光合细菌活菌粉剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 光合细菌活菌粉剂及其制备方法和应用 (Photosynthetic bacteria live bacteria powder and preparation method and application thereof ) 是由 成飞雪 刘勇 张德咏 王东伟 王剑 程菊娥 朱春晖 谭新球 张松柏 唐蓓 孙书娥 于 2021-06-21 设计创作，主要内容包括：一种本发明的光合细菌活菌粉剂及其制备方法和应用,该光合细菌活菌粉剂的制备包括将冷冻干燥保护剂加入光合细菌培养液中,混匀,然后依次加入壳聚糖和海藻酸钠,使菌液变成浓稠状,再将浓稠状光合细菌菌液中加入高岭土,以吸收多余的水分,使光合细菌菌液变成泥浆状,再进行低温冷冻干燥,形成固状物,含水率保持在2.5％～3.0％,经粉碎过筛后,得到光合细菌活菌粉剂。本发明实现了光合细菌微生物制剂从菌剂到粉剂的飞跃,生产的光合细菌活菌粉剂不易感染杂菌、质量稳定,产品储存方便且储存时间长,运输成本大幅降低,可广泛用于农业生产。(The preparation method of the photosynthetic bacteria viable powder comprises the steps of adding a freeze-drying protective agent into a photosynthetic bacteria culture solution, uniformly mixing, then sequentially adding chitosan and sodium alginate to change the bacterial solution into a thick state, then adding kaolin into the thick photosynthetic bacteria bacterial solution to absorb excessive water to change the photosynthetic bacteria bacterial solution into a slurry state, then carrying out low-temperature freeze drying to form a solid state, keeping the water content at 2.5-3.0%, and crushing and sieving to obtain the photosynthetic bacteria viable powder. The invention realizes the leap of photosynthetic bacteria microbial preparation from microbial inoculum to powder, the produced photosynthetic bacteria live bacteria powder is not easy to infect mixed bacteria, the quality is stable, the product is convenient to store and long in storage time, the transportation cost is greatly reduced, and the photosynthetic bacteria microbial preparation can be widely used for agricultural production.)
技术领域
本发明属于微生物农药制剂领域，涉及一种光合细菌活菌粉剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种通过低温冷冻保护、适应低含水率的光合细菌活菌粉剂及其制备方法和应用。
背景技术
光合细菌(Photosynthetic Bacteria，PSB)是地球上出现最早的能够进行光合作用的一类原核生物总称，广泛分布于海洋、湖泊、河流、活性污泥及农田土壤中。光合细菌具有固氮、固碳、产氢和脱硫等作用，被用于生物菌肥、污水处理、化学农药降解等领域。近年来，我们发现光合细菌不仅可以促进作物生长，还能有效防治作物病害，且对人畜无毒，在生物防治领域表现出巨大的应用前景。目前已有2个光合细菌农药产品已获得农药登记证。
光合细菌属于水圈微生物，对环境中的水分含量要求很高，当环境中水分少于10％时较难长时间存活。目前市面上的光合细菌产品(微生物肥料、水净化剂、微生物农药等)大多以液体形式存在，这种形式存在菌体易污染、流失、保存困难、运输不方便等问题，不利于产品的储存与质量稳定，并且运输成本极高。而少数固化状态的光合细菌产品大多以沸石粉、稻壳粉或无纺布等作为载体，对光合细菌进行吸附与固定，形成颗粒或是块状，用于水产养殖或水体净化。也曾有报道利用絮凝剂将光合细菌进行沉淀，去除上清，再加入保护剂与填料，形成可湿性粉剂产品，而这种技术对光合细菌的固化大多是先进行浓缩去上清，再利用海藻酸钠等包埋剂，采用滴注法将菌体进行包埋制成小球或是吸附到载体上，将菌体固定，有效的稳定了游离菌体，减少流失。但是，这些固化方法存在以下几个方面的问题：(1)采用滴注法将光合细菌菌体进行包埋制成小球或是吸附到载体上后不能重新释放出活的菌体；(2)滴注法常采用针筒或注射器进行操作，难以实现工厂化批量生产；(3)先要将菌体进行浓缩去上清，而光合细菌发酵生产过程中大量的次生代谢产物在上清中，这些次生代谢产物中包含有生防因子，去除后会显著降低产品的防病效果；(4)现有技术得到的产品含水量大，一般超过了10％，不利于长期常温保存，若产品在储存或运输过程中突遇高温，会导致菌体失活。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可高效保护光合细菌菌体活性及次生代谢产物、适用于低含水率环境、常温和高温下存放时间长、稳定性好、运输成本低、防治作物病害效果好的光合细菌活菌粉剂及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。
一种光合细菌活菌粉剂，所述光合细菌活菌粉剂是以光合细菌培养液为原料、以海藻糖、抗坏血酸和山梨醇作为冷冻干燥保护剂、以壳聚糖和海藻酸钠作为增稠剂、以高岭土作为固态填充料制备而成。
上述的光合细菌活菌粉剂，优选的，所述光合细菌培养液、海藻糖、抗坏血酸、山梨醇、壳聚糖、海藻酸钠和高岭土的比例为100mL∶0.5g～1.0g∶0.025g～0.05g∶0.05g～0.1g∶0.5g～1.0g∶1.0g～1.5g∶2.0g～2.5g，所述光合细菌培养液的浓度为1×109cfu/mL～9×109cfu/mL。
上述的光合细菌活菌粉剂，优选的，所述光合细菌活菌粉剂的含水率为2.5％～3.0％，所述光合细菌活菌粉剂的储存温度为4℃～42℃，储存时间为1年。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种光合细菌活菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将冷冻干燥保护剂加入光合细菌培养液中，所述冷冻干燥保护剂为海藻糖、抗坏血酸和山梨醇，混匀，得到含冷冻干燥保护剂的光合细菌菌液；
(2)在含冷冻干燥保护剂的光合细菌菌液中依次加入壳聚糖和海藻酸钠，混匀，使菌液变成浓稠状；
(3)在浓稠状光合细菌菌液中加入高岭土，混匀，吸收多余的水分，使光合细菌菌液从浓稠状变成泥浆状；
(4)将泥浆状光合细菌菌液进行冷冻干燥，形成固状物，使含水率为2.5％～3.0％，经粉碎过筛后，得到光合细菌活菌粉剂。
上述的光合细菌活菌粉剂的制备方法，优选的，步骤(1)至步骤(3)中，所述光合细菌培养液、海藻糖、抗坏血酸、山梨醇、壳聚糖、海藻酸钠和高岭土的比例为100mL∶0.5g～1.0g∶0.025g～0.05g∶0.05g～0.1g∶0.5g～1.0g∶1.0g～1.5g∶2.0g～2.5g。
上述的光合细菌活菌粉剂的制备方法，优选的，步骤(4)中，所述冷冻干燥为-180℃真空冷冻干燥或-40℃冷冻喷雾干燥。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的光合细菌活菌粉剂或者上述的制备方法制得的光合细菌活菌粉剂在农业生产中的应用。
上述的应用，优选的，所述农业生产包括促进作物生长和防治作物病害，所述作物病害包括作物线虫病、作物病毒病和水稻稻瘟病中的一种或几种。
本发明中，光合细菌包括嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)、沼泽红假单胞菌(Hodopseudomonas palustris)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)、嗜硫小红卵菌(Rhodovulumsulfidophilum)。这些光合细菌均为本实验室分离获得的，已保藏并公开，这些光合细菌不仅能促进作物生长，还对植物线虫病害、蔬菜病毒病、水稻稻瘟病等病害具有较好防治效果的生防菌。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明直接利用光合细菌培养液，采用冷冻干燥保护剂将光合细菌菌体及培养液中次生代谢产物进行保护，以避免冷冻干燥过程中对菌体细胞造成生理性损伤或导致次生代谢产物结构改变而失去活性；采用高吸水性增稠剂，壳聚糖和海藻酸钠通过阴阳离子静电吸引形成多孔状亲水复合凝胶，吸附光合细菌菌体和次生代谢产物，并吸收水分使菌液变成浓稠状；采用高岭土作为填料，进一步对菌液进行吸附，减少游离水，使之进一步增稠，同时增加产品的悬浮性，减少低温干燥时间与能耗。本发明的产品稳定性好，经60℃高温中可存放14d，活菌率与常温存放下无显著性差异，产品货架期显著延长。同时，研制的粉剂产品相比于液体菌剂，便于储存与运输，显著降低运输成本。制备的光合细菌微生物粉剂产品可通过直接撒施或溶于水制成悬浮液直接喷雾等方式进行田间应用。
2、本发明解决光合细菌类微生物肥料(农药)长期以水剂产品的生产格局，本发明制备的光合细菌活菌粉剂包含光合细菌培养生产过程中分泌的次生代谢产物(抗病因子、促生因子等)。通过本发明制备的光合细菌粉剂产品不易感染杂菌、细菌质量优、稳定性好，可作为微生物肥料或是微生物农药广泛应用于农业生产中促进作物生长或是进行病害防治，可直接通过撒施或兑水喷雾。通过本发明生产的光合细菌粉剂产品储存方便，货架期长，运输方便、包装简易、易于实施。
附图说明
图1为本发明实施例1中含不同冷冻干燥保护剂的光合细菌活菌粉剂的活菌检测结果。
图2为本发明实施例1中高温处理后光合细菌活菌粉剂平板检测法检测菌体存活情况。
图3为本发明实施例1中不同储存温度与时间的光合细菌活菌粉剂菌体存活率。
图4为本发明实施例2中光合细菌活菌粉剂防治番茄根结线虫病的盆栽试验结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。若无特别说明，以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的光合细菌活菌粉剂，以光合细菌培养液为原料、以海藻糖、抗坏血酸和山梨醇作为冷冻干燥保护剂、以壳聚糖和海藻酸钠作为增稠剂、以高岭土作为固态填充料制备而成，含水率为2.5％～3.0％，储存温度为4℃～42℃，储存时间可长达1年。
本实施例采用的光合细菌为具有防病促生功能的生防菌，包括：嗜酸柏拉红菌PSB-1、嗜硫小红卵菌IV-1、沼泽红假单胞菌LY-6、沼泽红假单胞菌PSB-06等，这些菌株为湖南省园艺作物病虫害治理重点实验室分离获得的菌种，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为：CTCC No：M206124，CTCC No：M2012369，CTCC No：M2014525，CTCC No：M2012518，涉及专利文献的公开号分别为：CN100546482、CN103525729、CN105794853、CN103224904。
一种本实施例的光合细菌活菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在光合细菌培养液中加入冷冻干燥保护剂海藻糖、抗坏血酸和山梨醇，混合均匀后，得到含冷冻干燥保护剂的光合细菌菌液。采用冷冻干燥保护剂可以保护光合细菌菌体及其次生代谢产物结构在低温冷冻干燥的过程中免遭破坏，并且使光合细菌菌体可以在低含水率下保持活性。
(2)在步骤(1)所得含冷冻干燥保护剂的光合细菌菌液中先后加入高吸水性增稠剂壳聚糖和海藻酸钠，混匀，使其变成浓稠状。本步骤加入增稠剂的目的一方面为了减少菌液中的水分，另一方面对菌体进行吸附与保护。
(3)在步骤(2)所得浓稠状光合细菌菌液中加入固态填料高岭土，混匀，以吸收多余的水分，形成泥浆状光合细菌菌液。
(4)将步骤(3)所得泥浆状光合细菌菌液放入-180℃真空低温干燥器中进行真空低温冷冻干燥6h～8h，得到固状物，然后用粉碎机进行粉碎，过100目筛，得到光合细菌活菌粉剂，或是在-40℃条件下直接进行冷冻喷雾干燥，得到光合细菌活菌粉剂。对粉剂按剂量进行包装，获得应用于生产的粉剂产品。
本实施例中，光合细菌培养液、海藻糖、抗坏血酸、山梨醇、壳聚糖、海藻酸钠、高岭土的比例为100mL∶0.5g∶0.025g∶0.05g∶0.5g∶1g∶2g。
本实施例中，光合细菌培养液由以下方法制得，但不限于此。
(1)菌种活化：将超低温保存的光合细菌(如嗜酸柏拉红菌等中的一种菌种)按平板培养法进行培养，培养至红色菌落出现。平板培养法优选是采用双层MSYN固体培养基进行培养，在pH值为7.0～7.2，温度为30℃～35℃，光照条件为2000～3000Lx条件下进行培养。MSYN固体培养基的配方为：(NH4)2SO4 0.1wt％、MgSO4 0.02wt％、NaHCO3 0.5wt％、K2HPO4 0.05wt％、NaCl 0.02wt％、酵母膏0.15wt％和琼脂1.5wt％，其余为水，pH＝7.0。
(2)种子培养：将步骤(1)培养的红色单菌落接入血清瓶，用嗜酸柏拉红菌等菌株种子培养基培养至对数生长期。种子培养基为MSYN液体培养基，pH值为7.0～7.2，培养温度为30～35℃，光照条件为2000～3000Lx。MSYN液体培养基配方为：(NH4)2SO4 0.1wt％、MgSO40.02wt％、NaHCO3 0.5wt％、K2HPO4 0.05wt％、NaCl 0.02wt％和酵母膏0.15wt％，pH＝7.0。
(3)生产培养：将步骤(2)培养后得到的菌液按不少于嗜酸柏拉红菌等菌株生产培养基总体积1％～5％的接种量，接种到生产瓶中，培养至浓度为(1-9)×109cfu/mL，得到用于粉剂制备的光合细菌培养液。生产培养基为MSYN液体培养基，pH值为7.0～7.2，培养温度为30～35℃，光照条件为2000～3000Lx。
本发明中，冷冻干燥保护剂的选择对光合细菌的存活至关重要。本发明的冷冻干燥保护剂是经过大量实验筛选得到，举例对比如下：
有研究表明，在芽孢杆菌冷冻干燥中使用脱脂乳粉、葡聚糖、甘油、抗坏血酸钠等作为保护剂，制得的菌粉活菌收率分别在25％-55％之间。申请人分别以蔗糖、海藻糖、抗坏血酸、山梨醇、脱脂乳粉、甘油等作为菌体冷冻干燥保护剂进行研究，以不加冷冻干燥保护剂作为对照。在100mL光合细菌菌液中分别加入不同的冷冻干燥保护剂，种类与浓度见表1。
表1冷冻干燥保护剂及其用量
将含有不同冷冻干燥保护剂的光合细菌菌液按照本实施例的光合细菌活菌粉剂制备步骤进行操作，并进行活菌检测，结果如图1所示。由图1可知，海藻糖、抗坏血酸钠以及山梨醇的组合对光合细菌菌体保护效果最好，能获得较高的活菌收率。在此基础上，利用海藻糖、抗坏血酸钠和山梨醇进行正交试验，结果表明，当100mL光合细菌培养液中加入0.5g～1.0g海藻糖、0.025g～0.05g抗坏血酸和0.05g～0.1g山梨醇时，其活菌收率达到95％以上。
本发明中，光合细菌活菌粉剂的制备过程中添加增稠剂可减少产品中的水分，使菌液变得粘稠，并对菌体及次生代谢产物起到吸附与包埋作用，从而降低冷冻干燥过程中的能耗并维持菌体与次生代谢产物的活性。选用海藻酸钠、壳聚糖、羧甲基淀粉和羧甲基纤维素作为增稠剂，通过单因子及正交试验观察其吸水增稠能力，筛选适宜的增稠剂。试验结果表明：当100mL光合细菌培养液中依次加入0.5g～1.0g壳聚糖和1.0g～1.5g海藻酸钠时，其增稠吸水效果最好。同时，在此基础上，加入2.0g～2.5g高岭土作为填充料，减少菌液中游离水的含量，有利于后续的冷冻干燥，减少干燥时间和能耗，并增加产品的悬浮性。
产品活菌检测
对于微生物制剂来说，活菌数量与货架期是衡量产品的重要标准之一，因此，不同储存时间产品的菌活性检测对光合细菌粉剂产品极其重要。本实施例的光合细菌活菌粉剂的菌活性检测步骤如下：
(1)将本实施例制备的光合细菌活菌粉剂分装后分成两组(未高温处理组和高温处理组)，一组分别置于4℃和常温下储存，另一组先置于60℃恒温箱中14d，再分别置于4℃和常温下储存，再分别在21d、60d、90d、6个月以及1年期取粉剂进行活菌数检测。
(2)称取经60℃高温处理的光合细菌活菌粉剂0.02g，加入2mL灭菌水混匀成悬浮液，利用MSYN液体培养基依次稀释成10-2、10-3、10-4，使浓度分别约1×107cfu/mL、1×106cfu/mL和1×105cfu/mL，以光合细菌培养液稀释1000倍菌液为对照。取稀释菌液100μL，涂平板，利用MSYN固体培养基进行光合细菌双层培养3-7d，观察菌落生长情况。实验结果表明，从第3d开始，不同稀释浓度处理都开始出现少量红色菌落，对照处理菌落生长较快。生长7d后，所有处理都生长出大量的菌落，生长速度逐步加快，群落颜色比对照更红。表明制备的粉剂产品菌活性好，与液体菌剂相比，虽生长前期生长较缓慢，但很快得到恢复，结果如图2所示。
(3)称取不同储存温度与时间的光合细菌活菌粉剂0.02g，加入2mL灭菌水混匀成悬浮液，利用MSYN液体培养基稀释1000倍，使光合细菌浓度约1×106cfu/mL，各取1mL稀释液分别装入含有MSYN液体培养基的15mL玻璃离心管中，密封，置于温度为30～35℃，光照条件为2000～3000Lx培养箱中培养3～7d，使液体变成红色。以接种光合细菌培养液(稀释1000倍，使接种浓度约1×106cfu/mL)作为对照。利用酶标仪进行OD600测量，计算菌液浓度，通过与对照比较计算粉剂菌存活率，结果如图3所示。从图3可以看出，本发明制备的光合细菌活菌粉剂光合细菌菌活性较好，经过60℃处理的粉剂与未经高温处理的粉剂相比，菌活性不存在显著性差异。此外，检测结果表明，随着储存时间的延长，产品中的菌活性虽有下降，但是降幅不大，产品储存一年与储存21d相比，粉剂中活菌率降低18.7％-20.1％。与光合细菌培养液相比，其活性菌仍然保持在70％以上。
实施例2
一种本发明的光合细菌活菌粉剂在防治农业作物病害中的应用，具体为利用研制的嗜酸柏拉红菌粉剂产品进行温室盆栽防治番茄根结线虫病试验，包括以下步骤：试验设3个处理，以粉剂0.5g/盆、1.0g/盆和2.0g/盆进行撒施在番茄根围，翻土覆盖，同时试验设1.8％阿维菌素乳油1000倍和清水作为对照处理，每个处理10株番茄。当3-4片叶龄番茄移栽成活后进行处理，第二天接种南方根结线虫，接种量为500条二龄幼虫/盆。60d后调查番茄根结情况，试验结果如图4所示，随着粉剂用量的增加，防效增加，当利用粉剂产品1.0g/盆施用时，其防效可达63.16％，与2.0g/株处理及阿维菌素对照处理对番茄根结线虫病防效差异不显著，显示了本发明的光合细菌活菌粉剂在作物线虫病害防治上的巨大应用潜力，可作为阿维菌素的替代产品，以减少线虫对阿维菌素的抗药性的产生。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
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