gly Ser Cys Phe Trp Ala Glu Val Glu Glu Leu Lys Gly Lys Pro Tyr

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Ser Thr Phe Arg Lys Trp Trp Ile Thr Leu Pro Lys Asn His Lys Ser

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Leu Leu Arg Ser Phe Pro Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Lys Thr Asp Gly

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165 170 175

Lys Ala Lys Ala Lys Val Lys Gly Lys Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala

180 185 190

Glu Ala Lys Ala Glu Val Ala Val Ala Val Glu Val Ala Ala Lys Phe

195 200 205

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210 215 220

Val Ile Ser Lys Ile Ile Glu His Leu Pro Ile Tyr Glu Thr Leu Gln

225 230 235 240

Lys Leu Pro Arg His Ala Glu Gly Val Ser Gly Phe Gln Asn Tyr Leu

245 250 255

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260 265 270

Ala Thr Pro Asp Gln Lys Glu Arg Leu Lys Gln Ala Ile Gln Lys Arg

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Ile Leu Gly Ile Ser Gly Lys Leu Ser Lys Arg Thr Cys Ser Ile Asn

325 330 335

Asp Ala Ser Ser Gly Tyr Leu Ser Gln Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val

340 345 350

Asp Glu Lys Thr Gly Glu Leu Thr Pro Leu Gly Glu Glu Val Ile Ser

355 360 365

Gly Ala Ser Glu Ser Ile Gln Asp Ala Ile Arg Ala Asn Phe Arg Met

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Tyr Pro Gln Glu Glu Asn Pro Pro Pro Ser Ser Phe Phe Gln Gly Val

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Ser Ser Tyr Trp Arg His Val Gly Cys Glu Pro Glu Pro Asp Thr Pro

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Gln Tyr Pro Pro Gln Ser Pro Ala Ser Thr Phe Ser Gly Leu Ser Ser

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Arg Ala Arg Arg Leu Leu Val Gly Asp Asp Val Pro Pro Ile Val Phe

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Arg Arg Asn Lys Asp Ala Val Ala Thr Tyr His Tyr Asp Ser Met Ala

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Gln

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taacttgcat tcttatatcg ataaagaatc cttattgaca acaacaaaaa gtcatgtttg 120

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cacacctacc tcaactttac atttaaagat tttaaaatag aagaggattc atgggcatta 360

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aatatcataa aaaagtagtg gctgctgaga tttttctttt taaatcttag tggtaaatct 840

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gacatataaa ggcatttcca tctacgagaa atccacaaaa tttctcaaac aaaaaaaata 960

ttaatattat attataattt aattatttaa ttaaaaaagt atttttgtta aaaaattgaa 1020

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agaaactttc tacactctct ttcccaatgg agatggtcta aagtcggtca acaattcaca 1140

aaaggtttaa gtgacgcaag caatgacaac atctaagtcg actatccaat aatattacgc 1200

cacgtatata tccagctggc tgcggtcagc gtagaaaaga aaacggtctg ttttgccgca 1260

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tcctcgatta caatcttgag cagacgaaga aaacccaaaa aaaatccaga tccagctgaa 1440

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atgaagtcgg agctaaattt accagctggg ttccgattcc atccaacgga cgaggagctt 1560

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gagattgatc tctacaagtt caatccttgg gagcttccag gtacacctat gggcttcttc 1680

taattatttt tcgcgaaatc atgtgtcttc gagaatcgtt gtttattgag atgtttgttc 1740

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ggaaataccc aaacggttcg cgtcctaacc gggcagcagg aaccggttat tggaaagcta 1860

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tctacgcagg gaaagctcca aaagggatta agaccaattg gataatgcat gagtatcgtc 1980

tcgctaatgt tgatagatca gcttctgtta acaaaaagaa caacctacga gtaagttctg 2040

tttcttatta acttatgtat catcttttcg tgaatgatga tttagattat taactttgtt 2100

gtggtgggtt ttgctgtaca gcttgatgat tgggttttat gtcgaatata caacaagaaa 2160

ggaaccatgg agaagtattt ccccgcggat gagaagccga ggaccacgac aatggctgaa 2220

cagtcatcat caccttttga tacatcagac tcgacttacc cgacattgca agaggatgat 2280

tccagcagct caggtggtca cggtcacgtg gtgtcaccgg atgttttgga ggttcagagc 2340

gagcctaaat ggggagagct tgaggatgct ttggaagctt ttgatacttc aatgtttggt 2400

agttccatgg agttgttgca gcctgacgct tttgtccctc agttcttgta tcagtctgat 2460

tatttcactt ccttccagga tccgcctgag cagaaaccat tcttgaattg gagttttgct 2520

ccacaggggt aa 2532