阅读说明：本技术 改善治疗剂的溶解度和生物利用度的方法 (Method for improving solubility and bioavailability of therapeutic agents ) 是由 A.K.杰哈 于 2018-04-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及制备纳米治疗化合物和包含纳米治疗化合物的组合物的方法。根据本文提供的方法制备的纳米治疗化合物可用于在需要它的受试者中治疗疾病,例如癌症。(The present invention relates to methods of preparing nanotherapeutic compounds and compositions comprising nanotherapeutic compounds. The nanotherapeutic compounds prepared according to the methods provided herein are useful for treating a disease, such as cancer, in a subject in need thereof.)

具体实施方式

更详细地描述。提供以下实施例用于说明性目的，并且不旨在以任何方式限制本发明。本领域的技术人员将易于认识到可变化或修改多种非关键参数以产生基本上相同的结果。

实施例1. 纳米制剂研磨过程

固体制剂掺混物的研磨使用磨碎机或球磨机进行。将制剂装入研磨机中，其研磨室装有钢球。研磨进行约25-35分钟，并然后进行雷洛昔芬的粒径分析。重复该顺序直至活性药用成分(例如雷洛昔芬)的中值粒径为约100 nm。过程中的样品用于在整个粒径减小过程中测量粒径和粒径分布。

实施例2. 代表性的纳米制剂

制备了3种不同的纳米制剂，其组分如以下表1所示。在所有制剂中，月桂基硫酸钠的量保持恒定。雷洛昔芬、乳糖一水合物和共聚维酮的比例以两个水平进行变化，以维持特定范围的粒径和分布。改变聚合物(共聚维酮)的水平以确保将雷洛昔芬颗粒包衣用于进一步提高溶出度。制造4个批次，并测量所有4个批次的粒径分布。所有4个批次具有类似的粒径和分布，显示出方法的稳定性。在这4个批次中，将具有最高载药量和最低乳糖一水合物含量的制剂如以下实施例3-8所述用于进一步的分析测试。以下表1显示用于进一步测试的纳米制剂的组分。

表1. 纳米制剂组分

组分	%组成
		盐酸雷洛昔芬	15%
共聚维酮(KollidonVA64)	6%
		月桂基硫酸钠	1%
乳糖一水合物	78%

实施例3. 粒径分析

纳米制剂的粒径通过激光衍射仪(型号：S3000)测定。基于数量分布获得粒径和分布，并且该值为3次测量的平均值。使用标准粒径样品制备配方进行粒径分析。

图1显示市售雷洛昔芬制剂(即未研磨的制剂)的粒径和本发明的代表性的雷洛昔芬纳米制剂(即研磨的制剂)的粒径和分布。图1还显示药物在研磨前后的粒径d50，其中雷洛昔芬和赋形剂的比例对于两种制剂而言相同。纳米制剂的粒径d50是未研磨的制剂的d50的约1/280。未研磨的制剂的d50为约35微米。

实施例4. 熔点和结晶

通过差示扫描量热计记录研磨的纳米制剂和未研磨的制剂的热力曲线。在25-400℃范围内以5℃/分钟的加热速率在铝盘中扫描每个样品(~5 mg)，用空铝盘作为参考。将样品在氮气氛下加热。

如图2所示，对经研磨的纳米制剂和未研磨的制剂以固态进行了差示扫描量热(DSC)研究。两种制剂的赋形剂和雷洛昔芬的吸热峰均显示单峰。赋形剂和雷洛昔芬的尖峰证实雷洛昔芬和赋形剂在研磨前后处于晶体状态。雷洛昔芬在研磨前后的熔融峰几乎处于相同的温度，这证实雷洛昔芬的晶体形式在整个纳米制剂过程中没有变化。

实施例5. 傅立叶变换红外光谱法

基于未研磨和研磨的纳米制剂确定雷洛昔芬的特性，以证实治疗剂的结构在研磨期间没有变化。通过常规KBr压片法获得了研磨的纳米制剂和未研磨的制剂的傅立叶变换红外(FTIR)光谱。扫描范围为4000-550 cm^-1。总共进行了16次扫描。

FTIR研究表明，在未研磨的制剂和研磨的纳米制剂中雷洛昔芬的光谱没有明显变化。如图3所示，未研磨的制剂和研磨的纳米制剂的FTIR峰的波数没有变化，表明药物与其他制剂组分之间没有明显的相互作用；因此，这些结果表明雷洛昔芬在研磨前后没有形式变化，或者雷洛昔芬与制剂的其他组分之间没有任何明确定义的相互作用。

实施例6. 体外溶出度

通过遵循美国药典(USP)装置II，在体温下用含有0.1% Tween 80的1000 mL水以50rpm进行体外溶出度测试。测试了含有相当于60 mg雷洛昔芬的粉末样品的每种纳米制剂和未研磨的制剂的3个样品。使用自动采样系统以预定的时间间隔(10、20、30、45分钟)取出溶出介质的样品。在充分稀释之后，在λmax= 290 nm使用UV分光光度计分析收集的样品。

研磨的纳米制剂和未研磨的制剂的溶出度研究结果如表2和图4所示。45分钟之后，研磨的纳米制剂的溶出度是未研磨的制剂的溶出度的约12倍。溶出度研究的结果表明，经研磨的纳米制剂的溶出度大大高于未研磨的制剂。结果表明，与未研磨的制剂相比较，研磨过程大大提高了纳米制剂的溶解度。

表2. 研磨的纳米制剂和未研磨的制剂的溶出度研究结果

实施例7. X射线衍射

使用通过Optix长细聚焦源产生的Cu辐射的入射光束，用PANalytical X'Pert PROMPD衍射仪收集粉末晶体(XRD)谱。使用椭圆渐变的多层反射镜将Cu Kα X射线聚焦穿过样本并到达检测器。使用位于距样本240 mm的扫描位置敏感检测器(X'Celerator)和DataCollector软件收集衍射谱。

进行了XRD研究以巩固DSC数据，表明未研磨的雷洛昔芬制剂和研磨的纳米制剂的结晶度。未研磨和研磨的雷洛昔芬制剂的衍射光谱表明结晶度没有变化，如图5的多个不同峰所示。分析研磨的纳米制剂时未观察到新的峰，表明在研磨过程期间药物与纳米制剂的其他组分之间没有相互作用。研磨的纳米制剂和未研磨的制剂中雷洛昔芬的突出峰出现在XRD光谱的类似位置，这进一步支持了DSC测量中显示的数据。

实施例8. 体内测定

图6显示给予了研磨的雷洛昔芬纳米制剂(22 mg/kg)或未研磨的雷洛昔芬制剂的大鼠的雷洛昔芬血浆浓度的比较。表3显示对研磨的雷洛昔芬纳米制剂和未研磨的雷洛昔芬制剂测量的代表性PK参数的列表。

表3

实施例9. 放大分析

双氯芬酸用作模型化合物，用于建立实施例1所述的纳米制剂研磨过程的商业规模参数。选择双氯芬酸基于几种考虑，比如水中的溶解度差。制备并分析了40种双氯芬酸制剂(预磨)。每种制剂的组成根据载药量、聚合物选择和载量以及表面活性剂选择和载量而变化。针对单个制剂调整填充剂的百分比组成。另外，每种单个制剂经受两种不同的研磨条件，这导致了48种不同的双氯芬酸纳米制剂。根据以下所述的一般研磨条件，使用11℃-17℃的外部(夹套)温度对这些制剂进行纳米配制，并且使用外部冷却器控制温度。用于制备纳米制剂的变量进一步概述如下：

制剂组成

活性药物

• 双氯芬酸载药量：10%、12%或15%

赋形剂选择

• 聚合物(占制剂的10%和12% w/w) -Kollidon VA64或Soluplus

• 表面活性剂(0.5%和1%)-月桂基硫酸钠或泊洛沙姆188

• 填充剂-乳糖一水合物或甘露醇

研磨条件

• 大型研磨机 - 以250 rpm和300 rpm处理500 g批次；以300 rpm处理1000 g批次

• 研磨介质：以1:3比率(大直径:小直径)使用两种不同直径的不锈钢球。20 lbs的研磨介质用于500 g批次，和40 lbs的研磨介质用于1 kg批次。由于研磨的剪切和冲击机理，该比率的研磨介质产生的纳米制剂d50粒径范围为100 nm-200 nm。

• 研磨时间间隔：10 min、15 min、20 min、25 min、30 min和35分钟。将大部分制剂研磨直至35分钟，并收集以下两个时间点的粒径数据：30分钟和35分钟。

总体而言，以上概述的实验框架和变量导致对两种不同研磨条件制备了40种单个制剂，产生了总共64种研磨的纳米制剂。使用Mastersizer激光衍射仪对总计128个产物样品的产品尺寸进行了评估，以检查使用各种制剂获得的粒径和粒径范围。

如图7所示，在制剂中使用15%的载药量(最高)和10%的聚合物，在研磨双氯芬酸晶体35分钟之后获得了目标d₅₀范围。在图8中，在制剂中使用10%的载药量(最低)和10%的聚合物，在研磨双氯芬酸晶体35分钟之后获得了目标d₅₀范围。在制剂掺混和研磨的独立重复之后，观察到最终d₅₀和粒径分布的微小变化(图7-8)。然而，使用上述双氯芬酸制剂和加工参数始终获得目标范围内的d₅₀。

图7-8中的代表性数据来自含有乳糖一水合物作为填充剂的制剂。然而，还研究了填充剂对最终粒径和粒径分布的影响。观察到，在制剂中使用甘露醇产生的粒径平均大于含有乳糖一水合物的制剂(图9)。甘露醇的这种作用常常阻止获得目标粒径d₅₀在100-200nm的范围内；但是，含有乳糖一水合物作为填充剂的制剂在相对稳定的一组操作条件下产生了目标d₅₀。

接下来，进行了一系列研究以确定其他参数(包括研磨速度和载药量)的影响(图10-11)。总体而言，这些研究建立了使用模型化合物双氯芬酸在规定范围的操作条件下获得目标d₅₀的概念验证。以下给出的双氯芬酸的典型粒径与使用相同参数的盐酸雷洛昔芬、醋酸阿比特龙和苹果酸舒尼替尼的粒径类似。

总之，双氯芬酸的数据表明，以下参数对研磨之后的药物粒径d50几乎没有影响：

• 药物的起始粒径(例如测试的双氯芬酸、醋酸阿比特龙、盐酸雷洛昔芬和苹果酸舒尼替尼的起始粒径不同)

• 表面活性剂浓度(0.5%和1.0% w/w)

• 聚合物载量(10%和12% w/w)

相比之下，来自双氯芬酸实验的数据表明，以下参数对研磨之后的药物粒径d50呈现出明显的可测量的影响：

• 载药量

• 聚合物类型

• 填充剂类型

• 研磨时间

如上所述，在制备研究的制剂时，以10%和12% (基于w/w)的两种载量，使用两种不同的聚合物(Kollidon VA64或Soluplus)。基于相对于活性药用成分(API)双氯芬酸(其熔点为170℃)的熔点差别来选择赋形剂，特别是聚合物。

熔体挤出分析

在开发出获得期望的粒径和粒径范围的候选制剂之后，研究了用于更大规模500 g批量大小的热熔挤出的参数。首先进行一小组温度范围优化研究，以选择纳米研磨制剂的挤出温度范围。基于这些试验研究，将两种不同条件用于热熔挤出：

• 20 rpm和40 rpm，目标进给速度为每小时0.5 kg和1 kg。

• 挤出区温度对制剂中的聚合物为特定的。将含有Kollidon VA64 (熔点145℃)的制剂在135℃-145℃下挤出。在运行10分钟之后，降低温度以弥补双螺杆在热熔挤出机筒中混合期间产生的热量。将含有Soluplus (熔点120℃)的制剂在110-120℃下挤出。

使用上述rpm参数，在这些条件下获得的实际进给速度分别为0.18 kg/小时和0.24 kg/小时。这些研究总共进行了256次实验和聚合物包衣制剂。这256个样品自总共64个进料样品产生，这些进料样品来自40种不同的纳米制剂。所得的聚合物包衣的纳米制剂的代表性溶出度数据如图12-15所示。

相对于相应的市售制剂，本文所述的纳米配制的双氯芬酸(15%载药量和10%聚合物)显示出明显改善的溶出度(图12)。对10%、12%或15%载药量的双氯芬酸纳米制剂观察到了类似的溶出度改善(图13)。还使用最终制剂中含有12%聚合物(16种不同制剂)进行了试验研究。观察到，相对于市售制剂，10%聚合物足以赋予急剧增加的溶出度。相对于未研磨的制剂，使用特定填充剂(乳糖一水合物或甘露醇)或研磨速度的差异类似地增加了双氯芬酸的溶出度，并且与条件之间溶出度改善的差异无关(图14-15)。

使用各种技术(包括傅立叶变换红外光谱(FTIR)、差示扫描量热法(DSC)和X射线衍射(XRD))来表征挤出的纳米制剂的晶体特性和确认在纳米级晶体上的均匀聚合物包衣，以研究在研磨和挤出过程期间可能发生的晶体的可能形式变化。

FTIR数据显示光谱或清楚峰的数量无差异，表明药物与赋形剂之间没有相互作用(图16)。此外，DSC数据表明，未研磨、研磨和挤出的材料呈现出清楚且类似的熔点峰，表明晶体形式没有变化(图17)。类似地，XRD光谱显示出未研磨、研磨和挤出的材料的峰一致，如以下表4所示。

表4

在类似的位置清楚地看到来自研磨和未研磨的制剂的双氯芬酸的突出峰，表明在纳米制剂过程期间结晶度没有变化(图18)。最后，使用扫描电子显微术(SEM)来证实挤出之后纳米晶体的均匀聚合物包衣。SEM显微照片显示，在挤出的产物中纳米晶体用聚合物包衣并且药物颗粒吸附到聚合物表面，从而使颗粒保持离散状态并防止其团聚和聚集(图19)。

另外，发现在研磨过程期间含有甘露醇作为填充剂的几种制剂表现出粘结问题，这降低用于随后供入挤出机的产物产量(从500 g批料获取~300 g纳米研磨的材料)。含有乳糖一水合物作为填充剂的制剂不会发生此问题。进一步地，发现湿度控制对于获得目标产物特性不是必需的。

实施例10. 醋酸阿比特龙的纳米制剂

基于实施例9所述的结果，将实验确定的制剂参数用于产生***癌药物醋酸阿比特龙的纳米制剂。与双氯芬酸和盐酸雷洛昔芬类似，醋酸阿比特龙制剂的纳米研磨产生了在目标d₅₀和窄粒径分布内的研磨产物，如图20所示。如图21所示，对纳米制剂和未研磨的制剂以固态进行了差示扫描量热(DSC)研究，并且两种制剂的赋形剂和醋酸阿比特龙的吸热峰均显示单峰。赋形剂和醋酸阿比特龙的尖峰证实了醋酸阿比特龙和赋形剂在研磨前后处于晶体状态，并且在类似温度下的熔融峰证实醋酸阿比特龙的晶体形式在纳米制剂过程期间没有变化。

FTIR研究表明，市售制剂(即研磨之前)和纳米制剂(即研磨之后)的醋酸阿比特龙的光谱没有明显变化。如图22所示，市售制剂和纳米制剂的FTIR峰的波数没有变化，表明药物与赋形剂之间没有明显的相互作用。这些结果表明醋酸阿比特龙在研磨前后没有形式变化，或者醋酸阿比特龙与制剂中使用的赋形剂之间没有任何明确定义的相互作用。

接下来，对醋酸阿比特龙的纳米制剂和市售制剂进行了X射线衍射研究。进行这些研究是为了对DSC数据进行交叉验证，表明醋酸阿比特龙在研磨和包衣前后的结晶度没有变化。类似地，未研磨和研磨的醋酸阿比特龙的衍射光谱表明结晶度没有变化，如图23中观察到的许多不同峰所示。没有观察到新的峰，表明药物和载体之间没有相互作用。在类似的位置清楚地看到来自研磨和未研磨的制剂的醋酸阿比特龙的突出峰，表明在纳米制剂过程期间结晶度没有变化。在XRD分析中观察到的代表性2θ峰如以下表5所示。

表5

2θ (<sup>o</sup>)	强度(cps; 纳米制剂)	强度(cps; 市售制剂)
			12	902	706
16	1053	788
			20	2754	1244
21	1035	981
			24	952	672
27	6307	560

其他实施方案

应当理解，尽管本发明已经结合其详述进行描述，但是前述描述旨在说明而不是限制由所附权利要求的范围定义的本发明范围。其他方面、优点和修改处于随附权利要求的范围内。