阅读说明：本技术 基于模拟筛选的Irinotecan作为AIBP抑制剂方面的应用 (Application of Irinotecan as AIBP inhibitor based on simulation screening ) 是由 毛仁芳 范义辉 孙荣 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种基于分子对接与分子动力学模拟筛选的Irinotecan作为AIBP抑制剂方面的应用,用于抑制AIBP与apoA-Ⅰ的相互作用,从而抑制胆固醇从细胞中流出。本发明还提供基于分子对接与分子动力学模拟筛选Irinotecan作为AIBP抑制剂的方法,包括以下步骤：通过同源模拟得到AIBP蛋白结构、ZINC数据库中下载对接用小分子结构数据集、分子对接过程、分子动力学模拟；本发明通过同源模拟获得AIBP的结构,基于老药新用的思路将FDA已认证药物通过分子对接与分子动力学模拟进行虚拟筛选,发现Irinotecan可以稳定的结合在AIBP与apoA-Ⅰ的结合界面；或可抑制胆固醇从细胞中流出,挖掘Irinotecan的新用途。(The invention provides an application of Irinotecan as an AIBP inhibitor based on molecular docking and molecular dynamics simulation screening, which is used for inhibiting the interaction between AIBP and apoA-I so as to inhibit cholesterol from flowing out of cells. The invention also provides a method for screening Irinotecan as an AIBP inhibitor based on molecular docking and molecular dynamics simulation, which comprises the following steps: obtaining an AIBP protein structure through homologous simulation, downloading a small molecular structure data set for docking in a ZINC database, performing molecular docking process and molecular dynamics simulation; the structure of AIBP is obtained through homologous simulation, FDA certified drugs are virtually screened through molecular docking and molecular dynamics simulation based on the new use idea of old drugs, and Irinotecan can be stably combined on the combination interface of AIBP and apoA-I; or can inhibit cholesterol from flowing out of cells, and the new application of Irinotecan is dug.)

基于模拟筛选的Irinotecan作为AIBP抑制剂方面的应用

技术领域

本发明属于医疗研究技术领域，具体涉及基于分子对接与分子动力学模拟筛选的Irinotecan作为AIBP抑制剂方面的应用及模拟筛选方法。

背景技术

载脂蛋白A-1结合蛋白(apo A-1binding protein,AIBP)是一种能与apoA-1结合的分泌蛋白。近年来，大量研究发现，AIBP与心血管疾病发生发展相关。研究证实，缺血性心脏病患者心肌组织中AIBP高表达；AIBP能抑制家族性混合性高血脂症等脂质代谢紊乱疾病的发生发展；深静脉血栓患者血小板内AIBP含量增加，抑制血栓形成；AIBP还可以调节人脐静脉内皮细胞和斑马鱼胚胎胆固醇水平，抑制血管内皮生长因子诱导的血管新生，提示AIBP可能是心血管疾病防治的一个新靶点。

目前，AIBP结合apo A-1发挥其生物功能的具体结构和氨基酸位点尚未阐明。生物信息学研究显示，AIBP蛋白的55-58号氨基酸(VVK)、226-232号氨基酸(EKGN--AGG)、247-251号氨基酸(SATQF)、273-277号氨基酸(LNLPP)可能是其与apoA-1结合的位点，且位于AIBP独特的Yje_N结构域内，提示AIBP蛋白5-58号氨基酸、226-232号氨基酸、247-251号氨基酸、273-277号氨基酸可能是与apo A-1结合，发挥相应生物学效应的重要位点。

虚拟筛选是创新药物研究的新方法和新技术，引起了研究机构和制药公司的高度重视，并且已经成为一种与高通量筛选互补的实用化工具，加入到了创新药物研究的工作流程(pipeline)中；同时老药新用的一个重要优势是老药的安全性已经过临床考验，潜在的并发症和脱靶效应明确。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供基于分子对接与分子动力学模拟筛选的Irinotecan作为AIBP抑制剂方面的应用及模拟筛选方法，以解决背景技术中所提出的问题，干扰胆固醇从细胞内流出过程。

本发明的实施例提供基于分子对接与分子动力学模拟筛选的Irinotecan作为AIBP抑制剂方面的应用。

进一步的，Irinotecan抑制AIBP与apoA-Ⅰ的相互作用。

进一步的，Irinotecan结合于AIBP独特的Yje_N结构域，抑制AIBP与apoA-Ⅰ的相互作用，进而抑制胆固醇从细胞内流出。

本发明的实施例还一种基于分子对接与分子动力学模拟筛选Irinotecan作为AIBP抑制剂的方法，其特征在于，包括如下过程：

(1)通过同源模拟得到AIBP蛋白结构

通过在线数据库uniprot获得人源AIBP序列，将序列导入在线同源模拟工具SWISSMODEL进行同源模拟获得AIBP结构；

(2)ZINC数据库中下载对接用小分子结构数据集；

(3)分子对接过程：

(3-1)结合PDB结构中的序列信息及文献报道的AIBP与apoA-I的结合位点，确定用于分子对接的位点是VVKEKGNAGGSATQFLNLPP；

(3-2)在UCSF chimera中只保留关键氨基酸残基，保存为mol2文件后，代替sphere_selctor rec.sph lig_charged.mol₂ 6.0中的配体mol2文件。

(3-3)在受体准备过程中，AIBP蛋白通过UCSF Chimera软件进行H原子和标准电荷的添加；对接过程包括：第一步、基于gird算法的打分，grid打分允许配体根据受体结合口袋的结构对配体做结构改变；第二步、使用Amber打分算法，Amber打分允许蛋白受体根据配体的结构产生变化；

(3-4)对上述两种打分结果中打分最低的前100的小分子进行了交集处理；

(3-5)Grid score和amber score交集重复的小分子共有20个，由于存在同分异构体，一个ZINC ID可能对应不同的小分子，20个交集ZINC ID实际对应的小分子数为50个；

(3-6)根据小分子结合位置的不同，对小分子进行分类，再进行如下标准的筛选：a.删除没有结合在非关键氨基酸附近位点的小分子；b.删除供货信息不全的小分子；得到的小分子进行分子动力学模拟；

(4)分子动力学模拟：

(4-1)使用GROMACS软件包进行MD模拟；使用程序pdb2gmx将蛋白质PDB结构文件转化为拓扑文件，同时，在AMBER99SB力场下使用TIP3P水模型处理受体PDB文件，GeneralAmber force field参数用于处理选定的配体，再使用parmchk程序来检查缺少的力场参数并生成额外的力场参数文件；为获得配体的参数文件和拓扑文件，采用了AnteChamberPYthon Parser interfacE工具；

(4-2)将模拟过程限定在6面体的盒子中，蛋白质与盒子边缘的最小距离为0.1nm；再通过添加简单点电荷水分子将这个盒子进行溶解；加入了0.15M浓度的NaCl以模拟生理状态下溶剂的浓度，使该系统达到中性；

(4-3)以每一步相同的方式优化整个系统的能量；在蛋白和配***置限定的情况下分别进行100ps NVT和100ps NPT平衡；最后以每步0.002ps的时间间隔进行50ns的模拟过程，整个模拟过程是在固定压力为1bar和温度为300K下进行的；在MD模拟的过程中，所有的键长通过LINCS算法计算，远距离的静电相互作用通过Particle Mesh Ewald方法计算；

(4-4)对MD模拟轨迹文件的分析：通过GROMACS软件包中的g_rmsd程序进行均方根偏差分析；对每个受体-配体结合体系的50ns轨迹进行RMSD分析；

(4-5)使用LIGPLOT⁺软件分析了AIBP结合系统中预先鉴定的关键残基之间的吸引力，该程序使用LIGPLOT算法将在MD模拟过程中生成的3D蛋白-配体复合物压平成2D图；

(4-6)通过上述步骤分析发现Irinotecan可以结合在AIBP与apoA-1结合界面，且Irinotecan与Glu226在结合口袋外形成氢键，从而提高了Irinotecan与AIBP的结合亲和力。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明通过同源模拟获得AIBP的结构，基于老药新用的思路将FDA已认证药物通过分子对接与分子动力学模拟进行虚拟筛选，发现模拟筛选的Irinotecan可以稳定的结合在AIBP与apoA-Ⅰ的结合界面；或可抑制胆固醇从细胞中流出，挖掘Irinotecan的新用途。本发明不仅为AIBP靶向抑制剂的快速开发提供了新的范例，而且还为Irinotecan作为脂质代谢药物提供了新的角度。

附图说明

图1为本发明中同源模拟AIBP的结构示意图；

图2为本发明中AIBP与apoA-Ⅰ相互作用氨基酸位置示意图；

图3为本发明中Grid score和Amber score排序小分子交集结果的示意图；

图4为本发明中根据结合位置将50个小分子分为11类的示意图；

图5为AIBP蛋白在50ns的MD过程中RMSD稳定性的示意图；

图6为18种小分子在50ns的MD过程中RMSD稳定性的示意图；

图7为18种小分子RMSD最大值比较的示意图；

图8为18种小分子关键氨基酸相互作用个数比较的示意图。

图9为Irinotecan结合在AIBP与apoA-Ⅰ结合界面的2D和3D示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明提供基于分子对接与分子动力学模拟筛选的Irinotecan作为AIBP抑制剂方面的应用。其中，Irinotecan抑制AIBP与apoA-Ⅰ的相互作用。

进一步的，一种基于虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟筛选AIBP抑制剂的应用，模拟筛选的Irinotecan结合于AIBP独特的Yje_N结构域，抑制AIBP与apoA-Ⅰ的相互作用，进而抑制胆固醇从细胞内流出。

将Irinotecan预测为AIBP与apoA-Ⅰ相互作用抑制剂是基于分子对接与分子动力学模拟发现Irinotecan能够结合在AIBP与apoA-Ⅰ相互作用界面。

本发明的实施例还一种基于分子对接与分子动力学模拟筛选Irinotecan作为AIBP抑制剂的方法，包括如下过程：

(1)通过同源模拟得到AIBP蛋白结构

通过在线数据库uniprot获得人源AIBP序列，将序列导入在线同源模拟工具SWISSMODEL进行同源模拟获得AIBP同源结构

(2)ZINC数据库(http://zinc.docking.org/)中下载对接用小分子结构数据集：DrugBank-approved,pH 6～8.

(3)分子对接过程

(3-1)结合PDB结构中的序列信息及文献报道的AIBP-apoA-I的结合位点，确定用于分子对接的位点是VVKEKGNAGGSATQFLNLPP.

(3-2)在chimera中只保留文献报道的关键氨基酸残基，保存为mol2文件后，代替sphere_selctor rec.sph lig_charged.mol2 6.0中的配体mol2文件。

(3-3)在受体准备过程中AIBP蛋白通过UCSF Chimera软件(version 1.11.2)进行H原子和标准电荷的添加。对接的第一步是基于gird算法的打分，grid打分允许配体根据受体结合口袋的结构对配体做结构改变。第二步使用Amber打分算法，Amber打分允许蛋白受体根据配体的结构产生变化。

(3-4)为了进一步提高对接结果的准确性，本发明对上述两种打分结果(Gridscore，Amber score)中打分最低的前100的小分子进行了交集处理。

(3-5)Grid score和amber score交集重复的小分子共有20个，但是由于存在同分异构体(ZINC根据分子对接的要求，对这些化合物进行了预处理，对应生理pH值生成各种可能的同分异构体)，一个ZINC ID可能对应不同的小分子，20个交集ZINC ID实际对应的小分子数为50个。

(3-6)根据小分子结合位置的不同，将小分子进行分类，在进行如下标准的筛选：a.删除没有结合在非关键氨基酸附近位点的小分子；b.删除供货信息不全的小分子。得到的小分子进行分子动力学模拟。

(4)分子动力学模拟：

(4-1)使用GROMACS软件包(版本4.5)进行MD模拟。本发明使用程序pdb2gmx将蛋白质PDB结构文件转化为拓扑文件，同时在AMBER99SB力场下使用TIP3P水模型处理受体PDB文件。General Amber force field(GAFF)参数用于处理选定的配体，之后使用parmchk程序来检查缺少的力场参数并生成额外的力场参数文件。为了获得配体的参数文件和拓扑文件，本发明采用了AnteChamber PYthon Parser interfacE(ACPYPE)工具。

(4-2)本发明将模拟过程限定在6面体的盒子中，蛋白质与盒子边缘的最小距离为0.1nm。之后通过添加简单点电荷水分子将这个盒子进行溶解。为了使该系统达到中性，本发明加入了0.15M浓度的NaCl以模拟生理状态下溶剂的浓度。

(4-3)以每一步相同的方式优化整个系统的能量。在蛋白和配***置限定的情况下分别进行100ps NVT(固定的粒子数，体积和温度)和100ps NPT(固定的粒子数，压力和温度)平衡。最后以每步0.002ps的时间间隔进行50ns的模拟过程，整个模拟过程是在固定的压力(1bar)和温度(300K)下进行的。在MD模拟的过程中，所有的键长通过LINCS算法计算，远距离的静电相互作用通过Particle Mesh Ewald(PME)方法计算。

(4-4)对MD模拟轨迹文件的分析:通过GROMACS软件包(版本4.6.7)中的g_rmsd程序进行均方根偏差(RMSD)分析。对每个受体-配体结合体系的50ns轨迹进行RMSD分析。

(4-5)使用LIGPLOT⁺软件(版本1.4.5)分析了AIBP结合系统中预先鉴定的关键残基之间的吸引力(氢键和疏水相互作用)，该程序使用LIGPLOT算法将在MD模拟过程中生成的3D蛋白-配体复合物压平成2D图；

(4-6)通过上述步骤分析发现Irinotecan可以结合在AIBP与apoA-1结合界面，且Irinotecan与Glu226在结合口袋外形成氢键，从而提高了Irinotecan与AIBP的结合亲和力。

具体的，本发明通过分子对接的两步打分，分别得到Grid score和Amber score排名前100的小分子，Grid score和amber score交集重复的小分子共有20个，但是，由于存在同分异构体(ZINC根据分子对接的要求，对这些化合物进行了预处理，对应生理pH值生成各种可能的同分异构体)，一个ZINC ID可能对应不同的小分子。根据统计结果，20个重复的ZINC ID实际对应的小分子数为50个。

在分子动力学模拟过程中，首先删除没有结合在非关键氨基酸附近位点的小分子，然后删除供货信息不全的小分子，最后确定18种小分子进行分子动力学模拟。

本发明经过对18种结合体系MD轨迹文件RMSD的分析，发现在18种结合体系中，AIBP蛋白都能够保持稳定的结构，而18种候选小分子中只有11种小分子能够在结合口袋中维持稳定。结合对小分子相互作用关键氨基酸的统计，得到7种相互作用氨基酸大于2的小分子化合物作为潜在AIBP抑制剂。其中小分子ZINC01612996(Irinotecan)的相互作用氨基酸有4个，在MD过程中稳定性也比较高(最大RMSD值<0.3nm)，可以作为AIBP抑制剂候选化合物。

本发明的原理为：生物信息学研究显示，AIBP蛋白的55-58号氨基酸(VVK)、226-232号氨基酸(EKGN--AGG)、247-251号氨基酸(SATQF)、273-277号氨基酸(LNLPP)可能是其与apoA-1结合的位点，且位于AIBP独特的Yje_N结构域内，提示AIBP蛋白5-58号氨基酸、226-232号氨基酸、247-251号氨基酸、273-277号氨基酸可能是与apoA-Ⅰ结合，发挥相应生物学效应的重要位点。因此通过分子对接与分子动力学模拟筛选已知药物作为AIBP与apoA-Ⅰ结合抑制剂，从而干扰胆固醇流出。

本发明通过在线同源模拟工具SWISSMODEL建立AIBP结构模型(如图1所示)，结合PDB结构中的序列信息及文献报道的AIBP-apoA-I的结合位点，确定用于分子对接的位点是VVKEKGNAGGSATQFLNLPP(如图2所示)。

为了加速AIBP抑制剂的应用，本发明采用了老药新用的策略从drugbank数据库中的2748个小分子中筛选潜在的AIBP抑制剂。在对接程序中，对接的第一步是基于gird算法的打分，grid打分允许配体根据受体结合口袋的结构对配体做结构改变。第二步使用Amber打分算法，Amber打分允许蛋白受体根据配体的结构产生变化。经过上述提及的两步对接过程后，分别筛选Grid score与Amber score前100的小分子。为了从以上小分子中选择靶向AIBP最优的配体，本发明将两种打分前100的小分子进行交集处理，Grid score和amberscore交集重复的小分子共有20个(如图3所示)，但是由于存在同分异构体(ZINC根据分子对接的要求，对这些化合物进行了预处理，对应生理pH值生成各种可能的同分异构体)，一个ZINC ID可能对应不同的小分子。根据统计结果，20个重复的ZINC ID实际对应的小分子数为50个。

在UCSF软件中，本发明分别打开AIBP蛋白与上述步骤中得到的50个小分子，根据小分子结合位置的不同可将50个小分子分为11类(如图4所示)，之后本发明删除了没有结合在非关键氨基酸附近位点的小分子。为了便于进一步的实验验证，又删除了无法商业购买的小分子，最终得到18种小分子进行分子动力学模拟的统计数据，见表1。

表1为用于分子动力学模拟(MD)的18种小分子统计表；

在MD模拟过程中，本发明计算了18种蛋白-配体结合模型在MD模拟过程中各自相对于X-ray结构的主链RMSD值来评估它们的结构稳定性。表明，在50ns的模拟过程中，AIBP的18种蛋白质-配体结合体系在MD模拟过程中都受体能够保持稳定(如图5)所示，它们的RMSD平均波动值分别列在表2中。

表2为18种结合体系中AIBP蛋白的平均RMSD值统计表

本发明进一步分析18种结合体系中配体的波动，(如图6所示)表明11种化合物能够在50ns的模拟过程中维持稳定，他们的RMSD值都小于0.3nm(如图7所示)。统计相互作用氨基酸(关键氨基酸)的个数，发现有7种小分子的相互作用关键氨基酸个数≥2(如图8所示)。

更进一步的，本发明通过ligplot+软件分析这11种化合物的结合特征，发现Irinotecan可以很好地结合在AIBP与apoA-1结合界面(如图9所示)。此外，Irinotecan与Glu226在结合口袋外形成氢键(如图9所示)，从而提高了Irinotecan与AIBP的结合亲和力。因此，Irinotecan有可能成为一种新的靶向AIBP的激动剂。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。