阅读说明：本技术 调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用 (Gene for regulating plant flavonoid synthesis and ultraviolet resistance and application thereof ) 是由 刘宏涛 梁通 史辰 于 2018-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用。首次研究及揭示了油菜素甾醇信号通路对植物体内类黄酮合成以及植物对紫外线的抗性的影响及其分子机制。油菜素甾醇信号通路,特别是其中的转录因子BES1,其能够负调控MYB转录因子,在此基础上调控植物体内类黄酮合成,并进而调控植物对紫外线的抗性。(The invention relates to a gene for regulating plant flavonoid synthesis and ultraviolet resistance and application thereof. The first research and the disclosure of the influence of brassinosteroid signal path on the synthesis of flavonoid in plants and the resistance of plants to ultraviolet rays and the molecular mechanism thereof. Brassinosteroid signalling pathways, particularly the transcription factor BES1 therein, are capable of negatively regulating MYB transcription factors, and on the basis of this regulate flavonoid synthesis in plants, and thus the resistance of plants to ultraviolet light.)

调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物学和分子生物学领域，更具体地，本发明涉及调节植 物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用。

背景技术

植物光合作用中，能够利用的主要光谱区是波长640～660nm的红光部 分和波长400～500nm的蓝光部分。而紫外线对植物光合作用没有什么作用， 现有技术中，也有认为过多的紫外线照射会影响植物的光合作用效率。植物 进化过程中，体内也获得了一些抵抗紫外胁迫的机制。

紫外线UV-B(280-315nm)是太阳光的一部分，可以部分到达地表，对 植物生长发育具有重要影响。UV-B既可以作为光信号调节植物生长发育， 例如抑制下胚轴伸长、促进类黄酮和花青素积累、抑制避荫性和高温响应等； 也可能对植物造成胁迫，比如损伤叶绿体光合复合体进而抑制光合作用、 DNA吸收UV-B进而造成DNA损伤等。

植物作为固生生长的生物，既要抵抗紫外胁迫，同时也要兼顾生长发育。 关于这方面的研究比较少，可供分子设计育种的基因也很少。MYB转录因 子已被证实在植物抗逆胁迫中起作用。MYB转录因子可以直接控制黄酮 醇合成基因的表达，从而促进类黄酮的积累。植物体内的类黄酮可以吸收 UV-B，作为“防晒霜”保护植物细胞，增强植物对紫外胁迫的抵抗能力。 类黄酮除了保护植物，抵抗紫外胁迫，同时在人类健康和工业生产中有重 要作用，它具有抗炎、抗氧化、抗癌功效，也可以作为天然产物应用于食 品加工。

但是，关于UV-B诱导类黄酮积累和抵抗紫外胁迫的研究还不是很清 楚，至少有以下问题有待解决：1.在没有UV-B时，MYB基因表达量低，类 黄酮积累少，那么植物在正常生长状态下是如何抑制MYB表达呢？已发现 存在正调控因子促进MYB基因表达，是否存在其他因子调控MYB基因表 达？2.植物是如何平衡正常的生长发育和抵抗紫外胁迫呢？因此，本领域亟 待研究这些问题，发现更多的调控MYB的基因有利于精细定向地调控类黄 酮的积累；阐明植物平衡生长发育和抵抗紫外胁迫的分子机理，有助于培育 出既抗紫外胁迫又兼顾产量的优质品种。

发明内容

本发明的目的在于提供调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应 用。

在本发明的第一方面，提供一种调节植物体内类黄酮合成或调控植物 对紫外线的抗性的方法，所述方法包括：调控植物体内油菜素甾醇(BR)信号 通路的转录因子BES1，从而调控(负调控)植物体内类黄酮的合成或植物对 紫外线的抗性；其中，所述的BES1包括其同源物。所述的同源物包括在多 个物种中的同源多肽或基因，例如拟南芥或玉米中BES1，水稻中OsBZR1 homolog。

在一个优选例中，所述方法选自：(a)下调BES1，从而促进植物体内类 黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性；或(b)上调BES1，从而抑制植物体 内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性。

在另一优选例中，(a)中，BES1被下调，使得MYB转录因子表达增加， 进而促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性；或(b)中，BES1 被上调，使得MYB转录因子表达降低，进而抑制植物体内类黄酮的合成或 降低植物对紫外线的抗性；较佳地，所述的MYB转录因子包括MYB11， MYB12，MYB111。

在另一优选例中，所述的BES1通过与MYB基因启动子G-box结合而 调控MYB转录因子表达。

在另一优选例中，(a)中，下调BES1包括：在植物中敲除或沉默BES1 的编码基因，或抑制BES1的活性；较佳地，包括(但不限于)：以特异性 干扰BES1的编码基因表达的干扰分子来沉默BES1，以紫外胁迫抑制BES1 表达，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除BES1的编码基因，或以同 源重组的方法敲除BES1编码基因。

在另一优选例中，所述的以紫外胁迫抑制BES1表达是以BUV中波长 为280-300nm的紫外线进行紫外胁迫。

在另一优选例中，所述的干扰分子是以BES1的编码基因或其转录本为 抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表 达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；较 佳地，所述的干扰分子是以BES1cDNA序列构建的dsRNA。

在另一优选例中，(b)中，上调BES1包括(但不限于)：将BES1的编码 基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；或对BES1进行功 能获得性点突变，较佳地，将其编码区第698个核苷酸由C突变为T。

在本发明的另一方面，提供一种调节植物体内类黄酮合成或调控植物对 紫外线的抗性的方法，所述方法包括：调控植物体内油菜素甾醇信号通路的 转录因子BES1对于MYB转录因子的抑制作用，从而调控(负调控)植物体 内类黄酮的合成或植物对紫外线的抗性。

在一个优选例中，所述方法选自：(1)降低BES1对MYB转录因子的抑 制作用，从而促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性；或(2) 提高BES1对MYB转录因子的抑制作用，从而抑制植物体内类黄酮的合成 或降低植物对紫外线的抗性。

在一个优选例中，所述的植物包括(但不限于)：禾本科植物、十字花科 植物。

在本发明的另一方面，提供一种油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1 或其调节剂的用途，用于调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗 性。

在一个优选例中，所述的BES1或其上调剂抑制植物体内类黄酮的合成 或降低植物对紫外线的抗性；所述的BES1的下调剂促进植物体内类黄酮的 合成或提高植物对紫外线的抗性。

在本发明的另一方面，提供一种油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1 的用途，用于作为鉴定植物体内类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性的分 子标记。

在本发明的另一方面，提供一种定向选择类黄酮合成能力或植物对紫外 线的抗性增强或减弱的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物体内油菜 素甾醇信号通路，特别是其中的转录因子BES1的表达，若是该测试植物的 BES1表达低于该类(或该种)植物的BES1平均表达值，则其为(潜在地为)类 黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性强的植物；若是该测试植物的BES1表 达高于该类(或该种)植物的BES1平均表达值，则其为(潜在地为)类黄酮合成 能力或植物对紫外线的抗性弱的植物。

在本发明的另一方面，提供一种定向选择类黄酮合成能力或植物对紫外 线的抗性增强或减弱的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物体内油菜 素甾醇信号通路转录因子BES1对于MYB转录因子的抑制作用，若是该测 试植物中BES1对于MYB转录因子的抑制作用低于该类(或该种)植物的平 均水平，则其为类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性强的植物；若是该测 试植物中BES1对于MYB转录因子的抑制作用高于该类(或该种)植物的平 均水平，则其为类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性弱的植物。

在本发明的另一方面，提供一种筛选调节植物体内类黄酮合成或调控植 物对紫外线的抗性的调节剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到 含有植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1的体系中；较佳地，该体 系含有油菜素甾醇信号通路；(2)检测所述体系中，观测(1)的体系中转录因 子BES1的表达或活性；若所述候选物质抑制(较佳地是统计学上抑制；如降 低20％以上，较佳地抑制50％以上，更佳地抑制80％以上)BES1的表达或活 性，则表明该候选物质是促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的 抗性的调节剂；若所述候选物质提高(较佳地是统计学上提高；如促进20％ 以上，较佳地提高50％以上，更佳地提高80％以上)BES1的表达或活性，则 表明该候选物质是抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性 的调节剂。

在本发明的另一方面，提供一种筛选调节植物体内类黄酮合成或调控植 物对紫外线的抗性的调节剂的方法，所述方法包括：(a)将候选物质加入到 含有植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1，以及MYB转录因子的 体系中；较佳地，该体系含有油菜素甾醇信号通路；(b)观测所述体系中BES1 对MYB转录因子的抑制作用；其中，若所述候选物质降低(较佳地是统计学 上降低；如降低20％以上，较佳地降低50％以上，更佳地降低80％以上)BES1 对MYB转录因子的抑制作用，则表明该候选物质是促进植物体内类黄酮的 合成或提高植物对紫外线的抗性的调节剂；若所述候选物质提高(较佳地是 统计学上提高；如促进20％以上，较佳地提高50％以上，更佳地提高80％ 以上)BES1对MYB转录因子的抑制作用，则表明该候选物质是抑制植物体 内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性的调节剂。

在一个优选例中，所述的MYB转录因子包括MYB11，MYB12， MYB111；和/或(b)中，所述观测所述体系中BES1对MYB转录因子的抑制 作用包括：观测BES1与MYB基因启动子G-box的相互作用(结合作用)。

在另一优选例中，所述的方法还包括设置对照组与测试组，以观测候选 物质在测试组与对照组中的区别。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针油菜素甾醇信 号通路，特别是转录因子BES1，或它们上游或下游蛋白设计的干扰分子、 核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物(如激素)等。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(细胞培养物体系)、亚细 胞体系、溶液体系、植物组织体系、植物器官体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细 胞实验和/或转基因试验，以从候选物质中进一步确定调节植物体内类黄酮 合成或调控植物对紫外线的抗性效果优异的物质。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是 显而易见的。

附图说明

图1a，c，e、拟南芥紫外胁迫表型观察：图中相应基因型的拟南芥种 在长日照白光下生长10天，用broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外 灯管，光强为2W/m2)处理8小时，然后放回白光下恢复生长3天，观察 表型。

图1b，d，f、拟南芥最大光合转化效率Fv/Fm测定：将拟南芥种子 播撒在土中，放长日照白光下生长10天，用broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外灯管，光强为2W/m2)处理5小时，然后第二天用拍摄型荧光 计测量最大光合转化效率Fv/Fm。

图2a、Quantitative RT-PCR：将Col和BES1-RNAi种于土中，持续白 光下生长7天，每天喷一次1μM BR，移到broad band UV-B下3小时， 按图中标注的时间点采集样品，分析PFG MYB基因表达情况。ACT7为内 参，图中标注为三个生物学重复的标准误。

图2b、Quantitative RT-PCR：将Col和bes1-D-OX种于含有1μM BRZ 的1/2MS培养基，持续白光下生长7天，移到broad band UV-B下3小时， 按图中标注的时间点采集样品，分析PFG MYB基因表达情况。ACT7为内 参，图中标注为三个生物学重复的标准误。

图2c、HPLC测定植物类黄酮含量：将相应基因型的拟南芥种于1/2 MS培养基，持续白光条件下生长6天，移至broad band UV-B下处理两 天后各采集0.1g样品，研碎溶解在80％的乙腈溶液中，涡旋后4℃静置过 夜。12 000g离心之后，上清用HPLC/DAD(Agilent1260)对黄酮醇进行定 量。HPLC分析用的是C18柱(2.7×100mm Agilent)，流速为0.8mlmin-1， 洗脱梯度为溶液A[水]，溶液B[甲醇]和溶液D[0.5％甲酸]按照以下的操作 (0到10分钟，溶液B和D分别由20到40％和80到60％，10到15分钟， 溶液B和D分别由40到70％和60到30，15到20分钟，溶液B和D分 别由70到90％和30到10％).DAD用来检测320nm处的紫外吸收。

图2d、DPBA染色反映植物黄酮醇含量：植物生长在持续白光下6 天，移至broadband UV-B下处理1天。将处理后的植物浸泡在含有0.01％ Triton X-100，2.52mg/mL DPBA的乙醇溶液中，摇床上转动1.5小时，后 用去离子水洗净。用荧光显微镜观察激发光为458nm时的荧光强度。用 ImageJ对荧光强度定量。

图3a、EMSA实验：原核表达的BES1蛋白能够在体外结合PFG MYB 启动子。

图3b-d、ChIP实验：植物体内BES1蛋白能够结合PFG MYB启动子。 上部为分析PFGMYB启动子，红色圆球表示G-box，蓝色圆球表示BRRE 元件。下部为ChIP-Q-PCR结果。利用野生型和BES1过表达BES1-Flag 为材料，交联之前用1μM BR处理2小时。用Flag抗体做免疫共沉淀， 用覆盖PFG MYB启动子的引物去做Q-PCR。

图3e、ChIP-Q-PCR：利用野生型和BES1-RNAi为材料，BES1抗体 做免疫共沉淀，用PFG MYB启动子代表性的引物去做Q-PCR。

图3f、ChIP-Q-PCR：利用野生型和BES1过表达BES1-Flag为材料， BES1-Flag分别用BR和BRZ处理，用PFG MYB启动子代表性的引物去 做Q-PCR。

图3g-i、瞬时转录激活实验：g，报告载体和效应载体构建方式。h-i， 将转入报告载体的农杆菌分别与转入效应载体的农杆菌混合，转化烟草， 三天后检测。h图为测量LUC/REN比值，i图为CCD拍摄LUC荧光。

图4a、DPBA染色测定黄酮醇含量：植物生长在持续白光下6天，移 至broad bandUV-B下处理1天。将处理后的植物浸泡在含有0.01％Triton X-100，2.52mg/mL DPBA的乙醇溶液中，摇床上转动1.5小时，后用去 离子水洗净。用荧光显微镜观察激发光为458nm时的荧光强度。用ImageJ 对荧光强度定量。

图4b、拟南芥紫外胁迫表型观察：图中相应基因型的拟南芥种在长日 照白光下生长10天，用broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外灯管， 光强为2W/m2)处理8小时，然后放回白光下恢复生长3天，观察表型。

图4c、拟南芥最大光合转化效率Fv/Fm测定：将拟南芥种子播撒在 土中，放长日照白光下生长10天，用broad band UV-B(Philips TL 40W/12 紫外灯管，光强为2W/m2)处理5小时，然后第二天用拍摄型荧光计测量 最大光合转化效率Fv/Fm。

图5a、Western blot：将野生型拟南芥Col种在持续白光下生长7天， 然后移到broad band UV-B下，按图中时间点采集样品，用BES1抗体或 Actin抗体检测。

图5b、Quantitative RT-PCR：将Col种于土中，持续白光下生长7天， 移到broadband UV-B下8小时，按图中标注的时间点采集样品，分析 BES1基因表达情况。ACT7为内参，图中标注为三个生物学重复的标准误。

图5c-e、荧光素酶拍摄实验：利用BES1启动子驱动表达荧光素酶转 基因材料pBES1:LUC，分别做四种条件光处理：narrow band UV-B(NUV)， broad band UV-B(BUV)，broad band UV-B加ZJB300滤光片，用来截止 小于300nm以下的光线(BUV+ZJB300)，broadband UV-B加ZJB340滤 光片，用来截止小于340nm以下的光线(BUV+ZJB340)。图5c为拍摄pBES1:LUC在四种光照处理下的LUC信号，图5d为四种光照条件对应的 光谱，图5e为图5c中LUC定量值。

图6a、玉米紫外胁迫表型观察：玉米中BR合成突变体na1和相应野 生型在28℃长日照白光下生长8天，用broad band UV-B处理3天，每天 处理2小时，然后放回白光下恢复生长3天，观察表型。

图6b、玉米最大光合转化效率Fv/Fm测定：玉米中BR合成突变体 na1和相应野生型在28℃长日照白光下生长8天，用broad band UV-B处 理12小时，然后第二天用拍摄型荧光计测量最大光合转化效率Fv/Fm。

图6c、水稻紫外胁迫表型观察：水稻中BR受体突变体d61和相应野 生型在28℃长日照白光下生长25天，用broad band UV-B处理12小时， 然后放回白光下恢复生长3天，观察表型。

图6d、水稻最大光合转化效率Fv/Fm测定：水稻中BR受体突变体 d61和相应野生型在28℃长日照白光下生长25天，用broad band UV-B处 理12小时，然后第二天用拍摄型荧光计测量最大光合转化效率Fv/Fm。

具体实施方式

本发明首次研究及揭示了油菜素甾醇(BR)信号通路对植物体内类黄酮 合成以及植物对紫外线的抗性的影响及其分子机制。油菜素甾醇信号通路， 特别是其中的转录因子BES1(BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1)，其能够负调控 MYB转录因子，在此基础上调控植物体内类黄酮合成，并进而调控植物对 紫外线的抗性。

基因、多肽、信号通路及植物

如本文所用，所述的“植物”是适用于进行转基因操作的植物，可以 是双子叶植物、单子叶植物或裸子植物；可以包括农作物、花卉植物或林 业植物等。较佳地，所述的“植物”包括(但不仅限于)：十字花科鼠耳芥 属如拟南芥；禾本科稻属植物如水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科 玉米属植物如玉米等；十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；锦葵科棉属作 物等。

如本文所用，所述的“油菜素甾醇(BR)信号通路”又称为“油菜素甾 醇细胞信号转导途径”，当细胞膜表面受体激酶BRI1感知到油菜素甾醇 (Brassinosteroid，BR)后磷酸化BKI1，磷酸化的BKI1与BRI1解离，BRI1 与BAK1相互作用，相互磷酸化，功能增强。BRI1磷酸化BSKs和CDG， 使其激活。BSKs进而磷酸化并激活BSU1，BSU1使BIN2去磷酸化。去磷 酸化的BIN2功能被抑制，从而使BES1/BZR1去磷酸化。去磷酸化的BES1 是激活形式的，可以向细胞核内富集并结合DNA，激活BR响应基因表达。 进而发生一系列下游事件。其中，BR是一种已知的植物激素。

在本发明中，除非特别说明，所述的油菜素甾醇信号通路的相关多肽 或其编码基因(包括BES1)，MYB转录因子(包括MYB11，MYB12，MYB111) 或其编码基因，与它们相关的上下游多肽或基因，包括：本发明实施例中所 列举的来自特定物种的信号通路、多肽或基因，以及来自其它物种的相应信 号通路、同源多肽或同源基因。例如，所述的BES1指具有SEQID NO:1 序列(CDS序列，Gene ID:838518；AT1G19350.1)编码的多肽，还包括具有 与BES1多肽相同功能的序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)： 若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个， 还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和 /或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内， 更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的BES1多肽同源性高(比如与SEQ IDNO:1所示CDS序列编码的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地 同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％ 或99％)的、且具有BES1多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。来源于 拟南芥以外其它物种的与SEQ ID NO:1所示CDS序列编码的多肽序列的 同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也 包括在本发明中。

应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种的油菜素甾醇信号通 路(包括BES1)以及MYB转录因子，但是获自其它物种的与所述油菜素甾 醇信号通路或所述MYB转录因子高度同源(如具有60％以上，如70％，80％， 85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考 虑的范围之内。

改良植物的方法

本发明揭示了油菜素甾醇信号通路对植物体内类黄酮合成以及植物对 紫外线的抗性的影响及其分子机制在理论研究和植物改良中具有重要的 应用价值。因此，基于本发明人的新发现，本发明提供了一种改良植物的 方法，所述方法包括：调控植物体内油菜素甾醇(BR)信号通路的转录因子 BES1，进而调控(负调控)植物体内类黄酮的合成或植物对紫外线的抗性。或 者，所述方法包括：调控植物体内油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1对 于MYB转录因子的抑制作用(结合)，进而调控(负调控)植物体内类黄酮的合 成或植物对紫外线的抗性。

一方面，本发明提供了一种促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对 紫外线的抗性的方法，包括：降低所述植物中油菜素甾醇信号通路转录因 子BES1的表达(包括使BES1不表达或低表达)或活性；或降低BES1对于 MYB转录因子的抑制作用。

应理解，在得知了所述油菜素甾醇信号通路，特别是转录因子BES1 的用途后，及其与MYB转录因子的相互作用机制后，可以采用本领域人 员熟知的多种方法来调节所述的BES1的表达或调节相互作用的强弱。比 如可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低BES1的表达或使之缺失表 达，比如将携带反义BES1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送 到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达BES1。

作为本发明的一种实施方式，提供了一种降低植物中BES1的表达的 方法，所述的方法包括：(1)将干扰BES1表达的干扰分子转入植物细胞、 组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或 种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官 或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体 的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再 生成植物。例如，在本发明的优选实施例中，提供了一种BES1-RNAi的试 剂方法，可以有效地获得BES1表达被降低的植物。此外，也可以通过敲 除、沉默或基因编辑(如基于CRISPR体系)的方法来将BES1的表达或活 性进行下调。

另一方面，本发明提供了一种降低植物体内类黄酮的合成或降低植物 对紫外线的抗性的方法，包括：提高所述植物中油菜素甾醇信号通路转录 因子BES1的表达(包括使BES1过表达)或活性；或，促进BES1与MYB 转录因子的相互作用。

在得知了所述油菜素甾醇信号通路，特别是转录因子BES1的用途后， 可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的BES1的表达，或者筛 选促进BES1与MYB转录因子相互作用的物质。

应用

本发明中，首次揭示了BR信号通路通过BES1抑制MYB转录因子的 表达，抑制类黄酮的合成，从而负调控紫外胁迫的抗性。并且，首次揭示 了高能量的、低波段的紫外线可以抑制BES1转录，从而解除对类黄酮合 成的抑制，进而增强植物抵抗紫外胁迫。本发明的技术方案有助于分子设 计育种，为培育出既抗紫外胁迫又兼顾产量的优质品种提供理论基础，也可 以应用在药用植物中，改良类黄酮的积累。

根据本发明的揭示，结合本发明人之前的研究以及现有技术，呈现出 了植物的一种新的、兼顾紫外胁迫抗逆以及营养生长的机制：BES1在没 有紫外胁迫时抑制类黄酮积累，促进营养生长；在有紫外胁迫时，BES1转 录被抑制，从而解除对类黄酮合成的抑制，促进植物抵抗紫外胁迫。已知 BES1突变体表现为下胚轴或者株高降低，紫外胁迫抗性增强。已知BES1 作为平衡营养生长和紫外胁迫抗性的连接点，可以用来分子设计育种。

根据本发明的揭示，首先，BES1抑制MYB基因表达，调节类黄酮合成， 这可以应用于药用植物或功能性作物，改良类黄酮的代谢，培育类黄酮含量 富集的品种。其次，抑制BR信号通路能增强植物抵抗紫外胁迫，基于此可 以分子设计育种，培育抗紫外胁迫的品种。第三，低波段、高能量的紫外线 可以特异的抑制BES1的转录，基于此可以设计分子开关，用低波段、高能 量的紫外线启动基因表达。

筛选方法

在得知了油菜素甾醇信号通路，对植物体内类黄酮合成以及植物对紫 外线的抗性的影响及其分子机制以后，可基于该新发现来筛选通过调节该 信号通路，特别是BES1，从而定向调控植物体内类黄酮合成以及植物对紫 外线的抗性的物质或潜在物质。

因此，本发明提供了一种筛选调节植物体内类黄酮合成或调控植物对 紫外线的抗性的调节剂的方法，所述方法包括：以植物体内油菜素甾醇信 号通路转录因子BES1作为筛选的靶点，选出特异性下调(抑制)植物体内油 菜素甾醇信号通路转录因子BES1的物质，所述的物质是促进植物体内类黄 酮的合成或提高植物对紫外线的抗性的调节剂；或者，选出特异性上调(提 高)植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1的物质，所述的物质是抑 制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性的调节剂。

本发明提供了一种筛选调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线 的抗性的调节剂的方法，所述方法包括：以植物体内油菜素甾醇信号通路 转录因子BES1对于MYB转录因子的抑制作用(结合)作为筛选的靶点，选 出特异性下调(抑制)它们这种抑制作用的物质，所述的物质是促进植物体 内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性的调节剂；或者，选出特异性上 调这种抑制作用的物质，所述的物质是抑制植物体内类黄酮的合成或降低 植物对紫外线的抗性的调节剂。

以蛋白或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方 法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可 以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体 片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质 的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采 用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、 噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。

经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于油菜素甾醇信号通路， 特别是BES1，或作用于BES1与MYB转录因子相互作用复合体的、对类 黄酮的合成或代谢有调控作用的潜在物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件 的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指 南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的 条件。

实验材料

1.BES1敲低的BES1-RNAi植株：扩增包含BES1编码区的cDNA，用 酶切连接的方法将BES1cDNA以相反方向连接至pHANNIBAL载体的两个 多克隆位点，再将该载体的启动子及下游表达序列，连接至植物表达载体， 转化野生型拟南芥Col，选取BES1-RNAi转基因材料；

2.BES1功能获得性点突变bes1-D和bes1-D-OX：已知BES1功能获得 性点突变是其编码区第698个核苷酸由C突变为T。用包含该点突变的引物 扩增BES1，克隆bes1-D，然后用BES1内源启动子驱动表达bes1-D，获得 bes1-D转基因植株。用35S启动子驱动表达bes1-D，获得bes1-D-OX转基 因植株。

3.转基因植株BES1-Flag：克隆BES1编码区CDS序列，用35S启动子 驱动表达BES1，并融合Flag标签，转化拟南芥野生型Col，获得 35S-BES1-Flag转基因植株。

4.转基因植株pBES1:LUC：克隆BES1启动子，驱动表达萤火虫荧光 素酶LUC编码基因，转化拟南芥野生型Col，获得pBES1:LUC转基因植株。

5.拟南芥BR合成突变体det2：拟南芥野生型种子Col经过EMS诱变 后，筛选在黑暗下持续光形态建成突变体，命名为det2，然后图位克隆，确 定基因。其det2基因发生突变，进一步可以CRISPR方法再现该突变体。

6.拟南芥BR受体突变体bri1：拟南芥野生型种子Col经过EMS诱变 后，筛选对BR不敏感突变体，命名为bri1，然后图位克隆，确定基因。其 BR受体发生突变，进一步可以CRISPR方法再现该突变体。

7.拟南芥PFG MYB三突变体myb11 myb12 myb111：分别将***PFG MYB的三个T-DNA突变体SALK_077068，myb12-1f，GABI-Kat291D01(该 三个材料购于拟南芥生物资源中心ABRC)杂交聚合，鉴定纯和三突变。

8.玉米BR合成突变体na1购自Maize COOP。

9.水稻BR受体突变体d61：水稻用N-methyl-N-nitrosourea诱变，筛选 矮化突变体，命名为d61，表型分析暗示其为BR信号突变体，进一步分析 发现BR受体基因突变，经过互补验证，证明d61为BR受体突变体。进一 步可以CRISPR方法再现该突变体。

10.uvr8：购自拟南芥生物资源中心ABRC。

实验方法

1.紫外胁迫表型观察

将拟南芥种子播撒在土中，放长日照白光下生长10天，用Broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外灯管，光强为2W/m2)处理8小时，然后放回 白光下恢复生长3天，观察表型。

2.测量植物最大光合转化效率Fv/Fm

将拟南芥种子播撒在土中，放长日照白光下生长10天，用broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外灯管，光强为2W/m2)处理5小时，然后第二 天用拍摄型荧光计测量植物光合参数。

3.HPLC分析

将相应基因型的拟南芥种于1/2MS培养基，持续白光条件下生长6天， 移至broadband UV-B下处理两天后各采集0.1g样品，研碎溶解在80％的乙 腈溶液中，涡旋后4℃静置过夜。12 000g离心之后，上清用 HPLC/DAD(Agilent 1260)对黄酮醇进行定量。HPLC分析用的是C18柱(2.7× 100mm Agilent)，流速为0.8ml min-1，洗脱梯度为溶液A[水]，溶液B[甲醇]和溶液D[0.5％甲酸]按照以下的操作(0到10分钟，溶液B和D分别由 20到40％和80到60％，10到15分钟，溶液B和D分别由40到70％和60 到30，15到20分钟，溶液B和D分别由70到90％和30到10％).DAD用 来检测320nm处的紫外吸收。

4.DPBA染色

植物生长在持续白光下6天，移至broad band UV-B下处理1天。将处 理后的植物浸泡在含有0.01％Triton X-100，2.52mg/mL DPBA的乙醇溶液 中，摇床上转动1.5小时，后用去离子水洗净。用荧光显微镜观察激发光为 458nm时的荧光强度。

5.实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative RT-PCR)

以cDNA作为模板，运用Takara的SYBR Green qPCR mix进行反应， 在MX3000(Stratagene)系统中运行，运行程序为：95℃，30sec；95℃，5sec； 60℃，30sec；过程中进行荧光信号采集，40个循环。Quantitative RT-PCR 结果运用Actin7基因引物为内参，均有两次技术重复及2次以上生物学重 复。

6.染色质免疫共沉淀ChIP

将Pro35S:BES1-Flag以及Col-0野生型种植在长日照的人工气候室， 收集12天左右苗龄的拟南芥幼苗，质量为2g；然后用甲醛固定及交联；提 取细胞核并超声破碎；用结合了Flag抗体的protein A/G agarose beads去免 疫共沉淀蛋白-DNA复合物，旋转孵育过夜；洗脱及解交联；消化蛋白以及 DNA的纯化；定量PCR分析。

7.凝胶阻滞实验(EMSA)

1)利用原核系统表达并纯化BES1蛋白；

2)制备探针：选择PFG MYB启动子包含有G-box的序列，合成互补 的两条寡核苷酸，然后复性形成双链寡核苷酸，连接至T载体(pEASY-blunt， CB111，Transgene)。测序验证目的序列连接正确后，以该质粒为模板，用 Cy5标记的M13正反向引物PCR扩增目的序列，酒精沉淀回收PCR产物即 为标记的探针。用未标记的M13正反向引物PCR扩增目的序列，酒精沉淀 回收后即为冷探针。

3)反应：配制20μL结合缓冲液[25mM HEPES(pH 7.5)，40mM KCl， 3mM DTT，10％甘油，0.1mM EDTA，0.5mg/mL BSA，0.5mg/mL poly-Glutamate]，加入15ng探针和200ng蛋白，于冰上反应30min。

4)检测：取10μL反应产物，直接上样到6％非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳，在4℃条件下电泳，100v恒压1-2h。凝胶中的Cy5标记的探针直接 用Starion FLA-9000(FujiFilm，Japan)检测。

8.瞬时转录激活实验(Dual-LUC实验)

扩增PFG MYB启动子(MYB11基因的Gene ID:825435，其启动子采用 其起始密码子上游2Kb区域；MYB12基因的Gene ID:819359，其启动子采 用其起始密码子上游2Kb区域；MYB111基因的Gene ID:834993，其启动子 采用其起始密码子上游2Kb区域)，通过酶切连接方法连接到pGreenⅡ 0800-LUC报告基因载体中，该载体有35S驱动RENILLA及目的基因启动 子驱动LUC表达。将含有报告载体与效应载体(BES1-Flag或bes1-D-Flag) 的农杆菌混合，共转烟草，三天后检测报告基因的表达情况。使用Promega 公司的双荧光报告系统检测试剂盒，通过化学发光检测系统 luminometer(GloMax 20/20，Promega)进行荧光信号的定量，计算LUC/REN 的比值。或者使用冷CCD直接采集LUC信号。

9.荧光素酶LUC拍照

将转基因植物pBES1:LUC种在1/2MS培养基中，放持续白光下生长7 天，然后移到相应的紫外光下处理8小时，分别收集0小时、2小时、4小 时、8小时的样品，加入2.5mM荧光素底物，用冷CCD采集LUC信号。

实施例1、植物激素油菜素甾醇(BR)负调控紫外胁迫抗性

本实施例中，主要研究BR是否调节植物对紫外胁迫的抗性。本发明人 观察BR合成突变体或者信号转导突变体在紫外胁迫条件下的生理表型。从 图1a中可见BR合成突变体det2、BR受体突变体bri1、BR通路中关键转 录因子BES1突变体BES1-RNAi相比于野生型Col对紫外胁迫抗性增强。紫 外胁迫被报道会损伤光合作用复合体，直接抑制光合作用效率，所以本发明 人测量光系统Ⅱ最大光化学量子产量(Fv/Fm)作为反映植物受胁迫程度的指标。Fv/Fm结果与胁迫表型一致，BR合成或信号转导突变体光合表现好于 野生型Col。与之相反，BES1功能获得性点突变bes1-D在有BRZ(BR合成 抑制剂)的条件下对紫外胁迫更加敏感(图2c-d)。在BR信号通路中，BRI1 作为受体结合BR从而向下游传递信号，BES1位于BRI1下游，直接控制 BR响应基因的表达。为了证明在调控紫外胁迫方面BES1和BRI1在同一信号通路，本发明人在bri1背景下过表达bes1-D；结果显示bri1比Col更加 抵抗紫外胁迫，但是bes1-D-OX/bri1却能抑制bri1抵抗紫外胁迫的表型(图1e-f)，说明BES1在BR受体BRI1下游发挥作用，抑制植物对紫外胁迫的 抵抗能力。

实施例2、BES1通过抑制MYBs基因表达从而抑制黄酮醇的合成

类黄酮的积累是植物抵抗紫外胁迫的重要机制，类黄酮合成途径涉及一 系列酶促反应，包括CHS(chalcone synthase)、CHI(chalcone isomerase)等。 三个MYB转录因子(MYB11，MYB12，MYB111)通过激活黄酮醇合成基因 (CHS，CHI等)的表达从而控制黄酮醇的合成。本发明人用实时定量 PCR(q-RT-PCR)来检测BES1是否调节MYBs基因(MYB11，MYB12，MYB111) 表达，结果发现MYBs在BES1-RNAi中相比于Col被上调，在bes1-D-OX中 被下调(图2a-b)。本发明人进一步用高效液相色谱(HPLC)来检测植物体内的 类黄酮水平，提取出苯丙烷类化合物，用HPLC分析，如图2g，野生型Col 在紫外处理后有清晰的检测峰，这些峰被标记为1-6，分别对应已知的黄酮 醇化合物。本发明人分析了Col，uvr8和BR相关突变体在紫外处理后的黄 酮醇含量。相比于Col，uvr8表现出明显减少的黄酮醇含量，而bri1、det2、BES1-RNAi黄酮醇含量增加(图2c)。本发明人也用DPBA染色来检测黄酮醇 含量。与HPLC结论一致，在紫外胁迫处理后，与Col相比，bri1和BES1-RNAi 中黄酮醇含量增加(图2d)。这些结果表明，BR突变体中MYBs基因表达量 上升，从而促进黄酮醇的积累和紫外胁迫抗性增强。

实施例3、BES1响应BR信号直接结合到MYBs启动子

BES1能够抑制MYBs基因表达从而控制黄酮醇合成，那么BES1能直 接结合MYBs基因启动子吗？于是本发明人就分析MYBs基因启动子(MYB11 启动子序列如Gene ID:825435起始密码子上游2Kb区域、MYB12启动子序 列如Gene ID:819359起始密码子上游2Kb区域、MYB111启动子启动子序 列如Gene ID:834993起始密码子上游2Kb区域)，发现每个MYB基因启动 子都有多个G-box元件，明显多于BRRE元件，这暗示BES1可能结合到 G-box上，从而抑制MYBs转录。为了证明这个假设，本发明人做了凝胶迁 移实验(EMSA)。如图3a，BES1确实可以结合到MYB11、MYB12、MYB111 启动子，而对于突变了G-box的MYB12启动子却无法结合。

为了进一步证明BES1结合MYBs启动子，本发明人做了染色质免疫共 沉淀(ChIP)实验。本发明人先使用超表达的35S-BES1-Flag转基因植株，用 Flag抗体去富集BES1-DNA复合体，然后用覆盖MYBs启动子的引物去定 量检测。如图3b-d，BES1可以结合到MYBs启动子，尤其是包含G-box的 区域。本发明人也用BES1内源抗体去富集野生型材料内的BES1-DNA复合 体。发现内源表达的BES1确实可以结合MYBs启动子(图3e)。根据经典的 BR信号通路，BES1可以响应BR信号而发生去磷酸化反应，去磷酸化的 BES1是有活性的，可以结合到生长相关基因的启动子并激活它们的表达， 那本发明人就猜想BR是否影响BES1结合到MYBs启动子。为了证明这个 猜想，本发明人将35S-BES1-Flag种植在含有BRZ的培养基上，使BES1主 要呈现磷酸化状态；同时把35S-BES1-Flag种植在一般培养基上，在做ChIP 之前用BR处理，使BES1主要呈现去磷酸化状态。用这两种条件处理的植 株做ChIP实验，本发明人发现相比于磷酸化的BES1，去磷酸化的BES1对 MYBs有更强的DNA结合活性，与之类似的，对于BES1已知的生长相关的 靶标基因SAUR-AC，去磷酸化的BES1有更强的DNA结合活性(图3f)。这 些结果说明，BR信号通路的激活能够促进BES1结合到MYBs基因的启动 子。

本发明人做了瞬时转录激活实验来探究BES1对MYBs基因转录的作 用。本发明人构建了Dual-LUC载体：三个MYB基因启动子分别驱动萤火 虫荧光素酶(LUC)表达；持续激活的35S启动子驱动海肾荧光素酶(REN)表 达作为内参。效应载体是用35S启动子驱动表达BES1或bes1-D(图3g)。三 种报告载体分别与效应载体：空载体表达Flag标签、BES1-Flag、bes1-D-Flag 混合，共同侵染烟草叶片。通过用冷CCD直接检测LUC荧光信号(图3h) 或者定量LUC/REN值(图3i)。结果显示，相比于负对照，表达BES1或bes1-D 可以显著抑制MYB基因转录。

实施例4、在调节紫外胁迫过程中，MYBs在BES1下游发挥作用

由于BES1直接控制MYBs基因表达来控制黄酮醇合成途径，所以本发 明人推测MYBs在BES1下游发挥作用，调节紫外胁迫的防御反应。因此 myb11 myb12 myb111三突变体(简称mybt)被用来和BES1-RNAi并观察生理 表型。如图4a，测量紫外条件下的黄酮醇含量，相比于Col，mybt黄酮醇几 乎没有积累；BES1-RNAi黄酮醇含量高于Col；而BES1-RNAi mybt黄酮醇含 量明显少于BES1-RNAi，这说明MYBs处在BES1下游控制黄酮醇合成。与 黄酮醇含量一致，BES1-RNAi mybt表现出对紫外胁迫敏感的表型，抑制了 BES1-RNAi抵抗紫外胁迫的表型(图4b-c)。这些结果证明，MYBs在BES1 信号通路下游发挥作用，调节紫外胁迫的抗性。

实施例5、紫外胁迫抑制BES1表达

既然BES1控制MYB基因表达，从而控制类黄酮的合成和紫外胁迫的 抗性，那么BES1自身是如何被紫外胁迫调控呢？本发明人发现作为紫外胁 迫的broadband UV-B(280-315nm)可以使内源BES1蛋白减少(图5a)，进一 步检测发现BES1的转录水平被broadbandUV-B抑制(图5b)。本发明人构建 了转基因拟南芥pBES1:LUC(BES1内源启动子(Gene ID:838518，起始密码 子上游2Kb序列)驱动表达LUC基因)，用不同类型的紫外光处理，分析BES1 转录本变化(图5c)。本发明人做了四种紫外光处理，并用光谱仪测量相应的 光谱，如图5d：NUV表示narrowband UV-B，波长为311-315nm；BUV表 示broadband UV-B，实验条件下测量光谱为280-340nm；BUV+ZJB300表 示在BUV灯管下添加ZJB300滤光片，用以过滤波长小于300nm的紫外光， 实际测量光谱显示小于300nm的紫外光极少；BUV+ZJB340表示在BUV灯管下添加ZJB340滤光片，用以过滤波长小于340nm的紫外光，实际测量光 谱显示几乎没有紫外光。用这四种光照条件处理转基因植株pBES1:LUC，并 做定量分析，发现只有BUV可以明显抑制pBES1:LUC荧光信号； BUV+ZJB340去除了几乎全部紫外线，对pBES1:LUC荧光信号没有影响； 而311-315nm的NUV或去除小于300nm的BUV+ZJB300对pBES1:LUC 荧光信号也没有显著影响，这表明BUV中波长为280-300nm的紫外线对于 抑制BES1转录发挥关键作用。

实施例6、BR负调控紫外胁迫抗性在作物中是保守的

拟南芥中的实验表明BR负调控紫外胁迫抗性，那么这个规律是否在作 物中保守呢？本发明人观察了玉米中BR合成突变体na1的紫外胁迫表型。 从图6a中可见，相比于野生型，na1的叶片的受胁迫程度好于野生型。检测 最大光合转化效率Fv/Fm来反映胁迫程度，na1的光合表现好于野生型(图 6b)，这都表明玉米中BR合成突变体对紫外胁迫抗性增强。

本发明人还观察了水稻中BR受体突变体d61，发现在紫外胁迫处理后 d61的叶片胁迫程度或者最大光合转化效率好于野生型(图6c-d)，这表明水 稻中BR受体突变体对紫外胁迫抗性增强。这些结果表明，BR负调控植物 对紫外胁迫的抗性在拟南芥和作物中是保守的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇 文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授 内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形 式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用

<130> 184935

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1008

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgacgtctg acggagcaac gtcgacgtca gctgcagctg cagcagcagc gatggcgacg 60

aggaggaaac cgtcgtggag agagagggag aacaatcgga gaagagagcg gcggagaaga 120

gctgttgcgg cgaagattta tactggtctt agagctcaag gtaactacaa tcttccaaaa 180

cattgtgaca acaatgaggt tcttaaggct ctttgttctg aagctggttg ggttgttgaa 240

gaagacggaa ctacttatcg caagggacac aagcctctac ctggtgacat ggctggatca 300

tcttctcgag caactcctta ctcttcccat aaccaaagtc ctctttcttc cacttttgat 360

agccccatct tatcttacca agtcagtcct tcctcttctt cattcccgag tccttctcga 420

gttggtgatc cacacaatat ctccacaatc ttccctttcc tcaggaatgg tggtattcct 480

tcatcgcttc ctccacttag aatctcaaac agtgctcctg tcactccacc agtgtcatcc 540

ccaacttcta gaaaccccaa accattgcct acttgggaat cttttaccaa acaatccatg 600

tccatggctg ctaaacagtc aatgacttct ttgaactacc cgttttatgc ggtgtctgca 660

cctgccagtc ctactcatca tcgccagttc catgctccgg ctactatacc tgaatgtgat 720

gagtctgact cttccactgt tgattctggt cattggataa gctttcaaaa gtttgcacaa 780

caacagccat tctctgcctc tatggtgcca acctcgccta ccttcaatct cgtgaaacct 840

gcaccacagc aattgtctcc aaacacagca gcaatccaag agattggtca aagctccgag 900

tttaagtttg agaacagcca agttaagcca tgggaagggg agaggatcca tgatgtggct 960

atggaggatc tagagctcac gcttggaaat ggtaaagctc atagttga 1008