阅读说明：本技术 一种pamam与客体小分子相互作用方式的nmr检测方法 (NMR detection method for PAMAM and guest small molecule interaction mode ) 是由 乔岩 马敏珺 王英雄 赵奇 郭朝晖 张书怀 郭晓樱 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种PAMAM与客体小分子相互作用方式的NMR检测方法,所述的NMR检测方法是基于一维氢谱、DOSY谱、NOESY谱、CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱进行PAMAM与客体小分子相互作用方式的检测,至少选择PAMAM与客体小分子的一维氢谱、DOSY谱和NOESY谱,当所述PAMAM与客体小分子的一维氢谱中出现谱峰重叠难以进行指认与归属时,再进一步选择CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱中的一种或两种进行分离重叠谱峰,通过对比PAMAM与客体小分子相互作用前后谱图的变化,即可得知PAMAM与客体小分子的相互作用方式。本发明的检测方法具有所需测试样品量小、测试精确度高、分辨率高,可实现对样品的无损检测等优点。本发明的检测方法针对研究PAMAM与客体小分子相互作用方式中存在的谱峰重叠归属不明确现象提供有效可靠的解决方法。(The invention relates to an NMR detection method of PAMAM and guest small molecule interaction mode, the NMR detection method is based on a one-dimensional hydrogen spectrum, a DOSY spectrum, a NOESY spectrum, a CSSFs-TOCSY spectrum and a pure shift spectrum to detect the PAMAM and guest small molecule interaction mode, at least the one-dimensional hydrogen spectrum, the DOSY spectrum and the NOESY spectrum of the PAMAM and the guest small molecule are selected, when the overlapping of the peaks in the one-dimensional hydrogen spectrum of the PAMAM and the guest small molecule is difficult to identify and belong to, one or two of the CSSFs-TOCSY spectrum and the pure shift spectrum are further selected to separate the overlapping peaks, and the interaction mode of the PAMAM and the guest small molecule can be known by comparing the changes of the spectra before and after the interaction of the PAMAM and the guest small molecule. The detection method has the advantages of small amount of samples to be tested, high test accuracy, high resolution, capability of realizing nondestructive testing of the samples and the like. The detection method provided by the invention provides an effective and reliable solution for researching the ambiguous phenomenon of spectral peak overlapping attribution existing in the interaction mode of PAMAM and guest small molecules.)

一种PAMAM与客体小分子相互作用方式的NMR检测方法

技术领域

本发明涉及核磁共振检测技术领域，具体涉及一种PAMAM与客体小分子相互作用方式的NMR检测方法。

背景技术

聚酰胺-胺树状分子PAMAM是一种三维、高度有序的新型高分子化合物，具有相对可控的分子量、丰富的表面官能团以及非极性内部疏水腔的特点。PAMAM与客体小分子相互作用时，不仅可以作为客体小分子的载体，还可以提高客体小分子的化学或生物活性。目前，PAMAM与客体小分子的相互作用方式已被广泛应用到许多领域，例如利用PAMAM与表面活性剂的相互作用降低表面活性剂的表面张力及临界胶束浓度；利用PAMAM与催化剂的相互作用提高催化剂的活性；利用PAMAM与缓释药物分子的相互作用，增加难溶药物的水溶性等。然而，还没有系统的NMR检测方法测定PAMAM与客体小分子的相互作用方式。

PAMAM与客体小分子的相互作用方式的测定方法可以采用量热滴定法和紫外分光光广度法，但是这些方法样品需求量大，精确度不高。目前，检测PAMAM与客体小分子的相互作用方式的方法还可以用一维氢谱滴定与NOESY谱的结合，但是谱峰易出现重叠，致使信号归属不清楚，精确度不高，对研究PAMAM与客体小分子相互作用方式存在局限性。

发明内容

本发明是针对现有测定PAMAM与客体小分子相互作用所采用的量热滴定法和紫外分光光广度法以及只使用一维氢谱滴定和NOESY方法存在的所需样品量大、测试精确度不高等缺陷，提供一种PAMAM与客体小分子相互作用方式的NMR检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种PAMAM与客体小分子相互作用方式的NMR检测方法，所述的NMR检测方法是基于一维氢谱、DOSY谱(扩散排序谱)、NOESY谱、CSSFs-TOCSY谱(化学选择性滤波激发谱)和pure shift谱(纯化学位移谱)进行PAMAM与客体小分子相互作用方式的检测，至少选择PAMAM与客体小分子的一维氢谱、DOSY谱和NOESY谱，当所述PAMAM与客体小分子的一维氢谱中出现谱峰重叠难以进行指认与归属时，再进一步选择CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱中的一种或两种进行分离重叠谱峰，通过对比PAMAM与客体小分子相互作用前后谱图的变化，即可得知PAMAM与客体小分子的相互作用方式。本发明是基于一维氢谱、DOSY谱、NOESY谱、CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱进行PAMAM与客体小分子相互作用的检测方法，在检测过程中，所需样品量少，不破坏样品，也不需要样品预处理，通过对比PAMAM与客体小分子相互作用前后谱图的变化，即可得知PAMAM与客体小分子的相互作用方式，谱图指认归属准确，分析结果精确，具有广谱性，适用于PAMAM与多种客体小分子相互作用的测定。CSSFs-TOCSY谱可以选择性激发重叠谱峰的边峰，将与它直接或间接耦合的质子信号激发出来，提炼出某一组分的纯净谱图。Pure shift谱可以消除J耦合效应(即将相邻质子间耦合所引起的多重裂分融合成一个单峰)，分辨率显著提高。一维氢谱、DOSY谱及NOESY谱信号重叠现象会严重干扰分析相互作用结果的准确性，选择CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱中的一种或两种进行分离重叠谱峰，有利于分析结果的准确性。

更进一步地，所述一维氢谱使用基于30度激发的zg30脉冲序列谱；所述DOSY谱使用基于BPPLED脉冲序列或受激回波STE脉冲序列的扩散排序谱，由于自扩散运动，分子位置发生变化，使磁化强度不完全重聚进而引起信号衰减，此脉冲可以极大降低屏蔽探头里出现的涡流效应，所得谱图相位不发生畸变，所得数据更为准确；所述NOESY谱使用noesygpphpp脉冲序列，其使用方波标准波形，可得出空间上小于于

(埃)的H的信号，即使不同H之间相隔多键，进而检测出客体小分子与PAMAM的空间构型；所述CSSFs-TOCSY谱使用selcssfdizs.2脉冲序列，是在一维TOCSY方法的基础上添加化学位移选择性滤波，将与它直接或间接耦合的质子信号激发出来，纯化谱图便于谱峰的指认与归属；所述pureshift谱包括采用ZS、PSYCHE和TSE-PSYCHE中任一种方法获取的图谱。采用ZS、PSYCHE和TSE-PSYCHE中任一种方法，将相邻质子间耦合所引起的多重裂分融合成一个单峰，分辨率显著提高，分离重叠谱峰，有利于谱峰的指认与归属使检测精确度大大提升。

再进一步地，所述ZS、PSYCHE和TSE-PSYCHE方法分别使用psyche.mf、pushpr1dzs和tse-psyche脉冲。

再进一步地，所述NMR检测方法中使用的检测仪器为带梯度场的液体核磁共振谱仪，具体检测步骤如下：

(1)制备测试样品，并置于液体核磁共振谱仪的样品管内；

(2)调整液体核磁共振谱仪温度和气流速率，样品管不旋转；将样品在设定的温度及气流下恒定数分钟；

(3)依次测试样品的一维氢谱、DOSY谱及NOESY谱，使用布鲁克Topspin 3.1或Dynamics center 2.2.4软件处理所得数据；

(4)当测试样品的一维氢谱中未出现谱峰重叠时，依据步骤(3)所得数据分析PAMAM与客体小分子的相互作用方式；

(5)当测试样品的一维氢谱中出现谱峰重叠时，再进一步选择测试样品的CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱中的一种或两种，使用布鲁克Topspin 3.1或Dynamics center2.2.4软件处理所得数据，并同时依据步骤(3)所得数据分析PAMAM与客体小分子的相互作用方式。

样品在设定的气流和温度下恒定15至30分钟再测试样品的一维氢谱、DOSY谱及NOESY谱，以避免样品溶液在测试时出现对流效应，影响测试结果的准确性。使用布鲁克Topspin 3.1或Dynamics center 2.2.4软件处理所得数据使谱图清晰明了，便于PAMAM与客体小分子相互作用方式的判断。

再进一步地，所述液体核磁共振谱仪的梯度场为400MHz以上。400MHz以上的梯度场可以保证场强大于9.5T，以保证测试灵敏度，保证检测PAMAM与客体小分子相互作用的准确性。

再进一步地，所述步骤(1)中制备测试样品的具体步骤为：取PAMAM及客体小分子溶于同一溶剂，磁力搅拌24小时后，取350～500μl溶液加入内标物置于核磁样品管中，混匀，将样品管放入液体核磁共振谱仪中待测。采用内标物与PAMAM和客体小分子置于同一溶剂中，可以使实验误差减小，消除溶液环境对体系的影响，增加测试相互作用的准确性。

再进一步地，所述内标物为四甲氧基硅烷、3-(三甲基硅基)-1-丙磺酸钠或1，4-二氧六环中的一种或几种；所述溶剂为重水、氘代DMSO、氘代氯仿或氘代甲醇的一种或几种。所选内标物不与PAMAM及客体小分子相互作用，且谱峰信号不与PAMAM及客体小分子重叠。

再进一步地，所述步骤(2)中调整液体核磁共振谱仪温度为298K至333K，气流速率为400至500lph，恒定时间为15至30分钟。

再进一步地，所述步骤(3)中测试DOSY谱的参数为：采用的梯度场强度GPZ6的取值区间为2％至98％；扩散时间Δ为100～300ms；梯度场脉宽值δ/2为1000～3000μs；样品在最大梯度场强度获得2％～10％的残余信号；扫描次数NS是8的倍数；空扫次数DS是4的倍数；所使用的二维谱图采样次数TD F1维为8～128次，F2维为16k～128k。

再进一步地，所述步骤(3)中测试NOESY谱的参数为：混合时间D8值的范围是0.1～2s；所使用的脉冲扫描次数NS是2的倍数；空扫次数DS是16的倍数。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的检测方法所需测试样品量小、测试精确度高，分辨率高，可实现对样品的无损检测；

(2)本发明的检测方法提供一种准确系统的关于PAMAM与客体小分子相互作用方式的NMR检测方法；

(3)本发明的检测方法针对研究PAMAM与客体小分子相互作用方式中存在的谱峰重叠归属不明确现象提供有效可靠的解决方法；

(4)本发明的检测方法对于PAMAM与客体小分子相互作用方式的研究具有普适性。

附图说明

图1为实施例1中PAMAM与维生素B7相互作用的一维氢谱图；

图2为实施例1中PAMAM与维生素B7相互作用的NOESY谱；

图3为实施例1中PAMAM与维生素B7相互作用的CSSFs-TOCSY谱与一维氢谱对比图；

图4为实施例1中PAMAM与维生素B7相互作用的pure shift谱与一维氢谱对比图；

图5为实施例1中PAMAM与维生素B7相互作用的CSSFs-TOCSY谱、pure shift谱及一维氢谱对比图；

图6为实施例2中PAMAM与5-氟尿嘧啶(5-FU)相互作用的一维氢谱图；

图7为实施例2中PAMAM与5-氟尿嘧啶(5-FU)相互作用的NOESY谱；

图8为实施例3中PAMAM与色氨酸相互作用的一维氢谱图；

图9为实施例3中PAMAM与色氨酸相互作用的NOESY谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

一种PAMAM与客体小分子相互作用方式的NMR检测方法中，在本实施例中选用维生素B7为客体小分子，所述的NMR检测方法是基于一维氢谱、DOSY谱、NOESY谱、CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱进行PAMAM与维生素B7相互作用方式的检测，至少选择PAMAM与维生素B7的一维氢谱、DOSY谱和NOESY谱，当所述PAMAM与维生素B7的一维氢谱中出现谱峰重叠难以进行指认与归属时，再进一步选择CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱中的一种或两种进行分离重叠谱峰，通过对比PAMAM与维生素B7相互作用前后谱图的变化，即可得知PAMAM与维生素B7的相互作用方式。

所述一维氢谱使用基于30度激发的zg30脉冲序列谱；所述DOSY谱使用基于BPPLED脉冲序列或受激回波STE脉冲序列的扩散排序谱；所述NOESY谱使用核磁共振谱仪标准的noesygpphpp脉冲序列；所述CSSFs-TOCSY谱使用selcssfdizs.2脉冲序列，该谱是在一维TOCSY方法的基础上添加化学位移选择性滤波，将与它直接或间接耦合的质子信号激发出来，纯化谱图便于谱峰的指认与归属；所述pure shift谱包括采用ZS、PSYCHE和TSE-PSYCHE中任一种方法获取的图谱；所述ZS、PSYCHE和TSE-PSYCHE方法分别使用psyche.mf、pushpr1dzs和tse-psyche脉冲。

所述NMR检测方法中使用的检测仪器为带400MHz梯度场的液体核磁共振谱仪，具体检测步骤如下：

(1)制备测试样品：取0.8mg第5代的PAMAM及0.41mg维生素B7溶于500微升氘代甲醇中，磁力搅拌24小时后，取400μl溶液加入5微升内标物1，4-二氧六环(取10微升1，4-二氧六环用重水稀释20倍)置于核磁样品管中，混匀，将样品管放入液体核磁共振谱仪的样品管内待测。

(2)调整液体核磁共振谱仪温度为333K，气流速率为500lph，样品管不旋转；将样品在设定的温度及气流下恒定15分钟。

(3)依次测试样品的一维氢谱、DOSY谱及NOESY谱，其中DOSY谱首先设置梯度场强度GPZ6的取值为2％，扩散时间Δ为180ms，梯度场脉宽值δ/2为1000μs，采一个氢谱，采用的梯度场强度GPZ6为95％；扩散时间Δ为300ms；梯度场脉宽值δ/2为2000μs；采集第二个氢谱，匹配两次氢谱使样品在最大梯度场强度获得3％的残余信号；扫描次数NS是16；空扫次数DS是8；所使用的二维谱图采样次数TD F1维为32次，F2维为32k。其中NOESY谱的参数为：混合时间D8值的范围是2s；所使用的脉冲扫描次数NS为16；空扫次数DS是16。PAMAM与维生素B7相互作用的一维氢谱、NOESY谱图分别如图1和2所示。

(4)使用布鲁克Topspin 3.1软件分析氢谱谱图，发现G5-PAMAM与维生素B7存在重叠信号，进而使用CSSFs-TOCSY方法检测测试样品的CSSFs-TOCSY谱，设置中心频率O1为962.13Hz，扫描次数NS使16次，空扫次数是四次；也可以使用pure shift方法检测测试样品的pure shift谱，扫描次数NS是16次，空扫次数是2次；同样可以将CSSFs-TOCSY谱与pureshift谱相结合检测测试样品。PAMAM与维生素B7相互作用的CSSFs-TOCSY谱与一维氢谱对比图、pure shift谱与一维氢谱对比图以及CSSFs-TOCSY谱、pure shift谱和一维氢谱对比图如图3-5所示。

(5)使用布鲁克Topspin 3.1软件或Dynamics center 2.2.4软件处理剩余所得数据，对比PAMAM与维生素B7相互作用前后谱图中质子峰的化学位移与峰形的变化发现一维氢谱中PAMAM只有与末端氨基相连的两个亚甲基向低场方向移动，维生素B7的羧基向高场移动，且NOESY谱中无PAMAM与维生素B7相关交叉信号，软件计算得到相互作用后的PAMAM比作用前的扩散的慢，说明PAMAM与客体小分子的相互作用为表面结合，分离后(1)CSSFs-TOCSY谱与原始一维氢谱相对比，在2.34ppm处缺失一组峰；(2)pure shift谱在2.39ppm及2.34ppm出现两个峰；(3)CSSFs-TOCSY谱与pure shift谱相结合，在CSSFs-TOCSY谱中消失的峰即为pure shift谱里分离出的2.34ppm处的峰，两者结果相互印证，更加准确。这三种方式均可表明相互作用后PAMAM内外层化学环境不同，进一步验证PAMAM与维生素B7客体小分子的相互作用的方式为表面结合。PAMAM与维生素B7相互作用前后扩散系数对比如表1所示。

表1 PAMAM与维生素B7相互作用前后扩散系数对比表

实施例2

一种PAMAM与客体小分子相互作用方式的NMR检测方法中，在本实施例中选用5-氟尿嘧啶(5-FU)为客体小分子，所述的NMR检测方法是基于一维氢谱、DOSY谱、NOESY谱、CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱进行PAMAM与5-氟尿嘧啶(5-FU)相互作用方式的检测，先选择PAMAM与5-氟尿嘧啶(5-FU)的一维氢谱、DOSY谱和NOESY谱，再根据需要选择CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱中的一种或两种进行谱峰的指认与归属，通过对比PAMAM与5-氟尿嘧啶(5-FU)相互作用前后谱图的变化，即可得知PAMAM与5-氟尿嘧啶(5-FU)的相互作用方式。

其中，一维氢谱、DOSY谱、NOESY谱、CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱分别选用的脉冲序列同实施例1。

所述NMR检测方法中使用的检测仪器为带600MHz梯度场的液体核磁共振谱仪，具体检测步骤如下：

(1)制备测试样品：取0.8mg第3代的PAMAM及0.90mg 5-氟尿嘧啶(5-FU)溶于500微升重水中，磁力搅拌24小时后，取500μl溶液加入5微升内标物1，4-二氧六环(取10微升1，4-二氧六环用重水稀释20倍)置于核磁样品管中，混匀，将样品管放入液体核磁共振谱仪中待测。

(2)调整液体核磁共振谱仪温度为303K，气流为450lph，样品管不旋转；将样品在设定的温度及气流下恒定25分钟。

(3)依次测试样品的一维氢谱、DOSY谱及NOESY谱，其中DOSY谱首先设置梯度场强度GPZ6的取值为2﹪，扩散时间Δ为100ms，梯度场脉宽值δ/2为1000μs，采一个氢谱，采用的梯度场强度GPZ6为98％；扩散时间Δ为100ms；梯度场脉宽值δ/2为3000μs；采集第二个氢谱，匹配两次氢谱使样品在最大梯度场强度获得5﹪的残余信号；扫描次数NS是32；空扫次数DS是4；所使用的二维谱图采样次数TD F1维为8次，F2维为16k。其中NOESY谱的参数为：混合时间D8值的范围是1s；所使用的脉冲扫描次数NS为32；空扫次数DS是32。PAMAM与氟尿嘧啶(5-FU)相互作用的一维氢谱、NOESY谱图分别如图6和7所示。

(4)使用布鲁克Topspin 3.1软件分析氢谱谱图，发现G5-PAMAM与5-氟尿嘧啶(5-FU)没有重叠信号，因此不需要进行CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱的测试。

(5)使用布鲁克Topspin 3.1软件或Dynamics center 2.2.4软件处理所得数据，对比PAMAM与5-FU相互作用前后一维谱图中5-FU在PAMAM加入后，向高场移动，PAMAM只有与末端氨基相连的两个亚甲基向低场方向移动，NOESY谱中明显出现5-FU与PAMAM的交叉峰，且软件计算得到相互作用后的PAMAM比作用前的扩散的慢，说明5-FU与PAMAM不仅发生表面相互作用，而且进入PAMAM的内腔体中。PAMAM与5-氟尿嘧啶(5-FU)相互作用扩散系数对比如表2所示。

表2 PAMAM与5-氟尿嘧啶(5-FU)相互作用扩散系数对比表

实施例3

一种PAMAM与客体小分子相互作用方式的NMR检测方法，在本实施例中选用色氨酸为客体小分子，所述的NMR检测方法是基于一维氢谱、DOSY谱、NOESY谱、CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱进行PAMAM与色氨酸相互作用方式的检测，先选择PAMAM与色氨酸的一维氢谱、DOSY谱和NOESY谱，再根据需要选择CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱中的一种或两种进行谱峰的指认与归属，通过对比PAMAM与色氨酸相互作用前后谱图的变化，即可得知PAMAM与色氨酸的相互作用方式。

其中，一维氢谱、DOSY谱、NOESY谱、CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱分别选用的脉冲序列同实施例1。

所述NMR检测方法中使用的检测仪器为带500MHz梯度场的液体核磁共振谱仪，具体检测步骤如下：

(1)制备测试样品：取0.8mg第4代的PAMAM及1mg色氨酸溶于500微升重水中，磁力搅拌24小时后，取350μl溶液加入20μl四甲氧基硅烷(TMS)置于核磁样品管中，混匀，将样品管放入液体核磁共振谱仪中待测；

(2)调整液体核磁共振谱仪温度为298K，气流为400lph，样品管不旋转；将样品在设定的温度及气流下恒定30分钟；

(3)依次测试样品的一维氢谱、DOSY谱及NOESY谱，其中DOSY谱首先设置梯度场强度GPZ6的取值为2﹪，扩散时间Δ为150ms，梯度场脉宽值(δ/2)为1000μs，采一个氢谱，采用的梯度场强度GPZ6为98％；扩散时间Δ为150ms；梯度场脉宽值(δ/2)为2500μs；采集第二个氢谱，匹配两次氢谱使样品在最大梯度场强度获得6﹪的残余信号；扫描次数NS是24；空扫次数DS是8；所使用的二维谱图采样次数TD F1维为128次，F2维为128k。其中NOESY谱的参数为：混合时间D8值的范围是0.1s；所使用的脉冲扫描次数NS为64；空扫次数DS是16。PAMAM与色氨酸相互作用的一维氢谱、NOESY谱图分别如图8和9所示。

(4)使用布鲁克Topspin 3.1软件分析氢谱谱图，发现G4-PAMAM与色氨酸没有重叠信号，因此不需要进行CSSFs-TOCSY谱和pure shift谱的测试。

(5)使用布鲁克Topspin 3.1软件或Dynamics center 2.2.4软件处理所得数据，对比PAMAM与色氨酸相互作用前后一维谱图中色氨酸在PAMAM加入后，向高场移动，PAMAM只有与末端氨基相连的两个亚甲基向低场方向移动，NOESY谱中未出现色氨酸与PAMAM的交叉峰，且软件计算得到相互作用后的PAMAM比作用前的扩散的慢，说明色氨酸与PAMAM仅发生表面相互作用，未进入PAMAM的内腔体中。PAMAM与色氨酸相互作用前后扩散系数对比如表3所示。

表3 PAMAM与色氨酸相互作用前后扩散系数对比表

上述实施例中制备测试样品所用的内标物还可以为3-(三甲基硅基)-1-丙磺酸钠，或为四甲氧基硅烷、3-(三甲基硅基)-1-丙磺酸钠或1，4-二氧六环中的几种混合；所用溶剂还可以为氘代DMSO、氘代氯仿，或为重水、氘代DMSO、氘代氯仿或氘代甲醇的几种混合。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。