一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法
阅读说明：本技术 一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法 (Method for cultivating soybean resisting soybean mosaic virus ) 是由 高乐 侯文胜 韩天富 孙�石 吴存祥 蒋炳军 陈莉 于 2018-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法。本发明以SMV HC-Pro基因作为靶标基因,对国内外SMV流行株系进行多重核苷酸序列比对,在保守区间内确定了gRNA靶点序列,构建了CRISPR/Cas9基因组定点编辑载体,进一步应用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系,获得一批阳性转基因材料,通过SMV抗病鉴定、qRT-PCR、DAS-ELISA血清学实验,分别从表型水平、RNA水平和蛋白水平研究了T<Sub>1</Sub>代大豆植株对SMV的抗病情况,筛选出一批抗性大豆材料。本发明在大豆SMV抗性机制的研究和抗病育种中具有重要的理论意义和实用价值。本发明具有重要的应用价值。(The invention discloses a method for cultivating soybean resisting soybean mosaic virus. The invention takes SMV HC-Pro gene as target gene, multiple nucleotide sequence comparison is carried out on SMV epidemic strains at home and abroad, gRNA target sequence is determined in a conservative interval, CRISPR/Cas9 genome fixed-point editing vector is constructed, agrobacterium tumefaciens is further applied to mediate a genetic transformation system of soybean cotyledonary node to obtain a batch of positive transgenic material, and T is researched from phenotype level, RNA level and protein level respectively through SMV disease-resistant identification, qRT-PCR and DAS-ELISA serological experiments 1 And (5) screening a batch of resistant soybean materials according to the disease resistance of the soybean plant to the SMV. The invention has important theoretical significance and practical value in the research of the soybean SMV resistance mechanism and the breeding for disease resistance. The invention has important application value.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法。
背景技术
由大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)引起的大豆花叶病毒病是一种全球性大豆病害，广泛分布于世界各大豆产区，严重影响大豆的产量和品质。SMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，大豆花叶病毒种。大豆感染SMV后，会产生花叶和坏死等症状，造成大豆光合面积减少和光合能力降低，植株矮化，生长量下降，籽粒出现褐斑，造成大豆产量损失约35％-50％，甚至绝收。
CRISPR/Cas9技术是近年新兴起的一种高效、精准、特异的基因组靶向修饰技术，能够利用序列特异性核酸酶实现基因组的靶向切割和特定位点的***、缺失、突变或替换，为基因功能的鉴定、作物性状的定向改良提供了新的有效手段。近些年来，科学家们已经成功地将CRISPR/Cas9技术应用于大豆研究当中，包括敲除外源绿色荧光蛋白基因(gfp)和除草剂抗性基因(bar)，敲除内源功能基因(如GmFEI2、GmSHR、GmFT2a、GmPDS11或GmPDS18)，开发快速识别大豆基因组中靶位点及限制性酶切位点的在线网络工具等。但上述研究均未涉及大豆花叶病毒病抗性的改良。
发明内容
本发明的目的是提高大豆对大豆花叶病毒的抗性。
本发明首先保护一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法，可为使大豆含有CRISPR-Cas9系统；所述CRISPR-Cas9系统中含有sgRNA；
所述sgRNA识别的靶标可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因。
上述方法中，所述使大豆含有CRISPR-Cas9系统具体可通过向大豆中导入含有CRISPR-Cas9系统的载体实现。
上述方法中，所述大豆可为大豆花叶病毒感病品种。
上述方法中，所述大豆具体可为大豆品种Jack。
上述方法中，所述sgRNA识别的靶标具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区。所述大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因自5’末端起第2039-2309位(图1所示)或第8373-8530位(图2所示)。
上述方法中，所述sgRNA识别的靶位点可为序列表中序列1或序列表中序列2所示的DNA分子。
上述方法中，所述CRISPR-Cas9系统还可含有Cas9蛋白的编码基因。
本发明还保护一种含有sgRNA的CRISPR-Cas9系统；所述sgRNA识别的靶标可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因。
上述CRISPR-Cas9系统中，所述sgRNA识别的靶标具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区。所述大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因自5’末端起第2039-2309位(图1所示)或第8373-8530位(图2所示)。
上述CRISPR-Cas9系统中，所述sgRNA识别的靶位点可为序列表中序列1或序列表中序列2所示的DNA分子。
上述CRISPR-Cas9系统中，所述CRISPR-Cas9系统还可含有Cas9蛋白的编码基因。
所述CRISPR-Cas9系统具体可为含有CRISPR-Cas9系统的载体。
上文中，所述大豆花叶病毒的株系可为a1)至a13)中的至少一个；a1)SMV SC3株系(Genebank登录号为JF833013)；a2)SMV G2株系(Genebank登录号为S42280)；a3)SMV G3株系(Genebank登录号为FJ640978)；a4)SMV G4株系(Genebank登录号为FJ640979)；a5)SMVG6株系(Genebank登录号为FJ640980)；a6)SMV G7株系(Genebank登录号为AF241739)；a7)SMV N株系(Genebank登录号为D00507)；a8)SMVG1株系(Genebank登录号为FJ640977)；a9)SMV SC6株系(Genebank登录号为HM590054)；a10)SMV SC15(6067-1)株系(Genebank登录号为JF833015)；a11)SMV SC21(6202-2)株系(Genebank登录号为JF833014)；a12)SMV HH5株系(Genebank登录号为AJ310200)；a13)SMV HZ株系(Genebank登录号为AJ312439)。
上文中，所述含有CRISPR-Cas9系统的载体具体可为实施例提及的重组质粒Cas9-HCss(+)。重组质粒Cas9-HCss(+)具体可为oligo二聚体甲和Cas9/gRNA Vector发生同源重组获得。Cas9/gRNA Vector可为植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒中的组件。植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒具体可为北京唯尚立德生物科技有限公司的产品，货号为VK005-15。oligo二聚体甲可由HCss(+)-F：5’-TTGTCTTTAGCTATGTACATCCT-3’和HCss(+)-R：5’-AACAGGATGTACATAGCTAAAGA-3’退火形成。
上文中，所述含有CRISPR-Cas9系统的载体具体可为实施例提及的重组质粒Cas9-HCss(-)。重组质粒Cas9-HCss(-)具体可为oligo二聚体乙和所述Cas9/gRNAVector发生同源重组获得。ligo二聚体乙可由HCss(-)-F：5’-TTGCATGTGGAGAATCATGAATG-3’和HCss(-)-R：5’-AACCATTCATGATTCTCCACATG-3’退火形成。
上文中，所述大豆花叶病毒的HC-Pro基因具体可为D1)至D13)中的至少一个；D1)SMV SC3株系的HC-Pro基因；D2)SMV G2株系的HC-Pro基因；D3)SMV G3株系的HC-Pro基因；D4)SMV G4株系的HC-Pro基因；D5)SMV G6株系的HC-Pro基因；D6)SMV G7株系的HC-Pro基因；D7)SMV N株系的HC-Pro基因；D8)SMVG1株系的HC-Pro基因；D9)SMV SC6株系的HC-Pro基因；D10)SMV SC15(6067-1)株系的HC-Pro基因；D11)SMV SC21(6202-2)株系的HC-Pro基因；D12)SMV HH5株系的HC-Pro基因；D13)SMV HZ株系的HC-Pro基因。
本发明还保护上述任一所述的CRISPR-Cas9系统在培育抗大豆花叶病毒的大豆中的应用。
本发明还保护上述任一所述的CRISPR-Cas9系统在提高大豆对大豆花叶病毒的抗性中的应用。
上述任一所述的方法或上述任一所述的CRISPR-Cas9系统在大豆育种的应用也属于本发明的保护范围。
本发明以SMV HC-Pro基因作为靶标基因，对国内外SMV流行株系进行多重核苷酸序列比对，在保守区间内确定了gRNA靶点序列，构建了CRISPR/Cas9基因组定点编辑载体，进一步应用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系，获得一批阳性转基因材料，通过SMV抗病鉴定、qRT-PCR、DAS-ELISA血清学实验，分别从表型水平、RNA水平和蛋白水平研究了T1代大豆植株对SMV的抗病情况，筛选出一批抗性大豆材料。本发明在大豆SMV抗性机制的研究和抗病育种中具有重要的理论意义和实用价值。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为SMV正义链基因组多重核苷酸序列同源性比对。
图2为SMV负义链基因组多重核苷酸序列同源性比对。
图3为大肠杆菌菌液PCR扩增。
图4为T0代转基因大豆的除草剂涂抹鉴定。
图5为T0代转基因大豆的PCR检测。
图6为T0代转基因大豆的PAT/bar转基因检测试纸鉴定。
图7为T1代转基因大豆的SMV叶片发病症状。
图8为T1代转基因大豆的SMV株型发病症状。
图9为T1代转基因大豆的qRT-PCR分析。
图10为T1代转基因大豆的DAS-ELISA分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
2×Taq MasterMix为北京天根生化科技有限公司的产品。植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒为北京唯尚立德生物科技有限公司的产品，货号为VK005-15。Cas9/gRNA Vector、Solution 1和Solution 2均为植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒中的组件。
LB液体培养基：向适量蒸馏水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠30g，充分溶解，调节pH至8.0，然后加入蒸馏水定容至1L；121℃高压灭菌15min。
LB固体培养基：向适量蒸馏水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠30g，充分溶解，调节pH至8.0，然后加入琼脂15g，用蒸馏水定容至1L；121℃高压灭菌15min。
LB抗性平板：待LB固体培养基约55℃，加入卡那霉素并使其在体系中的浓度为50mg/L，混匀，倒入培养皿，自然冷却。
大豆品种Jack为国家农作物种质资源库的产品，编号为WDD01579。大豆品种Jack为SMV感病品种。
大豆品种南农1138-2和SMV SC3株系均为南京农业大学国家大豆改良中心提供。
下述实施例中涉及的引物的核苷酸序列见表1。
表1
引物名称
引物序列(5'→3')
dpCas9-F
TTGGGGCTCACACCAAACTT
dpCas9-R
CGATCGCCTTCTTTTGCTCG
bar-F
CGAGACAAGCACGGTCAACTT
bar-R
AAACCCACGTCATGCCAGTTC
Cas9-TY
CGTTGACTCCCCCGTAGGTT
HCss(+)-F
<u>TTG</u>TCTTTAGCTATGTACATCCT
HCss(+)-R
<u>AAC</u>AGGATGTACATAGCTAAAGA
HCss(-)-F
<u>TTG</u>CATGTGGAGAATCATGAATG
HCss(-)-R
<u>AAC</u>CATTCATGATTCTCCACATG
注：下划线为特异性重组位点。
实施例1、SMV基因组多重核苷酸序列比对及gRNA靶点的确定
1、在美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)网站上搜索国内外13个SMV流行株系(13个SMV流行株系的名称和对应的Genebank登录号见表2)的全基因组序列，然后利用ClustalX 1.83软件对SMV正义链和负义链的基因组进行多重核苷酸序列同源性比对，分别确定出SMVHC-Pro基因的保守区间为2039-2309nt(见图1)和8373-8530nt(见图2)，然后搜索到PAM位点并确定出相似度为100％的gRNA(+)靶点序列(见图1)和gRNA(-)靶点序列(见图2)。
gRNA(+)靶点序列：5’-AGGATGTACATAGCTAAAGA-3’(序列表中序列1)。
gRNA(-)靶点序列：5’-CATTCATGATTCTCCACATG-3’(序列表中序列2)。
表2
SMV株系
Genebank登录号
G1
FJ640977
G2
S42280
G3
FJ640978
G4
FJ640979
G6
FJ640980
G7
AF241739
N
D00507
SC3
JF833013
SC6
HM590054
SC15(6067-1)
JF833015
SC21(6202-2)
JF833014
HH5
AJ310200
HZ
AJ312439
2、完成步骤1后，根据gRNA(+)靶点序列人工合成HCss(+)-F和HCss(+)-R。根据gRNA(-)靶点序列人工合成HCss(-)-F和HCss(-)-R。
实施例2、T1代转基因大豆获得及表型水平、RNA水平和蛋白水平的SMV抗病鉴定
一、重组农杆菌的获得
1、取Microtube，加入5μLHCss(+)-F水溶液(浓度为10μM)、5μLHCss(+)-R水溶液(浓度为10μM)和15μLAutoclaved ddH2O，得到混合液。
2、完成步骤1后，将所述Microtube置于金属浴，进行退火，得到反应液。该反应液中含oligo二聚体。
退火程序：95℃3min，95℃缓慢冷却至25℃(每min下降约3℃)，16℃5min。
3、完成步骤2后，另取一新的Microtube，加入1μL步骤(2)得到的反应液、1μLCas9/gRNA Vector、1μL Solution 1、1μL Solution 2和6μLAutoclaved ddH2O，混匀。
4、完成步骤3后，将所述Microtube置于金属浴，16℃静置反应2h，得到反应产物。该反应产物中含有oligo二聚体和Cas9/gRNA Vector发生同源重组得到的重组质粒Cas9-HCss(+)。
5、将步骤4得到的反应产物通过热激法转化大肠杆菌感受态DH5α，然后加入500μLLB液体培养基，37℃、225rpm培养45-60min；最后均匀涂布于LB抗性平板，37℃倒置培养10-16h，得到约若干个单克隆。
6、完成步骤5后，分别将各个单克隆接种至LB液体培养基，37℃、225rpm培养8h，得到培养菌液。
7、分别以步骤6得到的培养菌液为模板，采用HCss(+)-F和Cas9-TY组成的引物对进行菌液PCR，得到PCR扩增产物。
反应体系为25μL，由1μL培养菌液、1μLHCss(+)-F水溶液(浓度为10μM)、1μLCas9-TY水溶液(浓度为10μM)、12.5μL2×Taq MasterMix和9.5μL Autoclaved ddH2O组成。
反应程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。
8、完成步骤7后，将各个PCR扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳。如果PCR扩增产物中含有约455bp的DNA片段，则对应的单克隆为阳性单克隆。
部分实验结果见图3中A(M为DNA Marker，泳道1-5均为单克隆)。结果表明，泳道1-5对应的单克隆均为阳性单克隆。
9、取步骤6中阳性单克隆的培养菌液，提取质粒并转化农杆菌EHA105感受态细胞，得到重组农杆菌，命名为EHA105-Cas9-HCss(+)。
按照上述步骤1-9，将HCss(+)-F替换为引物HCss(-)-F，HCss(+)-R替换为HCss(-)-R，其它步骤均不变，得到重组农杆菌，命名为EHA105-Cas9-HCss(-)。步骤8的部分实验结果见图3中B。
二、T0代转基因大豆的获得和鉴定
1、T0代拟转基因大豆的获得
采用农杆菌介导的方法(Characterization of Soybean mosaic virusresistance derived from inverted repeat-SMV-HC-Pro genes in multiple soybeancultivars(DOI 10.1007/s00122-015-2522-0)，将EHA105-Cas9-HCss(+)诱导转化大豆品种Jack的子叶节，经过bar基因的筛选(即bar基因为筛选标记)、分化，获得T0代拟转HCss(+)基因大豆。
采用农杆菌介导的方法，将EHA105-Cas9-HCss(-)诱导转化大豆品种Jack的子叶节，经过bar基因的筛选(即bar基因为筛选标记)、分化，获得T0代拟转HCss(-)基因大豆。
各个重组农杆菌侵染的外植体数和获得的T0代拟转基因大豆株数如表3中第2列和第3列所示。
表3
重组农杆菌
侵染外植体数(个)
T<sub>0</sub>代拟转基因大豆株数(株)
阳性T<sub>0</sub>植株数(个)
EHA105-Cas9-HCss(+)
1848
163
41
CRISPR/Cas9-HCss(-)
1325
156
42
总计
3173
319
83
2、T0代拟转基因大豆的鉴定
(1)除草剂涂抹
待测大豆为163株T0代拟转HCss(+)基因大豆、156株T0代拟转HCss(-)基因大豆或大豆品种Jack(即非转基因植株)。
在正常生长的待测大豆的叶片的叶脉左边部分均匀涂抹浓度为200mg/L的Basta水溶液，叶脉右边部分均匀涂抹等体积的水(作为对照)，5-7天后观察。
部分结果见图4。结果表明，部分T0代拟转HCss(+)基因大豆、部分T0代拟转HCss(-)基因大豆和对照的叶片均没有没有出现药害症状，部分T0代拟转HCss(+)基因大豆、部分T0代拟转HCss(-)基因大豆和大豆品种Jack的叶片均出现了明显的药害症状。没有出现药害症状的T0代拟转HCss(+)基因大豆或T0代拟转HCss(-)基因大豆即为转基因阳性植株。出现了明显的药害症状的T0代拟转HCss(+)基因大豆或T0代拟转HCss(-)基因大豆即为转基因阴性植株。
没有出现药害症状的T0代拟转HCss(+)基因大豆初步鉴定为T0代转HCss(+)基因大豆。没有出现药害症状的T0代拟转HCss(-)基因大豆初步鉴定为T0代转HCss(-)基因大豆。
(2)PCR扩增检测
引物对甲由HCss(+)-F和Cas9-TY组成，用于扩增gRNA(+)靶点序列。引物对乙由HCss(-)-F和Cas9-TY组成，用于扩增gRNA(-)靶点序列。引物对丙由dpCas9-F和Cas9-TY组成，用于扩增dpCas9基因(dpCas9基因位于Cas9/gRNA Vector中)。引物对丁由引物bar-F和引物bar-R组成，用于扩增bar基因(bar基因位于Cas9/gRNA Vector中)。
分别以步骤(1)中初步鉴定为T0代转HCss(+)基因大豆的叶片的基因组DNA为模板，采用引物对甲、引物对丙或引物对丁进行PCR扩增，PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外凝胶成像仪成像。
分别以步骤(1)中初步鉴定为T0代转HCss(-)基因大豆的叶片的基因组DNA为模板，采用引物对乙、引物对丙或引物对丁进行PCR扩增，PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外凝胶成像仪成像。
分别以重组质粒Cas9-HCss(+)(作为阳性对照)、非转基因植株(作为阴性对照)和灭菌水(作为空白对照)为模板，采用引物对甲、引物对乙、引物对丙或引物对丁进行PCR扩增，PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外凝胶成像仪成像。
部分结果见图5(M为DNA Marker，v为阳性对照，n为阴性对照，d为空白对照，1-5为T0代转HCss(+)基因大豆，6-10为T0代转HCss(-)基因大豆)。结果表明，以步骤(1)中初步鉴定为T0代转HCss(+)基因大豆的叶片的基因组DNA为模板，如果采用引物对甲进行PCR扩增获得的PCR扩增产物含有455bp的DNA片段、采用引物对丙进行PCR扩增获得的PCR扩增产物含有910bp的DNA片段、采用引物对丁进行PCR扩增获得的PCR扩增产物含有402bp的DNA片段，则该T0代转HCss(+)基因大豆再次鉴定为T0代转HCss(+)基因大豆。以步骤(1)中初步鉴定为T0代转HCss(-)基因大豆的叶片的基因组DNA为模板，如果采用引物对乙进行PCR扩增获得的PCR扩增产物含有455bp的DNA片段、采用引物对丙进行PCR扩增获得的PCR扩增产物含有910bp的DNA片段、采用引物对丁进行PCR扩增获得的PCR扩增产物含有402bp的DNA片段，则该T0代转HCss(-)基因大豆再次鉴定为T0代转HCss(-)基因大豆。
(3)PAT/bar转基因检测试纸
QuickStixTM试剂盒为EnviroLogix公司的产品。抽提缓冲液和PAT/bar转基因检测试纸均为QuickStixTM试剂盒中的组件。
待测叶片为步骤(2)中再次鉴定为T0代转HCss(+)基因大豆的叶片、步骤(2)中再次鉴定为T0代转HCss(-)基因大豆的叶片、转基因阴性植株的叶片或非转基因植株的叶片。
取离心管(规格为1.5mL)，加入适量(约1-2个离心管盖大小)待测叶片，碾碎；然后加入0.5mL抽提缓冲液，混匀，得到叶片提取液；最后将PAT/bar转基因检测试纸的下段浸入叶片提取液，静置10min，观察控制线和检测线处是否有红色条带出现。
部分结果见图6(NT为非转基因植株，NA为转基因阴性植株，1-5为T0代转HCss(+)基因大豆，6-10为T0代转HCss(-)基因大豆)。结果表明，采用PAT/bar转基因检测试纸检测步骤(2)中再次鉴定为T0代转HCss(+)基因大豆的叶片提取物，如果出现了两条红色条带，则该T0代转HCss(+)基因大豆鉴定为T0代转HCss(+)基因大豆。采用PAT/bar转基因检测试纸检测步骤(2)中再次鉴定为T0代转HCss(-)基因大豆的叶片提取物，如果出现了两条红色条带，则该T0代转HCss(-)基因大豆鉴定为T0代转HCss(+)基因大豆。
实验结果见表3中第4列：共获得41株T0代转HCss(+)基因大豆和42株T0代转HCss(-)基因大豆。
3、T0代转基因大豆的SMV抗病鉴定
T0代转基因大豆为T0代转HCss(+)基因大豆或T0代转HCss(-)基因大豆。
1、在南农1138-2上接种SMV SC3株系(目的为将SMV SC3株系进行繁殖、活化)，待植株发病后，收集具有重花叶症状的叶片并置于无菌研钵中。
2、完成步骤1后，取所述研钵，加入pH7.4、0.01M磷酸缓冲液(1g叶片：(3-5mL)pH7.4、0.01M磷酸缓冲液)和少量的金刚砂(600目)，碾磨，得到匀浆。
3、将步骤2得到的匀浆用毛刷(紫外线灭菌)分别涂抹至41株T0代转HCss(+)基因大豆和42株T0代转HCss(-)基因大豆展平的真叶上，第一组复叶展平时重复接种一次(此时记为接种第1天)，每次接种后均用自来水进行冲洗。
将T0代转基因大豆替换为大豆品种Jack，其它步骤均不变，作为阳性对照。
将T0代转基因大豆替换为大豆品种Jack，匀浆替换为pH7.4、0.01M磷酸缓冲液，其它步骤均不变，作为阴性对照。
4、完成步骤3后7-10天(即接种第7-10天)，阳性对照发病明显，此时开始对T0代转基因大豆的SMV症状调查，每隔3天观察记录一次，连续统计2个月。SMV症状调查包括无症状(-)、轻花叶(LM)、花叶(M)和重花叶(SM)，根据发病情况大豆划分为4种反应类型(见表4)。
表4
类型
划分标准
高度抗病(HR)
无症状(-)
抗病(R)
仅出现轻花叶(LM)症状
轻微抗病(MR)
出现花叶(M)症状
感病(S)
出现重花叶(SM)症状
统计结果表明，与大豆品种Jack相比，T0代转基因大豆的SMV抗性均有一定程度的提高。
三、T1代转基因大豆的SMV抗病鉴定
T1代转基因大豆为T1代转HCss(+)基因大豆或T1代转HCss(-)基因大豆。
T0代转HCss(+)基因大豆植株自交获得T1种子，种植T1代植株，幼苗期进行除草剂涂抹(方法同步骤(1))、PCR检测(方法同步骤(2))、PAT/bar转基因检测试纸鉴定(方法同步骤(3))，获得T1代转HCss(+)基因大豆。
T0代转HCss(-)基因大豆植株自交获得T1种子，种植T1代植株，幼苗期进行除草剂涂抹(方法同步骤(1))、PCR检测(方法同步骤(2))、PAT/bar转基因检测试纸鉴定(方法同步骤(3))，获得T1代转HCss(-)基因大豆。
1、在南农1138-2上接种SMV SC3株系(目的为将SMV SC3株系进行繁殖、活化)，待植株发病后，收集具有重花叶症状的叶片并置于无菌研钵中。
2、完成步骤1后，取所述研钵，加入pH7.4、0.01M磷酸缓冲液(1g叶片：(3-5mL)pH7.4、0.01M磷酸缓冲液)和少量的金刚砂(600目)，碾磨，得到匀浆。
3、将步骤2得到的匀浆用毛刷(紫外线灭菌)涂抹至493株T1代转基因大豆展平的真叶上，第一组复叶展平时重复接种一次(此时记为接种第1天)，每次接种后均用自来水进行冲洗。
将T1代转基因大豆替换为大豆品种Jack，其它步骤均不变，作为阳性对照。
将T1代转基因大豆替换为大豆品种Jack，匀浆替换为pH7.4、0.01M磷酸缓冲液，其它步骤均不变，作为阴性对照。
4、完成步骤3后7-10天(即接种第7-10天)，阳性对照发病明显，此时开始对T1代转基因大豆的SMV症状调查，每隔3天观察记录一次，连续统计2个月。SMV症状调查包括无症状(-)、轻花叶(LM)、花叶(M)和重花叶(SM)，根据发病情况大豆划分为4种反应类型(见表4)。
统计结果见表5。结果表明，与大豆品种Jack相比，T1代转基因大豆的SMV抗性有一定程度的提高。
表5
重组农杆菌
T<sub>1</sub>代转基因大豆株数
HR
R
MR
S
EHA105-Cas9-HCss(+)
195个
4个(1.1％)
24个(12.3％)
18个(9.2％)
149个(76.4％)
CRISPR/Cas9-HCss(-)
298个
11个(3.7％)
29个(9.7％)
40个(13.4％)
218个(73.2％)
总计
493个
15个(3.0％)
53个(10.8％)
58个(11.8％)
367个(74.4％)
5、完成步骤3后15天或30天(即接种第15天或30天)，观察叶片症状和株型症状。
叶片症状的部分实验结果见图7。结果表明，阳性对照呈现出典型的SMV花叶症状，阴性对照始终未观察到任何症状，T1代转HCss(+)基因大豆或T1代转HCss(-)基因大豆的高抗植株(HR)表型与阴性对照一致，T1代转HCss(+)基因大豆或T1代转HCss(-)基因大豆的抗病植株(R)、轻微抗病植株(MR)以及感病植株(S)，随着抗性的不同而表现出不同程度的SMV花叶症状。
株型症状的部分实验结果见图8。结果表明，阳性对照表现出严重的植株矮化现象，阴性对照呈现出良好的生长态势，T1代转HCss(+)基因大豆或T1代转HCss(-)基因大豆的高抗植株(HR)表型与阴性对照一致，T1代转HCss(+)基因大豆或T1代转HCss(-)基因大豆的抗病植株(R)、轻微抗病植株(MR)以及感病植株(S)，随着抗性的不同而表现出不同程度的植株矮化现象。
四、T1代转基因大豆的qRT-PCR分析
待测植株为步骤三中3后15天或30天(即接种第15天或30天)的T1代转HCss(+)基因大豆的高抗植株(HR)、T1代转HCss(+)基因大豆的抗病植株(R)、T1代转HCss(+)基因大豆的轻微抗病植株(MR)、T1代转HCss(+)基因大豆的感病植株(S)、T1代转HCss(-)基因大豆的高抗植株(HR)、T1代转HCss(-)基因大豆的抗病植株(R)、T1代转HCss(-)基因大豆的轻微抗病植株(MR)、T1代转HCss(-)基因大豆的感病植株(S)或阳性对照。
1、取待测植株的顶端嫩叶，采用RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司的产品，货号为DP432)提取总RNA。
2、完成步骤1后，取待测植株的总RNA，采用
3、完成步骤2后，以待测植株的cDNA为模板，采用
检测sgRNA(+)、sgRNA(-)、dpCas9、SMV、GmTubulin(作为内参)的上下游引物如表6所示。qRT-PCR的反应体系如表7所示。
表6
表7
注：上游引物即表6中引物名称中含有“F”的引物，下游引物即与之对应的表6中引物名称中含有“R”的引物。
qRT-PCR的反应程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；95℃15s。
实验结果见图9(HCss(+)为T1代转HCss(+)基因大豆，HCss(-)为T1代转HCss(-)基因大豆，NT为阳性对照)：关于sgRNA和dpCas9，在高抗植株(HR)的表达量最高，抗病植株(R)和轻微抗病植株(MR)的表达量次之，在感病植株(S)中表达量最低，在阳性对照没有检测到；关于SMV，阳性对照的cDNA中表达量最高，在感病植株(S)、抗病植株(R)和轻微抗病植株(MR)的表达量次之，在高抗植株(HR)没有检测到。这一结果与表型的观察结果(图7和图8)相一致。由此可知，SMV的病毒积累量与sgRNA、dpCas9基因的表达量水平呈负相关，说明sgRNA、dpCas9基因的转录本对SMV起到了抑制作用，并且抑制效果与该两个基因的表达量水平密切相关。
五、T1代转基因大豆的DAS-ELISA血清学分析
待测植株为步骤三中3后60天(即接种第60天)的T1代转HCss(+)基因大豆的高抗植株(HR)、T1代转HCss(+)基因大豆的抗病植株(R)、T1代转HCss(+)基因大豆的轻微抗病植株(MR)、T1代转HCss(+)基因大豆的感病植株(S)、T1代转HCss(-)基因大豆的高抗植株(HR)、T1代转HCss(-)基因大豆的抗病植株(R)、T1代转HCss(-)基因大豆的轻微抗病植株(MR)、T1代转HCss(-)基因大豆的感病植株(S)、阳性对照或阴性对照。
取待测植株的顶端嫩叶或DAS-ELISA试剂盒中的底物缓冲液(作为底物对照)，按照DAS-ELISA试剂盒(美国ACD公司的产品，货号为V094-R1)的操作步骤对SMV进行血清学分析。显色1h后，在酶标仪405nm波长下测定光密度值(OD)，并参照以下标准分析实验结果：
1、对照孔OD值(底物孔、阴性对照及阳性对照孔)应在产品质量控制范围内；
2、底物孔OD值<0.15；
3、阳性对照OD值/阴性对照OD值>10.0；
4、样品OD值＝原始OD值-底物孔OD值；
5、样品OD值/阴性对照OD值≥2.0，判为阳性；
6、样品OD值/阴性对照OD值<2.0，判为阴性。
每个样本设置3次重复。
实验结果见图10(HCss(+)为T1代转HCss(+)基因大豆，HCss(-)为T1代转HCss(-)基因大豆)和表8：阳性对照颜色明显，阴性对照和底物对照无颜色；高抗植株(HR)的数值均低于2.0，呈SMV阴性，随着植株抗性降低，数值不断增加，均高于2.0，呈SMV阳性。
表8
注：P为检测样品；N为阴性对照；NT为大豆品种Jack；OD405nm为在405nm波长下的光密度值(OD)；N(OD405nm)为0.098；(+)：SMV阳性；(-)：SMV阴性。
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