阅读说明：本技术 一种血浆病毒灭活方法 (Plasma virus inactivation method ) 是由 吕茂民 武岳 朱凤宣 梁梦雅 孙珍珠 董秋瑛 屈洒洒 方迟 张梦君 李庆保 于 2019-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种血浆病毒灭活方法,包括向血浆中加入药用芦丁0.3-0.8g/L或芸香苷0.5-1.5mM作为灭活病毒的增强剂和血浆蛋白的保护剂,在一定强度UVC的辐照处理后能有效的灭活血浆中的有囊膜病毒和无囊膜病毒,解决了亚甲蓝光化学法不能灭活无囊膜病毒的问题,该方法还能减少血浆病毒灭活中蛋白质,特别是凝血因子的损失,有效保护了血浆中凝血因子的活性。(The invention provides a plasma virus inactivation method, which comprises the steps of adding 0.3-0.8g/L of medicinal rutin or 0.5-1.5mM of rutin into plasma as a virus inactivation reinforcing agent and a plasma protein protective agent, and effectively inactivating enveloped viruses and non-enveloped viruses in the plasma after irradiation treatment of certain strength UVC, thereby solving the problem that the non-enveloped viruses cannot be inactivated by a methylene blue photochemical method, reducing the loss of proteins, particularly blood coagulation factors, in plasma virus inactivation and effectively protecting the activity of the blood coagulation factors in the plasma.)

一种血浆病毒灭活方法

一技术领域

本发明属于血液制品领域和病毒灭活领域，具体地，本发明提供了一种血浆病毒灭活方法，包括向血浆中加入药用芦丁0.3g/L-0.8g/L或芸香苷0.5mM-1.5mM，作为蛋白保护剂和增效剂；该方法能有效的减少血浆病毒光化学灭活中蛋白，特别是凝血因子的损失，并有效杀灭有囊膜病毒和无囊膜病毒。

二背景技术

血浆是医疗中手术、抢救等众多环节中的必需品，也是制备多种血液制品的原料。目前，血浆主要依赖人捐赠途径获得，捐赠中一般会通过筛查的方法来控制病毒的污染，由于筛查存在一定的窗口期和假阴性率，为了进一步增加血浆的病毒安全性，通常还需要对血浆进行病毒灭活处理。

由于血浆成分的复杂性和安全性要求，常用的病毒灭活方法如高温热处理法、有机溶剂处理法、低pH处理法、除病毒膜过滤处理法并不不适用于血浆的病毒灭活，目前可用的血浆病毒灭活方法包括S/D灭活法、亚甲蓝光化学处理法、补骨脂素光化学处理法等。

S/D法常用于通用混合血浆的病毒灭活处理。而且上述这些方法只能灭活有囊膜的病毒，对无囊膜的病毒没有灭活作用。S/D灭活病毒血浆的制备过程中需加入聚三梨脂和吐温等有机溶剂，血浆按程序完成病毒灭活后需要进一步的去除S/D试剂的处理，增加了制备工艺的复杂性，并且还存在一定量的S/D试剂的残留，一般用于血液制品生产中大量混合血浆的病毒灭活处理。

亚甲蓝光化学法灭活法是目前最常用的单份血浆病毒灭活方法，其问题主要在于在病毒灭活过程中的蛋白损失，特别是凝血因子损失较高，以及不能灭活无囊膜病毒，此外，已经证明亚甲基蓝残留对人体会有潜在的不利影响(如致癌、致畸等)，并且欧盟已经明确了停止使用亚甲蓝的时间表。按照目前的标准，要求亚甲基蓝残留不超过加入量的15％，对于具有潜在致癌作用的物质，15％的残留量其潜在危害是不能低估的。

上述最常用的两种血浆病毒灭活法(S/D灭活法、亚甲蓝光化学处理法)仅对有囊膜的病毒有灭活作用，而对于无囊膜的病毒则没有灭活作用；即用这两种方法处理后，血浆仍存在一定的病毒安全风险。

因此，对于血浆的病毒灭活方法，特别是能够对无囊膜病毒具有灭活作用的方法，在实际应用过程中存在较大的需求和改进空间。

针对S/D和亚甲蓝灭活病毒血浆存在的问题，本发明提供了一种更优选的血浆病毒灭活方法，期望为血浆的安全输注提供一套切实可行的解决方案。

三

发明内容

针对上述需要，发明人在研究血浆病毒灭活方法时发现了加入药用芦丁或芸香苷，能够增强UVC对病毒的灭活效果，特别是能够实现无囊膜病毒的有效灭活；进一步研究发现，在血浆中加入药用芦丁或芸香苷后，在有效灭活有囊膜病毒和无囊膜病毒的同时，对凝血因子的活性具有很强的保护作用。

UVC在芦丁或芸香苷协助作用下，可以使核酸产生缺口而无法完成复制，也可以使病毒的DNA、RNA的碱基生成二聚体或加成物而抑制病毒复制。灭活病毒下降的滴度与光辐射强度及辐照时间有关，针对不同种类的病毒，需要实验确定辐照强度和辐照时间。

另外芦丁或芸香苷还能够淬灭光化学反应产生的自由基以及OH^-和O^-等，从而可以有效保护凝血因子等比较敏感的生物活性蛋白不被破坏，有利于血浆凝血活性的保持。

此外在芦丁或芸香苷的协助下，相同的灭活效果UVC光处理的时间为亚甲蓝光化学法的处理时间明显缩短，仅为亚甲蓝光化学处理时间的1/6～1/10，进而克服了亚甲蓝光化学处理法产生的热效应问题。

具体地，本申请提供了一种新的血浆病毒灭活的方法，其特征在于，包括向血浆中加入中加入灭活增强剂和蛋白保护剂，混匀后置于UVC光源中进行光辐照处理。

进一步地，灭活增强剂和蛋白保护剂为：药用芦丁0.3g/L-0.8g/L

进一步地，灭活增强剂和蛋白保护剂为：芸香苷0.5mM-1.5mM

进一步地，UVC光辐照强度为：500～5000μw/cm²。

进一步地，UVC波长范围为190～280nm，优选为254nm。

进一步地，光辐照处理时间为：120～1200s。

光辐照强度与辐照处理时间是互为补充的，光辐照强度强则辐照处理时间短，反之光辐照强度弱则辐照时间增长。

根据本发明灭活试验的结果，血浆中的指示病毒经灭活处理后指示病毒下降滴度能够达到≥4logs以上。

另一方面，本申请提供了上述血浆病毒灭活方法在制备血液或血浆制品中的应用。

另一方面，本申请提供了使用上述血浆病毒灭活方法灭活病毒的血液或血浆制品。

本申请中的血浆可以为各种来源的血浆，包括但不限于人、猪、犬、鼠、牛、马等来源，采集途径可以为活体采集血液后制得或动物处死后取血制得。

本申请中的药用芦丁、芸香苷可以采用符合相关标准的国内或进口产品。优选符合注射液标准的产品。

本申请中的UVC光辐照处理可以使用市售的血浆病毒灭活仪，或各种市售或自制的能提供190～280nm波长、500～5000μw/cm²光照强度的设备。例如，发明人自制了带有螺旋状石英玻璃管的灭活设备，可以用于血浆的病毒灭活处理。

本申请的一种新的血浆病毒灭活法能有效灭活囊膜病毒和非囊膜病毒，同时减少蛋白，特别是凝血因子的损失。本申请方法中加入的低浓度药用芦丁或芸香苷均为注射液中常用成分，安全性较有保障，容易通过各种安全性评估；此外，本申请的方法中添加的低浓度药用芦丁或芸香苷本身即为对心血管疾病的辅助药物和营养增补剂，对人体没有毒性，也常用于食品添加剂，具有安全性高并且不用去除的优势。

四

具体实施方式

下面结合具体实施例详述本发明，但本发明的保护范围不局限于以下实施例。

实施例1主要试剂、原料和仪器

实验用血浆为新鲜冰冻犬血浆购自北京天勤一和生物科技有限公司；

伪狂犬病毒和脑心肌炎病毒购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；

PK-15和BHK-21细胞购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；

药用芦丁为四川协力制药股份有限公司生产；

芸香苷为SIGMA/MERCK生产；

血浆病毒灭活仪为中科世生(北京)医药科技有限公司研制；

其余试剂和仪器均为常规国产型号。

实施例2血浆的病毒灭活与检测

1染毒血浆制备：将冰冻血浆融化，取100ML置于血浆袋中，按比例加入药用芦丁或芸香苷，然后将指示病毒液与血浆按1:9的比例混匀；有囊膜指示病毒选择伪狂犬病毒(PRV)，无囊膜指示病毒选择脑心肌炎病毒(EMCV)。

2灭活过程：用25^#硅胶管将血浆袋与血浆病毒灭活仪的进样口连接，出样口同样用25^#硅胶管与血浆收集袋连接；开启UVC光源(UVC强度为：500-5000μw/cm²)待光照强度稳定后，开启蠕动泵电源，将染毒血浆泵入螺旋石英玻璃灭活管，使血浆在整个流程中完全接受辐照灭活病毒处理，血浆接受辐照处理的时间为120-1200s。

3收集灭活处理后的血浆，即为病毒灭活血浆，并分别取样备检。

4病毒的检测

(1)将检测用细胞以0.5～1.5×10⁵/mL的密度加入96孔细胞培养板，每孔100μL；培养板放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养12～24小时；

(2)将染毒后的血浆样品和病毒灭活处理后的血浆样品以及病毒阳性对照样品分别进行梯度连续稀释，稀释倍数为10倍，即：10^-1～10^-10；

(3)在细胞培养板的第2～11列加入10^-1～10^-10连续梯度稀释的病毒，每孔100μL；第1列和12列为正常细胞对照；

(4)培养板于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每日观察细胞病变，记录病变细胞孔数目，直至细胞对照孔内细胞无法维持正常形态。

(5)根据细胞病变达到50％以上的病变孔数，并计算各样品中残余病毒的滴度值(TCID₅₀)。

(6)根据公式：病毒滴度降低值＝零点对照病毒滴度-工艺处理后病毒滴度，计算染毒的血浆样品灭活病毒前后的病毒滴度降低值。

5凝血因子的检测：使用血凝仪检测凝血因子活性。

实施例3各组样品处理

由于篇幅原因，未展示所有比例浓度正交实验的组合，仅展示部分代表性结果以表示基本趋势。血浆均按比例分别进行染毒处理，每种样品中采用添加不同量的药用芦丁或芸香苷，并采用不同的辐照处理方式，分别验证对伪狂犬病毒和脑心肌炎病毒灭活效果。

1添加药用芦丁作为保护剂和增强剂的灭活处理方式如下：

(样品1)染毒血浆中加入芦丁注射液0.3g/L，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为500μw/cm²，辐照处理1200s。

(样品2)染毒血浆中加入芦丁注射液0.3g/L，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为5000μw/cm²，辐照处理120s。

(样品3)染毒血浆中加入芦丁注射液0.5g/L，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为500μw/cm²，辐照处理1200s。

(样品4)染毒血浆中加入芦丁注射液0.5g/L，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为5000μw/cm²，辐照处理120s。

(样品5)染毒血浆中加入芦丁注射液0.8g/L，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为500μw/cm²，辐照处理1200s。

(样品6)染毒血浆中加入芦丁注射液0.8g/L，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为5000μw/cm²，辐照处理120s。

2添加芸香苷作为保护剂和增强剂的灭活处理方式如下：

(样品7)染毒血浆中加入芸香苷0.5mM，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为500μw/cm²，辐照处理1200s。

(样品8)染毒血浆中加入芸香苷0.5mM，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为5000μw/cm²，辐照处理120s。

(样品9)染毒血浆中加入芸香苷1.0mM，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为500μw/cm²，辐照处理1200s。

(样品10)染毒血浆中加入芸香苷1.0mM，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为5000μw/cm²，辐照处理120s。

(样品11)染毒血浆中加入芸香苷1.5mM，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为500μw/cm²，辐照处理1200s。

(样品12)染毒血浆中加入芸香苷1.5mM，混匀后放入灭活仪中，在光照强度为5000μw/cm²，辐照处理120s。

实施例4各组样品检测结果

对实施例3中的样品分别进行残余病毒检测和凝血因子活性测定，各组样品检测结果如下表所示：

表1：添加药用芦丁作为保护剂和增强剂的各组样品中残余病毒检测结果

结果显示(表1)，以不同添加量的药用芦丁作为灭活增强剂，在辐照强度为：500-5000μw/cm²，辐照处理的时间为120s-1200s的范围内可以灭活有囊膜的指示病毒PRV和无囊膜的指示病毒EMCV，低剂量的药用芦丁虽然有病毒残留但是其灭活处理后的滴度降低值均≥4logs，从表1可以看出，药用芦丁的添加量优选为0.5g/L。

表2：添加药用芦丁作为保护剂和增强剂的各组样品灭活后凝血因子检测结果

活化部分凝血活酶时间：主要反映内源性凝血系统及相关凝血因子的状况，正常血浆的活化部分凝血活酶时间为25～37秒之间；凝血酶原时间：主要反映外源性凝血系统及相关凝血因子的状况，正常血浆的凝血酶原时间为11～14秒之间；凝血酶时间：主要反映纤维蛋白原转为纤维蛋白的时间，也就是反映凝血因子Ⅰ的含量及活性指标，正常血浆的凝血酶时间为12～16秒之间。

从检测结果(表2)可以看出，添加了药用芦丁作为辐照保护剂能够有效保护血浆中凝血因子的活性，辐照后各项指标虽然有所降低，但是基本还能保持在正常水平的范围，说明药用芦丁对凝血因子具有较好的保护作用。

表3：添加芸香苷作为保护剂和增强剂的各组样品中残余病毒检测结果

结果显示(表1)，以不同添加量的芸香苷作为灭活增强剂，在辐照强度为：500-5000μw/cm²，辐照处理的时间为120-1200s的范围内可以灭活有囊膜的指示病毒PRV和无囊膜的指示病毒EMCV，从表1可以看出，芸香苷的添加量优选为1.0mM。

表4：添加芸香苷作为保护剂和增强剂的各组样品灭活后凝血因子检测结果

活化部分凝血活酶时间：主要反映内源性凝血系统及相关凝血因子的状况，正常血浆的活化部分凝血活酶时间为25～37秒之间；凝血酶原时间：主要反映外源性凝血系统及相关凝血因子的状况，正常血浆的凝血酶原时间为11～14秒之间；凝血酶时间：主要反映纤维蛋白原转为纤维蛋白的时间，也就是反映凝血因子Ⅰ的含量及活性指标，正常血浆的凝血酶时间为12～16秒之间。

从检测结果可以看出，添加了芸香苷作为辐照保护剂能够有效保护血浆中凝血因子的活性，辐照后各项指标虽然有所降低，但是基本还能保持在正常水平的范围，说明芸香苷对凝血因子具有较好的保护作用。