阅读说明：本技术 春桑叶在制备抗衰老药物中的应用 (Application of spring mulberry leaf in preparing anti-aging medicine ) 是由 支德娟 赵成木 王欣 李洋 于 2019-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,具体涉及春桑叶在制备抗衰老药物中的应用。本发明发现春初采摘的春桑,能够显著提高早衰模型动物的寿命,延缓其衰老进程,能够被用于制备抗衰老药物和线粒体功能紊乱相关的疾病。(The invention belongs to the field of medicines, and particularly relates to application of spring mulberry leaves in preparation of an anti-aging medicine. According to the invention, the mulberry leaves picked in early spring can obviously prolong the service life of the premature senility model animal and delay the aging process, and can be used for preparing anti-aging medicaments and diseases related to mitochondrial dysfunction.)

春桑叶在制备抗衰老药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及春桑叶在制备抗衰老药物中的应用。

背景技术

衰老是生命的自然过程，随着年龄的增加，生物体机能减退，内环境稳定能力和应激能力下降。衰老机体内细胞、组织、器官在结构与功能上常表现出种种退化，并伴随糖尿病、神经退行性疾病、癌症等与衰老相关疾病的产生，导致生存质量下降，并给家庭和社会带来沉重负担(Collins et al.,2006；Muller et al., 2007)。

21世纪是人口老龄化的世纪，人口老龄化已带来一系列非常严重的医学和社会问题。面对庞大的老年群体，要从根本上提高他们的生存质量，就要找到改善身体机能、延缓衰老的方法，使他们能够健康衰老。这一目的激发着现代科学家进行抗衰老药物的筛选。

中药在我国至今已有5000多年的应用历史(Yu et al.,2010)。中药曾经也正在为提升老年人生存质量，促进人类健康衰老发挥着作用。桑叶来源于桑科植物桑Morus albaL.的干燥叶。一般人们将桑叶分为春桑，霜桑和介于两者之间采摘的桑叶。春桑大多用来食用，春桑采摘后大多用来养殖蚕，而霜桑为初霜后采收入药。霜桑采摘后除去杂质，晒干而得，是一种发散风热药，既可内服，也可外敷。它味甘、苦，性寒，归肺、肝经，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目之功。目前，已从霜桑中分离提取黄酮、多酚、生物碱、多糖等有效成份，具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血压、降血脂，提高免疫力、抗衰老、维持消化系统和***系统健康、抗肿瘤等多种药理学活性，成为研制桑叶茶、桑叶汁饮料、桑叶面条、桑叶粉末等功能性食品的原料。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)在国外被用于寿命分析，至今已有30年的历程(Johnson and Wood,1982)。它是良好的衰老和抗衰老研究模式生物。它廉价、易培养；世代周期短、后代数目多，同时可获得大量背景一致的个体，保证实验重复性和采用大样本量进行实验，从而排除个体差异的影响；与高等生物在基因和分子通路方面保守(蔡外娇等，2008)；线虫一生经历如同人类一样的衰老过程，它的肠内脂褐素逐渐堆积，肌肉运动能力逐渐失去，生殖能力逐渐丧失，直到死亡(Vayndorf,2009)。因此，线虫成为衰老研究的首选模式生物(Johnson,2008)。在国内，线虫也被越来越多地应用于抗衰老中药的研究和开发(蔡外娇等，2008；韩洪杰等，2011；汪晓燕等，2010；叶侃等；2011)。

本发明提供了一种春桑叶在制备抗衰老和治疗线粒体紊乱相关疾病药物中的应用。大量文献记载显示，虽然桑叶经霜后为霜桑，霜桑入药为最佳。意想不到的是，相对于霜桑叶，春初采摘的春桑叶具有更显著的抗衰老效果，尤其适用于制备延缓早衰药物。

参考文献

蔡外娇,张新民,黄建华,沈自尹.2008.淫羊霍总黄酮延缓秀丽隐杆线虫衰老的实验研究.中国中西医结合杂志28:522-525.

韩洪杰,王昌禄,陈勉华,李风娟,王玉荣,韩晓梅,梁宁.2011.槲皮素对线虫抗衰老的影响及其机制的初步研究.氨基酸和生物资源33:35-38.

汪晓燕,王香明,王丹巧,李连达,牛晓红.2010.川芎提取物对线虫寿命的影响及分子机制研究.中国中药杂志35:1042-1045.

叶侃,季晨博,郭锡熔,古桂雄.2011.白藜芦醇对60Coγ射线照射线虫寿命和生殖的影响.辐射防护31:162-167.

张强，孙长波，张晶.桑叶中多糖和总黄酮的含量测定.吉林农业，2011(3):73-74.

Johnson T.E.,Wood W.B.Genetic analysis of life-span in Caenorhabditiselegans.PNAS 79:6603-6607,1982.

Johnson T.E.,de Castro E.,Hegi de Castro S.,Cypser J.,Henderson S.,Tedesco P.Relationship between increased longevity and stress resistance asassessed through gerontogene mutations in Caenorhabditis elegans.Exp Gerontol36:1609-1617,2001.

Johnson T.E.Caenorhabditis elegans 2007:The premier model for thestudy of aging.Exp Gerontol 43:1-4,2008.

Muller F.L.,Lustgarten M.S.,Jang Y.,Richardson A.,Van Remmen H.Trendsin oxidative aging theories.Free Radic Biol Med 43: 477-503,2007.

Vayndorf E.Characterization of the antiaging effects of applephytochemicals using the C.elegans model.Theses and Dissertations. CornellUniversity.pp37,2009.

Yu Y.,Dosanjh L.,Lao L.,Tan M.,Shim B.S.,Luo Y.Cinnamomum cassia Barkin two herbal formulas increase life span in Carnohabditis elegans viainsulin signaling and stress response pathways.Plos One 5:e9339.doi:10.1371/journal.pone.0009339, 2010.

发明内容

本发明目的是提供了一种春桑叶在制备抗衰老药物中的应用。

所述春桑叶为春初采摘的春桑叶。

本发明的另一个目的是提供一种春桑叶在制备延缓早衰药物中的应用，所述春桑是指春初采摘的桑叶。

本发明的另一个目的是提供一种春桑叶在制备治疗线粒体功能紊乱相关疾病药物中的应用，所述春桑是指春初采摘的桑叶。

本发明所述的春桑叶的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、糖浆剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、合剂或滴丸剂中的一种。

本发明以秀丽隐杆线虫作为模式生物进行实验，秀丽隐杆线虫分别为线粒体呼吸链复合体II大亚基 mev-1突变体，线粒体呼吸链复合体III铁硫蛋白isp-1突变体和N2野生型线虫，采不同桑产品水提取物处理受试秀丽隐杆线虫。结果表明：桑叶水提取物对线粒体功能紊乱早衰秀丽隐杆线虫具有显著的治疗作用，且倾向于延长线粒体功能紊乱的长寿线虫的寿命。但是，不影响N2野生型线虫的寿命。同时，桑叶水提取物显著提高早衰线虫的运动能力，且不影响其繁殖。上述结果提示桑叶水提取物不仅具有延缓早衰的潜力，而且具有治疗线粒体功能紊乱相关疾病的潜力。令人意想不到的是，相较于惯常入药的霜桑叶，春桑叶的延缓衰老效果更为显著。

下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

附图说明

图1不同桑叶水提取物对mev-1早衰秀丽隐杆线虫寿命的影响

图2不同桑叶水提取物对isp-1长寿秀丽隐杆线虫寿命的影响

图3不同桑叶水提取物对N2正常野生型秀丽隐杆线虫寿命的影响

具体实施方式

实施例一桑叶水提取物对早衰mev-1突变体线虫寿命的影响

1.生物材料

TK22株系秀丽隐杆线虫：该株系线虫为线粒体呼吸链复合体II大亚基mev-1突变体，这种线粒体功能紊乱线虫体内具过高水平的活性氧，产生氧化胁迫致线虫早衰，线虫寿命缩短，运动、繁殖力，摄食等健康衰老指标下降。具抗衰老活性的受试药物可显著延长早衰线虫的寿命，并且可提升其运动能力，不影响繁殖力，不改变摄食。

大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)，作为秀丽隐杆线虫的食物。

2.试剂

(1)固体NGM(Nematode Growth Medium)培养基成分与制作(以1升为例)：

成分	含量
		NaCl	3.00g
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	2.34g
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	17.23g
蛋白胨	2.50g
		琼脂	17.00g
补充H<sub>2</sub>O至	1000mL

固体NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5mg/mL胆固醇1mL，1M MgSO₄ 1mL,1M CaCl₂ 1mL摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20mL/板。静置等待培养基凝固，备用。

(2)M9液配方

成分	含量
		Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	6.00g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	3.00g
		NaCl	5.00g
1M MgSO<sub>4</sub>	1.00mL
		补充H<sub>2</sub>O至	1000mL

(3)裂解液的配制：6.4％NaClO溶液和1M NaOH溶液按体积比1:1混合。

3.配制含有桑叶水提取物的NGM平板

桑叶水提取物的制备：4g桑叶加25mL沸水，浸泡30min，滤纸过滤得10mL桑叶水提取物。

用于本实验的桑叶为南充尚好桑茶有限公司提供，包括：春初采摘桑叶为春桑；春天采过后再行采摘的桑叶，干燥，粉碎得桑粉；初霜后采摘的桑叶为霜桑。

桑叶总黄酮含量采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定法测定(张强等，2011)，略改动。配制0.3mg/ml的芦丁标准溶液，取标准品溶液0、1、2、3、4、5、6mL，分别置于25mL量瓶中，加水至6mL，加5％亚硝酸钠1mL，放置6min后，加10％硝酸铝1mL，放置6min，加入1mol/L氢氧化钠10mL，以甲醇定容至 25mL，摇匀，静置15min，以不加标准溶液的相应溶液为空白，在波长505nm处测定吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

称取5g供试品，置索氏提取器中，加甲醇100mL，于恒温水浴锅上90℃提取3h，过滤定容于100ml 量瓶中，得供试品溶液。取供试品1mL，按相同条件测定吸光度，代入标准曲线计算得到提取液总酚质量浓度，桑叶中总黄酮含量以干物质计，以芦丁mg/g干重表示。我们建立标准曲线y＝0.0893x+5E-05，R²＝0.9998，桑产品黄酮含量见表1。

表1供试桑产品样品总黄酮含量

配置含有受试桑叶水提取物的NGM平板：

取上述各种桑叶水提取物，分别加入NGM培养基中，倒板。

含受试物的NGM板中桑叶水提取物的终浓度均为10倍稀释，静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。

4.实施步骤

(1)线虫的培养：

将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后置于16℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。

(2)线虫同步化：

挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的NGM培养基，用M9液将线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于1.5mL离心管中，用M9溶液洗线虫卵三次。

(3)桑叶水提取物对早衰秀丽隐杆线虫寿命的影响

将同步化后分装于离心管中的线虫卵转移到涂布有OP50的NGM培养皿，20℃培养至L4期，转移至含有不同桑叶水提取物的NGM培养皿，空白对照为仅涂布有OP50的NGM培养皿。每个培养皿转接30 条线虫，每种受试桑叶水提取物转接三个培养皿作为平行，20℃继续培养，每天探试线虫，直至所有线虫死亡。在繁殖期内，隔日将线虫转移至相应含不同桑叶水提取物的NGM培养皿上，以避免世代交叠。

实验结果：与空白对照组相比，春桑和霜桑显著延长了早衰线虫的寿命(p<0.05)，春桑比霜桑具有更为显著的延缓早衰效果，桑粉对早衰线虫的寿命无影响(p>0.05)。

实施例二桑叶水提取物对isp-1突变体秀丽隐杆线虫寿命的影响

生物材料：

MQ887株系秀丽隐杆线虫：该株系线虫为线粒体呼吸链复合体III铁硫蛋白isp-1突变体，这种线粒体功能紊乱线虫体内具低水平的活性氧，表现为长寿表型。

本实施例以线粒体呼吸链复合体III铁硫蛋白isp-1突变体长寿线虫为受试对象，其它操作同实施例一。该线虫株系表现为氧消耗量降低，对活性氧的敏感性下降、寿命延长。研究表明，isp-1基因突变线虫体内，线粒体活性氧超氧阴离子水平升高是导致isp-1突变体延寿的原因。

实验结果：与空白对照组相比，春桑和霜桑均倾向于延长长寿线虫的寿命(p＝0.056)，春桑比霜桑效果显著(p<0.05)，桑粉对早衰线虫的寿命无影响(p>0.05)。

实验结果显示，相对于空白对照组，春桑和霜桑可分别促使mev-1突变体线虫的运动、繁殖力、抗热胁迫能力显著提高，且春桑叶药效优于霜桑(p<0.05)。

实施例三桑叶水提取物对N2野生型秀丽隐杆线虫寿命的影响

生物材料：N2株系秀丽隐杆线虫为野生型表型。

本实施例以野生型正常线虫为受试对象，其它实验操作同实施例一。由于野生型线虫在繁殖期内较少发生死亡，故本实验从7日龄成虫时，开始每日探视线虫并记录死活情况。

本实施例考察了受试桑产品对正常线虫寿命的影响，图3实验结果表明，受试桑叶水提取物均不影响野生型正常线虫的寿命(p>0.05)。我们推测，这可能是由于野生型正常线虫对于受试物干预具有较强的平衡能力的原因。

本发明实施例中结果表明：

1.从供试桑产品总黄酮含量测定结果可以看出，春桑、桑粉、霜桑的总黄酮含量存在显著差异，因此可以得出春桑，霜桑不是相同的药材。

2.通常黄酮被认为是桑叶的主要抗衰老活性成分，本发明测定结果显示，霜桑中黄酮含量最高，桑粉次之，春桑最低，但春桑延缓早衰的效果最好，霜桑次之，桑粉无效。主流学说认为桑叶中的黄酮含量是其具有抗氧化效果的决定因素，因此黄酮含量越高，其抗氧化效果越强；另一方面，过氧化环境与衰老密切相关，抗氧化能力与抗衰老能力呈正相关。但是，本发明的实验结论与主流学说观点明显不同，实验结果显示黄酮并非是决定桑叶抗衰老作用的关键成分。

3.桑叶具有延缓衰老的作用，且春桑叶相对于霜桑叶效果更好。