阅读说明：本技术 肝癌的肿瘤标志物热休克因子2结合蛋白及其应用 (Tumor marker heat shock factor 2binding protein of liver cancer and application thereof ) 是由 吴荣谦 杜肇清 吕毅 于 2019-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明为热休克因子2结合蛋白(HSF2BP)提供了一种新的生物医药用途,即HSF2BP作为一种肝癌肿瘤标志物及应用。本发明公开了HSF2BP mRNA和蛋白的定量检测在制备作为肝癌肿瘤诊断或预后监测试剂中的应用,特别是指HSF2BP mRNA或蛋白表达增高作为肝癌肿瘤的预测指标或预后不良的指标。本发明通过实时定量PCR、Western Blot法及免疫组织化学法鉴定出血清中增高的HSF2BP mRNA或蛋白的表达可作为肝癌的诊断标志物及预后评估指标,具有重要的临床应用价值。(The invention provides a new biological medical application of heat shock factor 2binding protein (HSF2BP), namely HSF2BP as a liver cancer tumor marker and an application thereof. The invention discloses application of quantitative detection of HSF2BP mRNA and protein in preparation of a reagent for diagnosing or monitoring prognosis of liver cancer tumor, in particular to application of HSF2BP mRNA or protein expression increase as a prediction index or an index of poor prognosis of liver cancer tumor. The method identifies the expression of HSF2BP mRNA or protein increased in serum by a real-time quantitative PCR, a Western Blot method and an immunohistochemistry method, can be used as a diagnosis marker and a prognosis evaluation index of liver cancer, and has important clinical application value.)

肝癌的肿瘤标志物热休克因子2结合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种肝癌的肿瘤标志物热休克因子2结合蛋白及其应用。

背景技术

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是发病排名第五、死亡率排名第二的恶性疾病。全球范围内，每年有大约75万的新发病例和69万的死亡病例。肝癌最常见于有慢性酒精性肝硬化、非酒精脂肪肝、慢性病毒性肝炎的患者中。肝细胞持续不断的炎症和反复愈合被认为是肝癌发生发展的根本原因。肝脏炎症与肝硬化的共存使肝癌的早期诊断复杂化。而肿瘤相关的生物标志物可有效地从炎症及肝硬化患者中筛查出早期肝癌的风险，明显改善这类患者的预后。同时，早期缺乏特征性症状也是肝癌预后不良的重要原因。超过60％的患者在首次被诊断时已发生转移，导致5年生存16％。相反，如能早期确诊，可明显提高疾病的预后，5年生存可达到70％以上。对于巴塞罗那分级(BCLC Grading)在0和A的患者，如能进行早期有效的诊疗，其5年生存可高达93％以上。因此，针对肝癌早期有效的检测手段会对患者预后产生重大影响。目前，在无病理诊断的情况下，主要通过评估血清α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)含量和影像学成像对肝癌进行确诊。然而，即使这种方法显示出了明显的不足，仍然没有其他有效的肿瘤生物标志物在临床实践中显示出更好的对早期肝癌的诊断性能。

热休克反应(heat shock response，HSR)是一种保护性应激反应，在机体受到缺氧、缺血、过热和炎症等有害刺激时，激活热休克转录因子(heat shock factors，HSFs)可促进热休克蛋白表达，保护机体免受蛋白毒性应激而度过病理状态，从而减轻损伤，增加细胞存活能力。人类HSFs家族成员包括HSFl、HSF2、HSF3和HSF4，其中HSF2是调节细胞应激热休克反应重要的调控因子。热休克因子2结合蛋白(heat shock factor 2bindingprotein,HSF2BP)与HSF2相关联，相互作用发生在HSF2的三聚化结构域和HSF2BP的包含两个亮氨酸拉链序列的氨基末端亲水区域之间。HSF2BP首次于人类睾丸cDNA文库中被发现，其作为HSF2的结合配偶体，参与调节HSF2的激活，在人类***发生过程中起到潜在的作用。同时，其作为泛素化底物，在蛋白修饰过程中发挥作用。目前有关HSF2BP的研究极少，在各系统的恶性肿瘤中均无研究发表。本发明首次提出在人类肝癌中HSF2BP的表达特点及其与肝癌生物学行为的关系，旨在为肝癌早期检测及风险评估提供新的诊断标志物，具有重要的临床意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种肝癌的肿瘤标志物热休克因子2结合蛋白及其应用，为热休克因子2结合蛋白(HSF2BP)提供了一种新的生物医药用途，在制备早期肝癌诊断试剂、抑制肝癌肿瘤药物、抗肝癌肿瘤药物或预后评估试剂方面均可应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

肝癌的肿瘤标志物，为热休克因子2结合蛋白(HSF2BP)。

所述肝癌肿瘤标志物的检测试剂可用于制备早期肝癌诊断试剂或预后评估试剂。

所述的早期肝癌诊断即肝癌检测，是指在获取的临床肝癌患者肝癌组织和对应癌旁组织中提取mRNA和总蛋白进行的定量检测。

其中，在制备早期肝癌诊断试剂或预后评估试剂时，所述肿瘤标志物以HSF2BPmRNA或蛋白的形式被鉴定和应用。具体可使用荧光定量PCR反应鉴定得出待测样品中标志物HSF2BPmRNA，基于HSF2BP抗体的WesternBlot法鉴定得出待测样品中标志物HSF2BP蛋白。HSF2BP mRNA或蛋白在临床肝癌组织中表达明显增高，是作为肝癌预后不良的指针。

通过与患者癌旁组织对比分析，肝癌中发现特异性高表达HSF2BP mRNA或蛋白与临床病理参数有显著相关性，且导致预后明显的差异，具有重要的临床应用前景。

所述肿瘤标志物可作为实时定量PCR、PCR法测序、生物质谱检测、酶联免疫法的定量试剂。

其中，HSF2BP mRNA的检测试剂，特异性结合对应转录本探针或引物，所述转录本探针或引物可携带有分子标记，以方便检测。HSF2BP蛋白的检测试剂为可特异性识别HSF2BP蛋白的抗体和/或抗体片段。

HSF2BPmRNA的表达水平检测基于PCR引物获取，上游引物和下游引物如下序列表：

GAPDH cDNA的引物序列为：

5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’(上游)；

5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3’(下游)；

hsf2bp cDNA的引物序列为：

5’-GGTGCTCTTGGACACCATATT-3’(上游)；

5’-CTGGACTCTCGCTGATGTATTT-3’(下游)。

基于所述引物的序列，可进一步制备检测HSF2BP mRNA水平的试剂盒，所述试剂盒应包括相应反转录试剂、内参引物以及用于RNA扩增的物质和缓冲液。其中所述用于RNA扩增的物质和缓冲液可包括qPCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、DNA合成量的荧光标记、无酶水。

所述肝癌的肿瘤标志物还可用于制备抑制肝癌肿瘤药物或抗肝癌肿瘤药物。

在所述抑制肝癌肿瘤药物和抗肝癌肿瘤药物中，以HSF2BP为目标调控基因，构建稳转敲低HSF2BP基因的载体，制备用于体外或体内使用的试剂或药物。稳转低表达HSF2BP基因包括抑制或缺失表达HSF2BP的编码基因，降低或抑制HSF2BP基因的拷贝、转录及翻译，从而抑制HSF2BP蛋白功能的发挥。

其中，用于构建所述稳转敲低HSF2BP基因的载体为病毒载体或者基因沉默载体。所述病毒载体包括腺病毒载体、腺病毒相关载体和逆转录病毒载体；所述基因沉默载体包括CRISPR编辑系统基因沉默载体和质粒低表达载体。

通过构建HSF2BP敲低稳转肝癌细胞株，在裸鼠皮下移植成瘤，证实HSF2BP表达下调降低裸鼠皮下移植成瘤能力，说明抑制HSF2BP可能作为肝癌的新型抗肿瘤方案。

与现有技术相比，本发明为热休克因子2结合蛋白(HSF2BP)提供了一种新的生物医药用途，即HSF2BP作为一种肝癌肿瘤标志物及应用。本发明公开了HSF2BP mRNA和蛋白的定量检测在制备作为肝癌肿瘤诊断或预后监测试剂中的应用，特别是指HSF2BP mRNA或蛋白表达增高作为肝癌肿瘤的预测指标或预后不良的指标。本发明通过实时定量PCR、Western Blot法及免疫组织化学法鉴定出血清中增高的HSF2BP mRNA或蛋白的表达可作为肝癌的诊断标志物及预后评估指标，具有重要的临床应用价值。同时其可用于制备抑制肝癌肿瘤药物和抗肝癌肿瘤药物。

附图说明

为更直观地阐述本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面对实施例或现有技术方案中所需附图作简单说明，同时，下述的附图仅代表本发明的实施例，对本领域普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，可依据下述附图获得其他附图。

图1：45例实施例中HSF2BP mRNA在肝癌患者癌组织和癌旁正常组织中的表达水平。

图2：Western Blot法分析HSF2BP蛋白在肝癌患者癌组织和癌旁正常组织中的表达情况：(左侧)4例实施例中肝癌癌组织和癌旁正常组织的表达情况示意；(右侧)获取的99例临床肝癌及对应癌旁正常组织表达情况分析。β-actin作为HSF2BP蛋白表达的内参对照。

图3：免疫组化法分析3个临床肝癌病例中HSF2BP蛋白在肝癌患者癌组织和癌旁正常肝组织中的表达情况。

图4：在人类肝癌细胞Bel-7404中构建稳转低表达HSF2BP的细胞株：(左侧)将HSF2BP干扰及空载对照组慢病毒载体感染肝癌细胞株Bel-7404细胞，在72小时后，荧光显微镜下的转染效率；(右侧)提取两组转染后的细胞总RNA，利用实时定量PCR检测HSF2BPmRNA的表达水平。

图5：通过构建HSF2BP敲低稳转肝癌细胞株，在裸鼠皮下移植成瘤，探讨HSF2BP表达下调对裸鼠皮下移植成瘤能力的影响：利用体外小动物成像系统观察两组肝癌细胞在裸鼠皮下移植成瘤后的成瘤情况。

图6：通过构建HSF2BP敲低稳转肝癌细胞株，在裸鼠皮下移植成瘤，探讨HSF2BP表达下调对裸鼠皮下移植成瘤能力的影响：两组细胞在裸鼠皮下成瘤后肿瘤体积随时间变化增长的情况

图7：通过构建HSF2BP敲低稳转肝癌细胞株，在裸鼠皮下移植成瘤，探讨HSF2BP表达下调对裸鼠皮下移植成瘤能力的影响：两组细胞在裸鼠皮下成瘤后肿瘤肿瘤的对比分析。

具体实施方式

为更详尽地阐述本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。如非特殊说明，下述采用试剂、方法和设备均为本领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：实时定量PCR检测HSF2BP mRNA在肝癌组织及对应癌旁正常组织中的表达。

随机选取2012年10月至2016年12月在西安交通大学第一附属医院就诊并住院行“肝切除术”治疗的原发性肝癌患者，获取99对肝细胞癌及毗邻正常肝脏组织(至少距离肿瘤边缘3cm)。整个采集及实验检测过程通过西安交通大学第一附属医院伦理委员会认证。所有组织样本在采集前均已签署知情同意书。在获取组织标本后，迅速置于-80°冰箱储存。

一.使用Trizol试剂提取细胞总RNA

材料及试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、DEPC水、75％乙醇。

试验步骤：

1.获取100mg组织，加入1ml预冷Trizol试剂；

2.冰上静止5min，充***解，将Trizol转移至1.5ml离心管，低温高速离心15min；

3.获取上清，转移至新的1.5ml离心管；

4.加入200ul氯仿，充分混匀，室温静止15min；

5.低温高速离心15min；

6.转移上清至新的1.5ml离心管；

7.加入500ul异丙醇，混匀后室温静止15min；

8.低温高速离心15min，转移上清至新的1.5ml离心管；

9.弃上清，加入预冷的75％乙醇1ml，管底白色沉淀即为所得总RNA；

10.低温低速离心5min，弃上清；

11.通风橱内晾干，加入适量DEPC水充分溶解；

12.酶标仪下检测OD值获取RNA质量和浓度，通过A260/A280比值确保获取的RNA纯度。总RNA浓度(ug/ml)＝OD₂₆₀×40×稀释倍数。

二.反转录

吸取2ug总RNA，在25ul反应体系中以Oligo(dT)₁₅为引物，应用AMV反转录试剂盒合成cDNA。反转录PCR条件为：42℃17min逆转录，85℃5s终止。

三.实时定量PCR：按照下表所示试剂及浓度加入PCR反应体系。

在PCR反应仪中将反应参数设置为：预变性95℃10s，变形95℃5s，退火/延伸60℃34s，共计40个循环，将GAPDH作为相对定量的内参。2^-ΔΔCt法计算基因表达的相对量。

四.结果：通过实时定量PCR检测了临床肝癌标本中癌组织及癌旁正常肝组织中HSF2BP mRNA的表达量，如图1所示，发现样本中HSF2BP mRNA在癌组织中显著高表达(P＝0.014)。这提示HSF2BP在肝癌中很可能发挥着重要作用。

实施例2：Western Blot法检测HSF2BP蛋白在肝癌组织及对应癌旁正常组织中的表达情况

一.组织蛋白提取过程：

1.获取30mg组织蛋白置入2ml匀混管中，分别加入300ul预冷RIPA裂解液；

2.加入钢珠在组织破碎仪上高速破碎1min；

3.取出钢珠，连同混匀管置于冰上，充***解30min；

4.低温高速离心15min后，小心获取上清液，转移至新的1.5ml离心管中；

5.吸取10ul蛋白样品，采用BCA蛋白定量法进行定量，获取样品蛋白的浓度；

6.余下的蛋白样品按照比例加入5×loading buffer涡旋混匀；

7.蛋白样品在沸水中热处理10min。

二.Western Blot过程：

1.取30ug蛋白样品进行蛋白电泳(SDS-PAGE)；

2.依据HSF2BP蛋白分子量，选取6％的分离胶；

3.在蛋白电泳过程中压缩胶电压为80V，分离胶电压为200V；

4.蛋白电泳完成后，将分离胶转移至PVDF膜上，转膜过程中恒定电压控制在100V，时间为1h；

5.将转移有HSF2BP蛋白的PVDF膜用3％脱脂奶粉在室温下低速摇床孵育1h；

6.分别加入相应抗体：抗HSF2BP(1:600)和抗人类β-actin(1:5000)；

7.4°冰箱摇床孵育过夜处理；

8.次日用含0.5％Tween-20的TBST摇床清洗3次，每次10min；

9.分别加入1:5000HRP标记的二抗室温下摇床低速孵育1h；

10.TBST清洗3次，每次5min；

11.ECL发光后检测蛋白条带。

三.结果：如图2所示，相对于癌旁正常肝组织，HSF2BP蛋白在临床肝癌组织中显著高表达(P＝0.0338)。

实施例3：免疫组化法法检测HSF2BP蛋白在肝癌组织及对应癌旁正常组织中的表达情况

一.石蜡组织切片

1.将临床标本组织置于4％多聚甲醛溶液中，室温下固定24小时；

2.PBS冲洗2-3遍，将组织依次置于80％酒精48小时，95％酒精12小时，无水酒精2小时，二甲苯2小时脱水；

3.将组织浸没入蜡中30min；

4.常规包埋后，连续切片，厚度5um；

5.将切片置于37℃温箱中放置48小时，室温储存。

二.免疫组化染色

1.将石蜡包埋后的切片置于二甲苯中脱蜡2次，每次10min；

2.梯度酒精脱水；

3.将切片置于0.3％双氧水的甲醇溶液，室温15min；

4.常规PBS清洗(清洗3次，每次5min)；

5.血清工作液37℃封闭30min；

6.滴加HSF2BP抗体(1:200)在4℃冰箱中孵育过夜；

7.常规PBS清洗；

8.滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min；

9.常规PBS清洗；

10.滴加SP工作液，37℃孵育30min；

11.常规PBS清洗；

12.DBA显色，流水充分清洗；

13.常规脱水，透明，干燥后封片。

三.结果：显微镜下观察各组切片染色情况，依据棕色染色程度给予强度判断。如图3所示，相对于癌旁正常肝组织，肝癌组织的染色显著增强，呈现为深棕色强阳性结果。

实施例4：HSF2BP表达下调可显著降低Bel-7404细胞裸鼠成瘤能力

1.肝癌细胞培养：

人类肝癌细胞株Bel-7404在含有10％血清的RPMI-1640培养基中进行培养。培养基中同时含有青霉素和链霉素。细胞在5％CO₂，37℃培养箱中完成培养。

2.HSF2BP敲低稳转细胞株的构建：

通过小干扰RNA序列构建敲低HSF2BP的慢病毒载体，并以空载序列构建的慢病毒载体作为对照，同时分别通过基因测序的检测验证HSF2BP干扰载体构建序列的正确性。随后，将HSF2BP干扰及空载对照组慢病毒载体感染肝癌细胞株Bel-7404细胞。72小时后，在荧光下观察转染效率。

3.QT-PCR法检测稳转细胞株HSF2BP mRNA水平

转染后继续常规培养细胞24-48小时。收集细胞后，按照实施例1中的方法获取细胞的总RNA，逆转录后通过PCR法检测稳转肝癌细胞株Bel-7404内HSF2BP mRNA水平的变化情况。

4.HSF2BP基因敲低抑制肝癌移植瘤在裸鼠体内的生长

为进一步验证体外实验的结果，将上述Bel-7404肝癌细胞株及经过基因重组后稳定下调表达HSF2BP的肝癌细胞分别进行了裸鼠皮下移植成瘤能力的试验。从西安交通大学动物试验中心获取1月龄雄性BALB/C裸鼠，局部麻醉后在腋窝部位皮下注射200ul对照组肝癌细胞株或稳转低表达HSF2BP的Bel-7404细胞悬液(约2×10⁶个细胞)，每组10只。期间采用活体小动物成像系统和游标卡尺连续6周动态监测皮下种植瘤的生长情况。

结果：

如图4所示，在荧光显微镜下，肝癌细胞株Bel-7404的感染效率在80％以上，细胞形态正常。同时，通过QT-PCR检测结果表明，经慢病毒转染后，HSF2BP在肝癌细胞株Bel-7404细胞株中的表达成功被敲除，具有显著的统计学差异(P＜0.01)，同时表明这种外源性转染在肝癌细胞中获取低表达HSF2BP的可行性。**P＜0.01。

如图5、图6和图7所示：在肝癌细胞株接种约1周左右，裸鼠皮下开始出现接种部位小结节，直至观察期结束，可见结节直径逐渐增大形成皮下移植瘤。同时，下调HSF2BP表达后的Bel-7404细胞的裸鼠皮下移植成瘤能力明显低于对照组Bel-7404细胞，肿瘤体积明显较小，差异有统计学意义(P＜0.05)。观察期末，脱颈处理裸鼠，取出肿瘤称重，发现低表达HSF2BP的Bel-7404细胞获取的种植瘤重量明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

上述显示了本发明的基本原理，主要特征和用途。在各实施例中阐述的本发明的技术方案，并非是对其的限制，在上述实施例说明的原理下的各种改进和变化，均在本发明的范围内。