阅读说明：本技术 含蛋白质胶原基骨修复材料 (Bone repair material containing protein collagen base ) 是由 张正男 段书霞 韩涵 付迎坤 孙海鹏 石沛龙 崔彬彬 邵蕊娜 韩修恒 田崇 周静 于 2019-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含蛋白质胶原基骨修复材料,包括介孔羟基磷灰石、改性麦饭石、聚乳酸乙醇酸共聚物、Ⅰ型胶原构成的骨修复材料主体以及氧化石墨烯-聚吡咯自组装层和固载于自组装层的骨形态发生蛋白-2。本发明所用原料均无毒无害,具有良好的生物相容性,机械性能优异,材料的降解速度与骨缺损修复速度相对一致,具有较强的成骨活性,形成了骨形态发生蛋白-2可控释放体系,不会发生突释或无法释放的情况,提高了骨形态发生蛋白-2的利用率,同时也极大地避免骨形态发生蛋白-2浓度过高引发的并发症。(The invention discloses a collagen-based bone repair material containing protein, which comprises a bone repair material main body consisting of mesoporous hydroxyapatite, modified medical stone, polylactic acid-glycolic acid copolymer and collagen I, a graphene oxide-polypyrrole self-assembly layer and bone morphogenetic protein-2 immobilized on the self-assembly layer. The raw materials used in the invention are nontoxic and harmless, have good biocompatibility and excellent mechanical property, the degradation speed of the materials is relatively consistent with the bone defect repair speed, and the materials have strong osteogenic activity, form a bone morphogenetic protein-2 controllable release system, do not generate the condition of burst release or incapability of release, improve the utilization rate of the bone morphogenetic protein-2, and simultaneously greatly avoid complications caused by overhigh concentration of the bone morphogenetic protein-2.)

含蛋白质胶原基骨修复材料

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及含蛋白质胶原基骨修复材料。

背景技术

理想的骨修复材料应该具有良好的生物相容性、可降解性、骨传导性和骨诱导性。天然骨主要由磷灰石和胶原组成。因此，由羟基磷灰石和胶原组成的骨修复材料研究广泛。

羟基磷灰石由于其良好的生物相容性及骨诱导作用而被广泛应用于生物复合材料中。但是，其本身容易聚集，与聚合物之间相容性差，会导致复合材料的力学性能和生物学性能下降。现有的羟基磷灰石表面改性方法有偶联剂、酯化反应和接枝聚合物，这些方法虽然能够增强羟基磷灰石与有机体系的相容性，但是由于羟基磷灰石表面被有机物覆盖，其在移植早期的骨传导性能受到影响。因而，研究既能增强材料的机械强度，又能充分发挥羟基磷灰石的骨传导性能的骨修复材料具有重要意义。

在已知的生长因子中，骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein2，BMP-2)的成骨作用最强。已有的研究证实BMP-2对成骨细胞、软骨细胞的分化及功能具有重要的调节作用，能跨种诱导未分化间充质干细胞向成骨细胞方向增殖和分化，促进成骨，使成纤维细胞具有成骨表型。然而，BMP-2在体液中扩散快速，半衰期短，容易酶解，治疗浓度降低快，不能持续刺激靶细胞以充分发挥其诱导活性。而通过提高BMP-2的使用剂量来促进成骨，则会因为剂量太高产生一系列并发症，可能导致组织肿胀、产生炎症，促进不期望的异位骨生成，还可在骨痂内形成囊肿样病变。所以，单纯将BMP-2与基质材料复合所得到的骨修复材料，孔隙率不确定，BMP-2的浓度及释放时间也不可控，修复效果不理想。所以，目前的研究热点是将BMP-2与载体结合，建立稳定的BMP-2释放系统，减少BMP-2的释放以维持植入位点局部浓度，降低并发症的发生率，使BMP-2能够发挥更大的作用。

因此迫切需要研发出机械性能优异、能够可控释放骨形态发生蛋白-2、降低并发症发生率、修复效果理想的骨修复材料。

发明内容

本发明提供一种机械性能优异、能够规律释放骨形态发生蛋白-2、降低并发症发生率、修复效果理想的含蛋白质胶原基骨修复材料。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种含蛋白质胶原基骨修复材料，包括介孔羟基磷灰石、改性麦饭石、聚乳酸乙醇酸共聚物、Ⅰ型胶原构成的骨修复材料主体以及氧化石墨烯-聚吡咯自组装层和固载于自组装层的骨形态发生蛋白-2。

进一步地，所述介孔羟基磷灰石的合成步骤如下：室温条件下，分别将十烷基三甲基溴化铵(CTAB)和氨水加入去离子水中，搅拌至完全溶解，得到溶液1；另配制磷酸氢二钠水溶液，即溶液2；然后将溶液2加入到溶液1中得混合液，搅拌后，将混合液转移到水热反应器中，程序升温至反应温度后保持24h，自然冷却、离心、洗涤沉淀物，用丙酮重新分散，回流除去CTAB、真空干燥，得到介孔羟基磷灰石(HA)。

进一步地，所述介孔羟基磷灰石为纳米棒状，长度为200-300nm，宽度为25-35nm。

进一步地，所述改性麦饭石的制备方法包括以下步骤：

S1、取微米级的麦饭石颗粒，浸入六偏磷酸钠、聚乙二醇、二异丙醇胺溶液中，超声处理，过滤，去离子水清洗，烘干至恒重；

S2、将上述处理后的麦饭石颗粒与L-赖氨酸二异氰酸酯混合均匀，在氩气保护下，加热至110～120℃，超微粉磨，自然冷却至室温，转入冰水浴、氩气保护下继续粉磨，去除冰水浴，恢复至室温，得到改性麦饭石，密封备用。

进一步地，所述聚乳酸乙醇酸共聚物的粘均分子量为30000～40000，LA:GA＝85:15。

一种所述含蛋白质胶原基骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、溶液和分散液的配制：将聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、Ⅰ型胶原溶于六氟异丙醇，配制成溶液；称取HA、改性麦饭石按质量比4:1混合均匀后置于安瓿瓶中，加入二氧六环/去离子水(v:v＝80:20)混合溶液，在60℃水溶液中超声至均匀分散，得到分散液；

步骤二、骨修复材料的制备：向盛分散液的安瓿瓶中加入配制好的PLGA、Ⅰ型胶原溶液，得混合溶液，取出安瓿瓶，将其置于80～90℃环境中粗化，然后浸入-50℃的乙醇溶液中速冻成型，并在该温度下保持2～4h，使完全固化，打破安瓿瓶，将样品取出，冷冻干燥48h以上即得骨修复材料；

步骤三、骨修复材料胺化改性：将步骤二制得的骨修复材料浸入的聚乙烯亚胺溶液中进行胺化改性，取出洗净，干燥后再浸入盐酸溶液中，取出洗净，干燥备用；

步骤四、自组装层的制备：将步骤三胺化改性的骨修复材料浸入氧化石墨烯分散液中，使其表面自组装一层氧化石墨烯，取出，水冲洗，之后将其置于加有吡咯单体的硝酸钙溶液电解液的电极体系中，脉冲电压作用下进行聚吡咯自组装，通过设置脉冲次数来控制聚吡咯的层数；

步骤五、骨形态发生蛋白-2的固载：将步骤四组装完成后的骨修复材料用去离子水洗净，真空干燥，浸入的骨形态发生蛋白-2溶液中，将固载骨形态发生蛋白-2的样品取出后置于37℃烘箱干燥即得含蛋白质胶原基骨修复材料。

进一步地，步骤二配制的PLGA、Ⅰ型胶原溶液中PLGA与Ⅰ型胶原的质量比为2～3:1。

进一步地，步骤二混合溶液中PLGA的质量浓度为8～12g/L，HA与PLGA质量比为5:80～100。

进一步地，步骤四电解液中硝酸钙浓度为10mM，吡咯浓度为10mM。

进一步地，步骤四中脉冲电压为-0.8V，时间80s。

本发明通过水热法制备得到介孔羟基磷灰石纳米棒，长度为200-300nm，宽度为25-35nm，与传统的羟基磷灰石相比，具有介孔结构的纳米棒状羟基磷灰石具有更强的成骨活性，与纳米颗粒相比，既能增强骨修复材料的强度，又能使材料具有较高的孔隙率，同时其介孔结构也使其自身拥有更好的分散性。

本发明所用麦饭石无毒无害，具有良好的生物相容性和骨诱导活性，已有研究表明麦饭石能够诱导新骨的生成，由于含有多种微量元素和稀土元素，有利于胶原形成、骨盐沉积，能够加速新组织的再生，促进骨组织生长，提高骨的强度。本发明所用改性麦饭石，首先用六偏磷酸钠、聚乙二醇、二异丙醇胺处理，然后在氩气保护下与L-赖氨酸二异氰酸酯在麦饭石表面发生反应，使得麦饭石表面含有多种活性基团，这些活性基团能够与羟基磷灰石表面的羟基相互联接，使颗粒向中间靠拢，促进改性麦饭石和羟基磷灰石在反应体系中均匀分散，同时活性基团与PLGA的羧基、Ⅰ型胶原的氨基酸发生交联反应，形成致密的交联网状结构，使得骨修复材料具有优异的机械强度此外，L-赖氨酸二异氰酸酯还能提高PLGA和Ⅰ型胶原的拉伸性，矿物与有机体系的界面粘结性能，材料的力学性能得到进一步提高。

本发明在骨修复材料制备时对PLGA、Ⅰ型胶原HA和改性麦饭石的质量配比及浓度进行筛选优化，使得材料的降解速度与骨缺损修复速度相对一致。本发明未对介孔羟基磷灰石进行表面修饰，使其能够保持良好的生物活性和骨传导性，通过其与改性麦饭石混合后与PLGA复合，既克服了PLGA亲水性差、降解产物偏酸性不利于骨细胞生长、机械强度保持时间不够的缺点，同时也规避了羟基磷灰石质脆、孔隙率低的缺陷，制得的骨修复材料具有良好的综合性能。采用简单的热致相分离法制备得到骨修复材料主体，各组分分布均匀，孔隙率高，性质稳定。

自组装大多在平面上进行，多孔结构表面自组装难度较大，因而本发明先对骨修复材料进行胺化改性，利用胺基与氧化石墨烯表面含氧基团的相互吸引的作用来增加氧化石墨烯的吸附量，使得骨修复多孔结构自组装获得的氧化石墨烯层更加紧密、有序。在后续自组装过程中，吡咯单体被氧化石墨烯表面的羟基吸附，然后脉冲电压的作用使周围-OH浓度过饱和，最后在氧化石墨烯骨修复材料表面形成聚吡咯。在多次脉冲作用下，在氧化石墨烯表面制备得到了多层聚吡咯自组装涂层。

本发明中骨形态发生蛋白-2通过其氨基和聚吡咯的氨基、氧化石墨烯的羟基之间的静电作用吸附在聚吡咯-氧化石墨烯自组装层中，由于这些吸附位点的存在，能够很好地起到对骨形态发生蛋白-2控释作用，聚吡咯-氧化石墨烯的多孔结构，也更有利于固载骨形态发生蛋白-2，而且可以通过控制聚吡咯自组装层数来调节固载量。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

(1)本发明提供的含蛋白质胶原基骨修复材料所用原料均无毒无害，具有良好的生物相容性，PLGA的降解产物是乳酸和羟基乙酸，同时也是人体代谢途径的副产物，其作为骨修复材料不会有毒副作用，Ⅰ型胶原具有低免疫原性和较强的组织亲和力，聚吡咯稳定性好，能够促进细胞粘附和增殖，各组分复合弥补了各自的缺点，充分发挥了各自的优点，在骨缺损修复中取得了良好的效果；

(2)本发明通过介孔羟基磷灰石纳米棒和改性麦饭石混合后使用，利用改性麦饭石表面的活性基团与羟基磷灰石羟基间的相互作用，在保留介孔羟基磷灰石的介孔结构及骨诱导活性的基础上，促进二者在体系中均匀分散，改性麦饭石负载的活性基团还能够提高二者与PLGA、Ⅰ型胶原有机系的相容性，材料制备过程中无需使用交联剂交联，采用简单的热致相分离法即得到致密的交联网状结构，制得的骨修复材料机械强度好，孔隙率高；

(3)本发明提供的含蛋白质胶原基骨修复材料，通过在骨修复材料表面自组装聚吡咯-氧化石墨烯层，能够牢固负载骨形态发生蛋白-2，同时由于其是基团间的通过静电作用吸附，是稳定的释放体系，不会发生突释或无法释放的情况，提高了骨形态发生蛋白-2的利用率，同时也极大地避免骨形态发生蛋白-2浓度过高引发的并发症。

附图说明

图1为细胞毒性试验LDH活性检测结果柱形图。

图2为各组试样的BMP-2固载量柱形图。

图3为各组试样的BMP-2随时间释放量曲线图。

图4为骨诱导试验两周后各组的Ca²⁺浓度柱形图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合具体实施例进行详细描述。

实施例1

介孔羟基磷灰石的合成：室温条件下，分别将0.67g十烷基三甲基溴化铵(CTAB)和7mL氨水加入盛有50mL去离子水的容器中，搅拌至完全溶解，继续搅拌20～30min，得到溶液1；另取一盛有30mL去离子水的容器，向其中加入1mmol磷酸氢二钠，搅拌20～30min，得到溶液2；然后将溶液2加入到溶液1中，再继续搅拌15～20min，之后将上述混合液转移到容积为150mL水热反应器中，程序升温至180℃后水热反应24h，将得到的悬浮液用高速离心机在8000rpm转速下离心，沉淀先水洗，再用无水乙醇洗涤，之后再将所得沉淀用400mL丙酮重新分散，80℃下回流36～48h，将其中的CTAB除去，最后在70℃下真空干燥24h，得到介孔羟基磷灰石(HA)。

实施例2

改性麦饭石的制备方法包括以下步骤：

S1、取微米级的麦饭石颗粒，浸入质量配比为2:4:50的六偏磷酸钠、聚乙二醇、二异丙醇胺混合溶液中，超声处理20～30min，过滤，去离子水清洗，烘干至恒重；

S2、将上述处理后的麦饭石颗粒与其重量1％的L-赖氨酸二异氰酸酯混合均匀，在氩气保护下，加热至110～120℃，超微粉磨2.5～4h，自然冷却至室温，转入冰水浴、氩气保护下继续粉磨20～30min，去除冰水浴，恢复至室温，得到改性麦饭石，密封备用。

实施例3

骨修复材料的制备：

步骤一、溶液和分散液的配制：将聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、Ⅰ型胶原溶于六氟异丙醇，配制成溶液，其中PLGA(粘均分子量34000)与Ⅰ型胶原的质量比为2:1；将实施例1制得的HA和实施例2制得的改性麦饭石按质量比4:1混合均匀后置于安瓿瓶中，HA与PLGA的质量比为5:100，加入二氧六环/去离子水(v:v＝80:20)混合溶液，在60℃水溶液中超声至均匀分散，得到分散液；

步骤二、骨修复材料的制备：向盛分散液的安瓿瓶中加入配制好的PLGA、Ⅰ型胶原溶液，使PLGA的质量浓度为8g/L，得混合溶液，取出安瓿瓶，将其置于80～90℃环境中粗化2h，然后浸入-50℃的乙醇溶液中速冻成型，并在该温度下保持2～4h，使完全固化，打破安瓿瓶，将样品取出，冷冻干燥48h以上即得骨修复材料。

实施例4

骨修复材料胺化改性：将实施例3制得的骨修复材料浸入1mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中进行胺化改性，3h后取出，洗净，干燥，再浸入5％的盐酸溶液中2min后取出，洗净，干燥备用。

实施例5

自组装层的制备：将步骤三胺化改性的骨修复材料浸入0.5mg/mL的氧化石墨烯分散液中5min，使其表面自组装一层氧化石墨烯，取出，水冲洗，之后将其置于电极体系中，电解液中硝酸钙浓度为10mM，吡咯浓度为10mM，脉冲电压为-0.8V，时间80s，脉冲作用6次，制备得到PPy₆-GO自组装层。

实施例6

骨形态发生蛋白-2的固载：将实施例5组装完成后的骨修复材料用去离子水洗净，真空干燥，浸入浓度为5mg/mL的骨形态发生蛋白-2溶液中，12h后，将负载骨形态发生蛋白-2的样品置于37℃烘箱干燥即得含蛋白质胶原基骨修复材料。

力学强度检测

按照ISO527-2-2012标准，测试骨修复材料的力学性能。样品1为实施例6制得的含蛋白质胶原基骨修复材料；样品2为采用未改性麦饭石代替改性麦饭石制得的骨修复材料。样品3为不含改性麦饭石制得的骨修复材料；每组样品均为6个，取平均值作为测试结果。

测试结果见表1。

项目	抗压强度/MPa	抗弯强度/MPa	断裂伸长率/％	弹性模量/GPa
					样品1	172.84±8.33	140.71±4.52	15.69±2.56	3.45±1.33
样品2	91.05±9.42	80.56±2.94	8.54±3.72	2.28±1.56
					样品3	109.34±6.82	97.51±3.08	11.43±2.85	3.16±1.44

从表1可以看出，本发明制得的含蛋白质胶原基骨修复材料具有优异的力学性能。样品2采用的普通未改性麦饭石，普通麦饭石与羟基磷灰石两种矿物组分与有机系的相容性均较差，导致各项测试结果均大幅降低；样品3不含改性麦饭石，即仅含有羟基磷灰石矿物组分，各项测试结果明显低于样品1。上述结果表明改性麦饭石在骨修复材料制备过程的交联网状结构形成过程中发挥重要作用，对骨修复材料的机械强度起到关键作用。

细胞毒性试验

试验方法：将Vero细胞接种到24孔细胞培养板上，每孔接种的细胞数目为5×10⁵，与实施例6制得的含蛋白质胶原基骨修复材料共孵育1、3、5天，设置阴性对照组(con)、含蛋白质胶原基骨修复材料实验组(exp)，每组在每个时间点3复孔。1、3、5天后分别收集培养液，离心取上清，按照乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒说明书测定LDH活性评价材料的细胞毒性。

试验结果：Vero细胞与含蛋白质胶原基骨修复材料共孵育1、3、5天的LDH活性检测结果如图1所示。

LDH是在正常细胞的胞质中存在的一种稳定的蛋白质，当细胞膜受损后，胞浆中的LDH则被释放到细胞外，因而培养基中的LDH活性和细胞的死亡数成正比，检测试剂盒酶标仪读取的OD值与LDH活性之间成线性正相关。从图1可以看到，共孵育1天后含蛋白质胶原基骨修复材料组与阴性对照组活性接近，无显著差异。3天和5天后含蛋白质胶原基骨修复材料共孵育组的LDH活性明显低于阴性对照组。试验结果表明含蛋白质胶原基骨修复材料无细胞毒性，且能提高细胞活力，降低LDH的释放。

BMP-2的固载与释放试验

样品制备：组1为实施例6制备得到的PPy₆-GO骨修复材料；组2骨修复材料为实施例3制得的无自组装层的骨修复材料；组3为单独GO自组装层的骨修复材料；组4为自组装过程中脉冲作用4次制备得到的PPy₄-GO自组装层骨修复材料；组5为自组装过程中脉冲作用8次制备得到的PPy₈-GO自组装层骨修复材料。

BMP-2的固载：将上述各组的骨修复材料用去离子水洗净，真空干燥，浸入浓度为5mg/mL的骨形态发生蛋白-2溶液中，12h后，将负载骨形态发生蛋白-2的样品置于37℃烘箱干燥即得样品。

BMP-2的释放：每组样品设置6个平行样。将所有样品均浸泡于等量(2mL)的PBS缓冲溶液中，置于37℃恒温环境下，在浸泡1天，3天，7天，15天和25天时，分别收集每个样品的PBS溶液，然后更换新的PBS溶液。通过BMP试剂盒检测所收集的PBS溶液中的BMP-2浓度。

试验结果：各组试样的BMP-2固载量如图2所示；各组试样的BMP-2随时间释放量如图3所示。

从图2可以看出，有PPy自组装层的样品表面的BMP-2固载量高于无PPy自组装层的样品，这是由于BMP-2能够通过其氨基与GO的羟基和PPy的氨基之间的静电作用吸附在自组装涂层中。且从图中可以得到BMP-2的固载量随着自组装层数的增加而增高的结论。

从图3可以看出，BMP-2在具有自组装层骨修复材料表面都表现出缓慢释放的过程。组2无自组装涂层骨修复材料出现了释放速度较快，在第7天释放率已经达到99％，因为无自组装涂层导致没有固定BMP-2的位点。单独GO自组装层，在25天时BMP-2的释放率分别为92％和97％。组1、组4和组5的BMP-2释放率明显低于单独GO自组装层骨修复材料，且释放率随PPy自组装层数增加而降低。

骨诱导试验

通过小鼠股部肌袋埋植实验检测骨修复材料诱导异位骨形成的能力。

样品制备：组1为实施例6制备得到的骨修复材料(G1)；组2为采用普通纳米羟基磷灰石按照本发明的后续方法制得的骨修复材料，其BMP-2固载量与组1样品相同(G2)。

试验方法：取健康清洁KM小鼠30只，分为两组，每组15只，腹腔注射巴比妥钠进行麻醉，之后暴露右侧大腿股部肌肉，分别将组1、组2的骨修复材料植入到KM小鼠的后腿肌肉内进行埋植实验，2周后取出埋植物测定新生骨Ca²⁺水平。

试验结果：各组试验的Ca²⁺浓度如图4所示。

从图4可以看出，BMP-2固载量相同的情况下，组1实施例5制备得到的骨修复材料的异位骨诱导能力大于组2采用普通纳米羟基磷灰石制得的骨修复材料，表明本发明所用介孔纳米棒状磷灰石具有良好的骨诱导性能。

体内降解试验

试验方法：取成年新西兰大白兔50只，分为甲、乙、丙、丁、戊五组，每组10只，对各组大白兔全身麻醉，对双上肢进行常规消毒，对上肢前臂作桡骨暴露处理，于桡骨中上1/3处截骨，去除桡骨和骨膜，得到双侧桡骨节段性骨缺损模型。植入不同的骨修复材料，甲组为本发明实施例6制得的骨修复材料，乙组为HA与PLGA的质量比为5:50制得的骨修复材料，丙组为HA与PLGA的质量比为5:200制得的骨修复材料，丁组为HA与PLGA的质量比为5:100制得的骨修复材料，所用聚乳酸乙醇酸共聚物的粘均分子量为28000，LA:GA＝85:15；戊组为HA与PLGA的质量比为5:100制得的骨修复材料，所用聚乳酸乙醇酸共聚物的粘均分子量为42000，LA:GA＝85:15；采集术后4周和16周的组织切片，计算骨修复材料的降解情况。

试验结果：植入骨修复材料术后4周和16周时的残余率如下表2所示。

组别	n	4周	16周
				甲组	10	83.26±2.34	26.18±1.97
乙组	10	91.95±4.06	64.31±6.88
				丙组	10	88.94±3.50	39.53±4.26
丁组	10	68.27±1.03	19.99±0.01
				戊组	10	98.94±3.50	79.53±4.26

从表2可以看到，前三组在4周时的降解率相当，但是在16周时差异较大，甲组实施例6HA与PLGA的质量比为5:100，材料残余率仅为26％左右，而乙组HA与PLGA的质量比为5:50，HA占比远高于甲组，16周后材料残余率还有64％左右，丙组HA与PLGA的质量比为5:200，HA占比较低，然而16周材料残余率还有39％左右，这可能是由于HA的介孔结构对材料降解过程起到一定的促进作用，因而只有在合理的配比下，才能保证骨修复材料的降解速率与骨缺损修复速率保持一致，取得理想的修复效果。丁组在4周时降解率即大于30％，降解速率过快，此时新生组织还不具有支撑作用，不利于骨组织生长；戊组降解速率过慢，不能给骨组织生长提供足够的空间；因此，PLGA的分子量对材料的降解性能影响较大，选择适宜分子量的PLGA是保证骨修复材料降解速率与骨缺损修复速度相对一致的关键。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。