阅读说明：本技术 负载维生素d的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥及制备方法 (Vitamin D-loaded calcium citrate/calcium sulfate composite bone cement and preparation method thereof ) 是由 严永刚 邓光进 陈红 戢觅之 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于骨修复材料领域,具体涉及一种载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥及制备方法与应用。本发明提供一种负载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥,所述骨水泥由固相部分和液相部分组成,液固比为0.2～0.6：1；固相部分包括柠檬酸钙、硫酸钙盐和维生素D,柠檬酸钙和硫酸钙盐的质量比为1：4～4：1；维生素D与骨水泥的质量比为6×10<Sup>-3</Sup>～20×10<Sup>-3</Sup>：1。本发明所得复合骨水泥具有良好的可注射性、合适的凝固时间、缓慢的药物释放和优异的生物活性,可以用于骨缺损的填充使用。(The invention belongs to the field of bone repair materials, and particularly relates to vitamin D-loaded calcium citrate/calcium sulfate composite bone cement, and a preparation method and application thereof. The invention provides vitamin D-loaded calcium citrate/calcium sulfate composite bone cement, which consists of a solid-phase part and a liquid-phase part, wherein the liquid-solid ratio is 0.2-0.6: 1; the solid phase part comprises calcium citrate, calcium sulfate salt and vitamin D, wherein the mass ratio of the calcium citrate to the calcium sulfate salt is 1: 4-4: 1; the mass ratio of the vitamin D to the bone cement is 6 multiplied by 10 ‑3 ～20×10 ‑3 : 1. the composite bone cement prepared by the invention has good injectability, proper setting time, slow drug release and excellent bioactivity, and can be used for filling bone defects.)

负载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥及制备方法

技术领域

本发明属于骨修复材料领域，具体涉及一种载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥及制备方法与应用。

背景技术

近年来，随着人口老龄化的加剧，各种创伤和慢性疾病如骨质疏松症等发生率显著提高，如何有效的治疗骨质疏松症已成为研究的热点问题之一。钙是构筑人体骨骼的主要矿物元素。钙不仅有助于骨质形成，还能激活多种酶。人体中99％的钙贮存在骨骼、牙齿等硬组织里，只有1％以离子状态存在血液、内脏、肌肉、神经等软组织里。缺钙不仅可引起佝偻病、骨软化症和骨质疏松症，还可导致高血压、动脉硬化、软组织钙、老年性痴呆等许多疾病。另外，有研究表明维生素D对骨质疏松症有一定的预防作用。因此，对于骨质疏松症患者来说，需要在骨折早期愈合时填充骨移植材料，向骨组织处释放充足钙离子和维生素D来帮助骨组织愈合。

目前临床上有使用的骨填充材料有羟基磷灰石、磷酸钙、硅酸钙、硫酸钙等，但是它们各自都存在一些问题，如强度低，降解过快或过慢，可注射性差等，这限制了其在临床上的应用。因此，有必要开发一种新型的骨修复材料来更好的满足临床需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥，复合骨水泥具有良好的可注射性、合适的凝固时间、缓慢的药物释放和优异的生物活性，可以用于骨缺损的填充使用。

本发明的技术方案：

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种负载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥，所述骨水泥由固相部分和液相部分组成，液固比为0.2～0.6：1；固相部分包括柠檬酸钙、硫酸钙盐和维生素D，柠檬酸钙和硫酸钙盐的质量比为1：4～4：1；维生素D与骨水泥的质量比为6×10^-3～20×10^-3：1。

进一步，所述硫酸钙盐为α-半水硫酸钙、β-半水硫酸钙或二水硫酸钙中的至少一种。

进一步，所述柠檬酸钙为四水柠檬酸钙Ca₃(C₆H₅O₇)₂·4H₂O、二水柠檬酸钙 Ca₃(C₆H₅O₇)₂·2H₂O或无水柠檬酸钙Ca₃(C₆H₅O₇)₂中的至少一种。

进一步，上述固相部分还包括海藻酸钠、透明质酸或明胶中的至少一种。加入适量的海藻酸钠、透明质酸或明胶都能使骨水泥的抗压强度和成型性提高。

进一步，所述维生素D为维生素D2(骨化醇)、维生素D3(胆骨化醇、胆钙化醇)、 1，25-二羟基维生素D2或1，25-二羟基维生素D3中的至少一种。

本发明要解决的第二个技术问题是将提供上述负载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥的制备方法：

1)将柠檬酸钙和硫酸钙盐混合均匀形成固相复合物，柠檬酸钙和硫酸钙盐的质量比为 1：4～4：1；

2)将固相复合物与维生素D-乙醇溶液搅拌混匀，然后烘干粉碎得固相共混物粉末；其中，维生素D-乙醇溶液的浓度为0.1～12.5mg/mL，维生素D-乙醇溶液与固相复合物的液固比为1.5～3mL/g；

3)将固相共混物粉末与固化液混合搅拌形成骨水泥浆体，然后成型即得负载维生素D 的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥；其中，固化液和固相共混物的液固比0.2～0.3mL/g。

进一步，步骤1)中，柠檬酸钙和硫酸钙盐的质量比为2：3～3：2。

进一步，步骤1)中，柠檬酸钙和硫酸钙盐采用球磨的方式混合均匀，球磨时间为2～12 小时；优选为4～8小时，球磨速率为130～170转/分钟。

进一步，步骤2)中，固相共混物的粒径达到150目过筛即可。

优选的，步骤2)中，维生素D-乙醇溶液的浓度为0.1～2.5mg/mL。

本发明的有益效果：

本发明首次将柠檬酸钙与硫酸钙盐复合制成骨水泥的形态，并定量地稳定地负载上适量的维生素D，使制成的骨水泥具有缓慢的药物释放和良好的成骨能力，硫酸钙盐的加入使得柠檬酸钙的抗溃散性得到显著提高，可塑性良好。复合骨水泥中加入不同浓度的维生素D-乙醇溶液，不会改变其物理化学性质，但会明显提高细胞活性。合适的凝固时间、良好的可注射性、较高的力学强度和缓慢的药物释放是使得负载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥可以在骨缺损方法得到广泛的应用。

附图说明：

图1为实施例1-6所得骨水泥的凝固时间图。

图2为实施例1-6所得骨水泥的可注射性图。

图3为实施例1-6所得骨水泥的抗压强度图。

图4为实施例1-6所得骨水泥的XRD衍射图。

图5为实施例7-11所得负载维生素D的骨水泥的凝固时间图。

图6为实施例7-11负载维生素D的骨水泥的可注射性图。

图7为实施例7-11负载维生素D的骨水泥的抗压强度图。

图8为实施例7-11负载维生素D的骨水泥在PBS溶液中42天的降解曲线。

图9为实施例7-11负载维生素D的骨水泥在PBS溶液中42天的药物释放曲线。

具体实施方式

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种负载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥，所述骨水泥由固相部分和液相部分组成，液固比为0.2～0.6：1；其中，固相部分由柠檬酸钙和硫酸钙盐复合而成，柠檬酸钙和硫酸钙盐的质量比为1：9～9：1；维生素D与骨水泥的质量比为0～20*10^-3：1。

本发明中，柠檬酸钙在水化过程中会释放柠檬酸根离子，柠檬酸钙中的COO^-官能团会与硫酸钙中的钙离子螯合形成配位键，从而阻碍水进入硫酸钙中，减缓硫酸钙的固化过程，导致复合骨水泥的凝固时间明显长于硫酸钙。

本发明要解决的第二个技术问题是将提供上述负载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥的制备方法：

1)将柠檬酸钙和硫酸钙盐混合均匀形成固相复合物，柠檬酸钙和硫酸钙盐的质量比为 1：9～9：1；

2)将固相复合物与维生素D-乙醇溶液搅拌混匀，然后烘干粉碎得固相共混物粉末；其中，维生素D-乙醇溶液的浓度为0.1～12.5mg/mL，维生素D-乙醇溶液与固相复合物的液固比为1.5～3mL/g；

3)将固相共混物粉末与固化液混合搅拌形成骨水泥浆体，然后成型即得负载维生素D 的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥；其中，固化液和固相共混物的液固比0.2～0.3mL/g；本发明中，固液比是影响骨水泥强度、凝固时间的核心因素，如果固液比太低粘度太大、难以成型；如果固液比太高则凝固时间太长、不能满足临床要求、其强度也会降低。

本发明中，必须使用维生素D-乙醇溶液，否则维生素D无法均匀分散到骨水泥中，就无法形成稳定的载维生素D的柠檬酸钙/硫酸钙复合骨水泥；此外，维生素D在骨水泥中的含量低于发明最低值就没有促进细胞增殖功能，如果高于该发明最高值，可能出现维生素中毒现象。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。

实施例1-实施例6

按表1中的配方制备实施例1，其制备方法为：将柠檬酸钙和硫酸钙粉末按表1中的质量比进行称量，然后将物理混合后的复合粉末放入球磨机中研磨4h，球磨速率为150转 /分钟，再按表1中的液固比精确量取固化液，其中固化液为去离子水；将固化液加入固相粉末中，迅速搅拌形成骨水泥浆体，再将骨水泥浆体放入直径6mm，高度7mm和12mm 的聚四氟乙烯模具中成型即可。

表1实施例1-实施例6中的配方制备实施例

	编号	柠檬酸钙/硫酸钙	液固比(mL/g)
				实施例1	样品1	0：1	0.19
实施例2	样品2	1：4	0.21
				实施例3	样品3	2：3	0.23
实施例4	样品4	3：2	0.25
				实施例5	样品5	4：1	0.26
实施例6	样品6	1：0	0.35

实施例7-实施例11

维生素D3-乙醇溶液的配制，称量1.25g维生素D3粉末溶解于100mL的无水乙醇，配制出浓度为12.5mg/mL维生素D-乙醇溶液；然后将该溶液进行稀释得到2.5、0.5和 0.1mg/mL的维生素D3-乙醇溶液。

按表2中的配方制备实施例7-11，其制备方法为：将柠檬酸钙和硫酸钙粉末按质量比为3：2进行精确称量，然后将物理混合后的复合粉末放入球磨机中研磨4h，球磨速率为150转/分钟，再按液固比为1.5mL/g(指维生素D3-乙醇溶液与复合粉末的比例)精确量取不同浓度的维生素D3-乙醇溶液，将溶液加入复合粉末后用磁力搅拌器搅拌15min，然后放入鼓风干燥箱中50℃干燥6h，最后将烘干的粉末用研钵研磨得含维生素D3的固相粉末；再按固液比0.25mL/g精确量取固化液，其中固化液为去离子水；将固化液加入含维生素D3的固相粉末中，迅速搅拌形成骨水泥浆体，再将骨水泥浆体放入直径6mm，高度7mm 和12mm的聚四氟乙烯模具中成型即可。

表2：实施例7-实施例11中的配方制备实施例

性能测试：

1、凝固时间测试方法如下：

样品的凝固时间根据ISO 9597-2008标准，利用维卡仪进行测定。固化液加入样品粉末后开始计算，当维卡仪的终凝针头(0.5mm)不能在样品表面留下痕迹时结束，这样计算的时间就是骨水泥的终凝时间，每个样品至少测量5次。

结果如图1和图5所示，由图1可以看出，制备的6种骨水泥中，样品1的凝固时间小于5min，而样品6的凝固时间大于40min，其他复合骨水泥(样品3，样品4和样品5) 的凝固时间均在15-30min，可以为医生提供充足的手术时间。骨水泥的凝固时间随着硫酸钙含量的减少而减少，这是因为硫酸钙的固化时间很短，当硫酸钙的含量减少时，快速固化的能力也减弱了。另一方面是柠檬酸根离子会与硫酸钙表面的钙离子螯合，抑制硫酸钙的水化过程，从而使得凝固时间延长。

从图5可以看出，制备的5种骨水泥中，除了样品11，其他样品的凝固时间均在 20-25min，满足手术操作的要求；当维生素D3-乙醇溶液的浓度提高到12.5mg/mL时，样品11与对照组样品7相比，凝固时间明显缩短，可能的原因是柠檬酸根离子与钙离子螯合的过程中脂溶性的维生素D3会阻碍其结合过程，使得硫酸钙部分水化，从而缩短凝固时间；当维生素D3-乙醇溶液的浓度小于2.5mg/mL时，负载维生素D3的复合骨水泥的凝固时间基本相同。

2、可注射性测试方法如下：

样品的可注射性测试使用10mL注射器，其针头内径为2.69mm。在样品粉末中加入定量的固化液，迅速搅拌形成骨水泥浆体，此时称量记为m0；再将搅拌后的水泥浆体放入10mL注射器中，用恒力挤压注射器，挤压成连续的条状，此时将挤压出来的条状水泥称重记为m1；最后可以通过公式计算出注射率。

结果如图2和图6所示，由图2可以看出，制备的6种骨水泥中，样品3、样品4和样品5的可注射性均超过90％。而样品1和样品6的可注射性均低于15％。可能的原因是柠檬酸根离子与钙离子的螯合作用为骨水泥提供了粘合力，从而提高了复合骨水泥的可注射性；硫酸钙固化时间短，因而可注射性差；柠檬酸钙是由于差的成型性从而限制了其可注射性。

从图6可以看出，制备的5种骨水泥均具有良好的可注射性，可注射性超过90％以上。这是因为螯合作用为骨水泥提供了粘合力，少量的维生素D3对螯合作用虽然有一定的抑制作用，但是其不会影响到可注射性性能。

3、力学强度测试方法如下：

待样品(直径为6mm，高度为12mm)在空气中固化3天后，用万能力学试验仪对样品的力学强度进行测定，每个样品至少测量5次。

结果如图3和图7所示，由图3可以看出，制备的6种骨水泥中，除样品1和样品6 外，复合骨水泥的力学强度随着硫酸钙含量的减少而减少；其中，样品2具有最高的力学强度达到32Mpa；这是因为，柠檬酸根离子和硫酸钙中的钙离子螯合，当柠檬酸根离子和硫酸钙中的钙离子达到最佳配比时，具有最高的凝固时间；当偏离最佳比例以后，随着硫酸钙中的钙离子含量的减少，力学强度逐渐减少。

从图7可以看出，制备的5种骨水泥中，除了样品11，其他样品的力学强度均在 25-30Mpa范围内；而样品11的力学强度为26Mpa；可能的原因是高含量的维生素D3会对柠檬酸根粒子和钙粒子之间的螯合起阻碍作用，从而使得力学强度下降。

4、X射线衍射分析(实施例1-6)：

将在空气中固化3天的样品用研钵研磨成细粉，通过X射线衍射仪对样品粉末进行分析，研究复合骨水泥的固化机理。

样品固化3天时的XRD衍射图谱如图4，可以看出，样品1为硫酸钙的主要衍射峰；样品6为柠檬酸钙的主要衍射峰。其他样品是由硫酸钙和柠檬酸钙组成的复合骨水泥。样品4和样品5中属于CaSO₄·2H₂O的衍射峰消失了，可能原因是螯合作用阻碍了硫酸钙的水化过程，抑制了CaSO₄·2H₂O的生成。

5、材料降解的情况(实施例7-11的样品)：

样品在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中进行材料降解的实验。

PBS的配制方法如下；精确称取KH₂PO₄(0.544g)，Na₂HPO₄·12H2O(7.16g),NaCl(16g) 和KCl(0.402g)溶于2L去离子水中，用容量瓶定容，pH测定范围7.2-7.4之间；将样品(直径为6mm，高度为7mm)放入离心管中加入一定量的PBS溶液，PBS溶液的体积与样品表面积之比为0.1cm²/mL；然后将装有样品的离心管放置在温度为37℃，转速为 80rpm/min的恒温振荡箱；在1，3，7，14，28和42天取出样品称重并用pH计对样品的上清液进行测定，PBS每7天更换一次。每个样品设立三个对照组。

样品的失重率计算方法如下：样品在浸泡前的重量为m0，在规定时间点内取出样品，然后样品在80℃真空干燥箱中烘干16h，至恒重为止时的重量为m1；其中m0*(m3/m2) 是除去样品自然挥发的影响后的重量。

结果如图8所示，由图可以看出，除了样品11，其他样品的失重率都是随着维生素D3含量的增加而增加，这是由于维生素D3的存在在一定程度上破坏了柠檬酸根离子和钙离子的螯合，因此负载的维生素D3越多，失重率越高；而样品11中维生素D3的含量最高，但是失重率并不是最高的。

4、药物释放的测定(实施例7-11的样品)

样品在PBS中进行药物释放实验，在1，3，7，14，28和42天取出样品的释放的药物溶液，并在低温下保存。

精确称量25mg的维生素D2溶于25mL无水乙醇，配制出1mg/mL的维生素D2-乙醇内标溶液。精确量取200uL的维生素D2-乙醇内标溶液，加入到取出的1mL标准溶液中，使其均匀混合后向15mL的离心管中加入3mL正己烷溶液，涡旋5min，离心3min(转速 5000r/min)。静置后，精确量取2mL上层清液放入6mL的离心管，如此重复3次。将3 次收集的上清液于50℃下负压真空蒸干。最后，加入1mL甲醇复溶，超声15min，过膜，送检。

维生素D3的测定，采用内标法；选择维生素D2作为内标物，甲醇作为流动相，用高效液相色谱对维生素D3进行定量的检测。

结果如图9所示，由图可以看出，骨水泥内部含维生素D3越多，样品的药物释放量越高，这符合药物释放的一般规律。另外，可以观察到复合骨水泥可以持续的释放药物，这是因为含柠檬酸钙的骨水泥具有良好的生物活性可以在水泥表面诱导磷灰石的沉积，而柠檬酸钙和磷灰石层均难溶于水，两者附着在骨水泥表面阻碍了药物释放的通道，从而使药物释放的速度减慢，达到了持续性的药物释放。

对比例1和硫酸钙比较

将100g硫酸钙粉末放入球磨机中研磨4h，按液固比为0.6:1的质量比例固化，其中固化液为去离子水，固化时间为5分钟，1天后的抗压缩强度为12MPa,10：1比例放入 SBF溶液中，每周换液，1周降解20％，溶液pH为5，4周全部全部降解。

对比例2和硫酸钙比较

将100g硫酸钙粉末放入球磨机中研磨4h，按液固比为0.5:1的质量比例固化，其中固化液为去离子水，固化时间为3分钟，1天后的抗压缩强度为15MPa,10：1比例放入 SBF溶液中，每周换液，1周降解20％，溶液pH为5，4周全部全部降解。

对比例3和柠檬酸钙比较

将100g柠檬酸钙粉末放入球磨机中研磨5h，按液固比为0.6:1的质量比例固化，其中固化液为去离子水，固化时间为40分钟，1天后的抗压缩强度为9MPa,10：1比例放入SBF溶液中，每周换液，1周降解5％，溶液pH为10，4周降解8％。

对比例4和柠檬酸钙比较

将100g柠檬酸钙粉末放入球磨机中研磨5h，按液固比为0.5:1的质量比例固化，其中固化液为去离子水。固化时间为35分钟，1天后的抗压缩强度为10MPa,10：1比例放入SBF溶液中，每周换液，1周降解5％，溶液pH为10，4周降解8％。

对比例5和硫酸钙VD比较

将100g硫酸钙粉末放入球磨机中研磨4h，再按液固比为1.5mL/g精确量取维生素D3- 乙醇溶液(浓度为2.5mg/mL)加入研磨后的硫酸钙粉末中，磁力搅拌15min，然后放入鼓风干燥箱中50℃干燥6h，将烘干的粉末用研钵研磨得固相粉末；然后按液固比为0.6:1 的质量比例加入固化液，其中固化液为去离子水，固化时间为5分钟。

所得样品1天后的抗压缩强度为11MPa,10：1比例放入SBF溶液中，每周换液，1周降解20％，溶液pH为5，维生素D3释放50％，4周全部全部降解、降解速度太快、无法与骨重建速度匹配。

对比例6和柠檬酸钙VD比较

将100g柠檬酸钙粉末放入球磨机中研磨5h，再按液固比为1.5mL/g精确量取维生素 D3-乙醇溶液(浓度为2.5mg/mL)加入研磨后的硫酸钙粉末中，磁力搅拌15min，然后放入鼓风干燥箱中50℃干燥6h，将烘干的粉末用研钵研磨得固相粉末；然后按液固比为0.6:1的质量比例加入固化液，其中固化液为去离子水，固化时间为40分钟。

所得样品1天后的抗压缩强度为9MPa,10；1比例放入SBF溶液中，溃散，溶液pH为10。

本发明首次将VD定量地附加到柠檬酸钙/硫酸钙骨水泥中，并能控制释放，从而促进成骨；由对比例可知，并不是所有骨水泥能够进行缓释的，比如磷酸钙系骨水泥难以降解就无法缓释，比如硫酸钙单独使用及降解太快导致很快失去效果、比如柠檬酸钙单独使用就会溃散等，无法承载和缓释，从而无法达到促进骨细胞活性、促进骨的再生和重建。