阅读说明：本技术 一种低谷蛋白稻米组分蛋白的提取方法 (Method for extracting component protein of low-gluten rice ) 是由 李天� 兰艳 隋晓东 刘泉 涂云彪 孙影影 王锦 龚静 吴超越 于 2019-05-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种低谷蛋白稻米组分蛋白的提取方法,包括以下步骤：1)准确称取精米粉,水浴振荡浸提,以6000rpm转速离心10min,收集上清液,为清蛋白溶液；2)将步骤(1)提取过的稻米中加入氯化钠溶液,水浴振荡浸提,以6000rpm转速离心10min,收集上清液,为球蛋白溶液；3)将步骤(2)提取后稻米加入乙醇溶液,水浴振荡浸提,以6000rpm转速离心10min,收集上清液,为醇溶蛋白溶液；4)将步骤(3)提取后稻米加入氢氧化钠溶液,水浴振荡浸提,以6000rpm转速离心10min,收集上清液,为谷蛋白溶液。该方法操作简单,为低谷蛋白功能稻的综合评价提供一定的理论依据。(The invention discloses a method for extracting component protein of low-gluten rice, which comprises the following steps: 1) accurately weighing fine rice flour, extracting in water bath under oscillation, centrifuging at 6000rpm for 10min, and collecting supernatant as albumin solution; 2) adding a sodium chloride solution into the rice extracted in the step (1), carrying out water bath oscillation leaching, centrifuging at 6000rpm for 10min, and collecting supernatant as a globulin solution; 3) adding the rice extracted in the step (2) into an ethanol solution, carrying out water bath oscillation extraction, centrifuging at 6000rpm for 10min, and collecting supernatant as an alcohol soluble protein solution; 4) and (4) adding the rice extracted in the step (3) into a sodium hydroxide solution, carrying out water bath oscillation leaching, centrifuging at the rotating speed of 6000rpm for 10min, and collecting the supernatant as a gluten solution. The method is simple to operate, and provides a certain theoretical basis for the comprehensive evaluation of the low-gluten functional rice.)

一种低谷蛋白稻米组分蛋白的提取方法

技术领域

本发明属于蛋白质组学提取技术领域，具体涉及一种低谷蛋白稻 米组分蛋白的提取方法。

背景技术

水稻籽粒中含有7％-10％的蛋白质，一般糙米的蛋白质含量约为 8％，精米约7％。根据蛋白质的不同溶解性，可将其分为四类：水溶 性的清蛋白(albumin)、盐溶性的球蛋白(globulin)、醇溶性的醇溶蛋 白(prolamin)和碱溶性的谷蛋白(gluten)，它们在稻米蛋白质中所占 的比例分别为5％、10％、5％和80％。清蛋白和球蛋白主要储存在果 皮、糊粉层和胚等组织中，而醇溶蛋白和谷蛋白主要储存在胚乳中。 谷蛋白储藏在蛋白体PB-II中易被人体的胃消化吸收，而醇溶蛋白积 淀在蛋白体PB-I内，不能被胃消化吸收，所以人体主要吸收谷蛋白。 糖尿病和肾脏病病人由于肾功能出现障碍，不能食用可溶性蛋白质含量超过4％的大米。低谷蛋白水稻是一种可吸收蛋白(指清蛋白、球蛋 白、谷蛋白之和)只有3.1％-4％的水稻品种，也叫低水溶性稻米。患者 食用等量的低谷蛋白大米后，人体不会因摄入过量热量而使血糖、血 脂升高，能有效预防、辅助治疗糖尿病和肾病。

有研究认为水稻籽粒中蛋白质组分在基因型间存在显著差异。近 年来，随着肾脏病人和并发肾脏机能损害的糖尿病患者人数的不断增 加，适合这类特殊人群的功能稻市场需求越来越大。目前国内关于低 谷蛋白水稻的研究在育种及栽培方面取得了一定的进展，但关于其组 分蛋白的测定一直延用普通稻米的连续提取法。而低谷蛋白稻米中各 蛋白组分的含量与普通稻米相差甚远，普通稻米的提取条件并不适合。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低谷蛋白稻米组分蛋白的提取方法， 为低谷蛋白功能稻的综合评价提供一定的理论依据。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种低谷蛋白稻米组分蛋白的提取方法，包括以下步骤：

1)准确称取精米粉，恒温水浴摇床振荡浸提，以6000rpm转速 离心10min，收集上清液，为清蛋白溶液；

2)将步骤(1)提取过的稻米中加入氯化钠溶液，恒温水浴摇床 振荡浸提，以6000rpm转速离心10min，收集上清液，为球蛋白溶液；

3)将步骤(2)提取后稻米加入乙醇溶液，恒温水浴摇床振荡浸 提，以6000rpm转速离心10min，收集上清液，为醇溶蛋白溶液；

4)将步骤(3)提取后稻米加入氢氧化钠溶液，恒温水浴摇床振 荡浸提，以6000rpm转速离心10min，收集上清液，为谷蛋白溶液。

进一步的，步骤(1)中料液质量比为1:22，提取温度为31.6℃， 提取时间43min，提取次数3次。

进一步的，步骤(2)中料液质量比为1:20，提取温度为33.1℃， 提取时间为22min，提取次数3次。

进一步的，步骤(3)中料液质量比为1:21，提取温度为34.6℃， 提取时间为40min，提取次数2次。

进一步的，步骤(4)中料液质量比为1:16，提取温度为34.7℃， 提取时间为22min，提取次数3次。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种低谷蛋白稻米组分蛋白的提取方法，该方法操 作简单，可以分别提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，且互不 干扰，具有推广使用价值。

附图说明

图1是不同提取剂浓度对各组分蛋白含量的影响；A为球蛋白， B为醇溶蛋白，C为谷蛋白；

图2是料液比对各组分蛋白含量的影响；A为清蛋白，B为球蛋 白，C为醇溶蛋白，D为谷蛋白；

图3是温度对各组分蛋白含量的影响；A为清蛋白，B为球蛋白， C为醇溶蛋白，D为谷蛋白；

图4是提取时间对各组分蛋白含量的影响；A为清蛋白，B为球 蛋白，C为醇溶蛋白，D为谷蛋白；

图5是提取次数对各组分蛋白含量的影响；A为清蛋白，B为球 蛋白，C为醇溶蛋白，D为谷蛋白；

图6是4因素交互作用对清蛋白含量影响的3D响应面图(A-D、 C-D、B-C、B-D、A-B、A-C)；

图7是4因素交互作用对球蛋白含量影响的3D响应面图(A-D、 C-D、B-C、B-D、A-B、A-C)；

图8是4因素交互作用对醇溶蛋白含量影响的3D响应面图(A-D、C-D、B-C、B-D、A-B、A-C)；

图9是4因素交互作用对谷蛋白含量影响的3D响应面图(A-D、 C-D、B-C、B-D、A-B、A-C)。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在 没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明 保护的范围。

1材料与方法

1.1材料与试剂

选取在相同大田栽培条件下,低谷蛋白稻米(D105)为材料，稻谷收 获风干并存放三个月，加工成精米粉碎过筛后烘干供测试用。

G250、牛血清蛋白标准品、无水乙醇、氯化钠(AR)、磷酸(AR)、 氢氧化钠(AR)均购于四川杜瑞特科技有限公司。

1.2仪器与设备

粉碎机(运邦YB-750A)，恒温水浴振荡摇床(THZ-82A)，离心机 (ThermoSCIENTIFIC SORVALL BIOFUGE STRATOS Centrifuge)，双光束 紫外分光光度仪(德国Analytik Jena Specord 200Plus)，超纯水机(优 普ULUP系列)，BT-124S型电子天平(德国Sartorius公司)。

1.3试验方法

1.3.1提取剂浓度筛选试验

以各组分蛋白含量为指标，考察提取剂浓度：球蛋白提取剂氯化 钠溶液(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mol/L)、醇溶蛋白提取剂乙醇 (70％、75％、80％、85％、90％)、谷蛋白提取剂氢氧化钠溶液(0.02、 0.04、0.06、0.08、0.09、0.1mol/L)对各组分蛋白含量的影响，并固 定温度35℃，时间30min，提取3次。

1.3.2组分蛋白含量测定

稻米中组分蛋白提取量的测定采用G250显色法，取待测液1mL， 加4mLG250试剂，摇匀，静置5min，于595nm检测吸光值。以牛 血清蛋白标准液浓度为x轴、吸光度为y轴，绘制标准曲线。

各组分蛋白含量的计算＝样品液中蛋白质量浓度×待测液体积×定 容体积/称取米粉质量/1000。

1.3.3稻米中各组分蛋白的提取

采取连续提取法对稻米组分蛋白进行提取，略有改动。准确称取 精米粉0.300g，先加入水，恒温水浴摇床(190rpm)振荡浸提，6000 转离心10min，收集上清液后定容，为清蛋白的待测液；对提取过清 蛋白的样品中再加入氯化钠溶液，恒温水浴摇床(190rpm)振荡浸 提，6000转离心10min，收集上清液后定容，为球蛋白的待测液； 对提取过球蛋白的样品加入乙醇溶液，同理按照上述步骤进行，收集 上清液，定容，为醇溶蛋白待测液；对提取过醇溶蛋白的样品中加入 氢氧化钠溶液，按上述步骤进行，收集上清液，定容，为谷蛋白待测液。按1.3.2方法测定并计算稻米中各组分蛋白的含量的测定。

1.3.4单因素试验

以各组分蛋白含量为指标，考察料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、 1:30，固定温度35℃，时间40min，提取3次)、提取温度(25、30、 35、40、45℃，固定料液比1:20，时间40min，提取3次)、提取时 间(20、40、60、80、100min，固定料液比1:20，温度35℃，提取 3次)、提取次数(2、3、4、5、6，固定料液比1:20，温度35℃，时 间40min)、4个因素对各组分蛋白含量的影响。

1.3.5响应面优化试验方法

在单因素试验结果的基础上，采用Design-Expert11(RSM)软件 设计试验条件，选用Box-Behnken(BB)模型，以各组分蛋白含量为 响应值，料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、提取次数(D) 为自变量，设计4因素3水平响应面试验(表1)。

表1因素水平编码表

1.4数据处理

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 17.0、Design expert 11、SAS 9.4 对实验数据进行统计分析处理。所有试验均重复三次。

2结果和分析

2.1提取剂浓度筛选的试验结果

2.1.1氯化钠浓度对球蛋白含量的影响

由图1A可知，随着氯化钠浓度的增大，球蛋白含量逐渐增加， 当氯化钠浓度为0.6mol/L时，含量达到6.29mg/g，浓度继续增大， 含量却逐渐下降。这可能是较高浓度的盐离子造蛋白质的部分沉淀， 降低球蛋白的提取量。因此，选择氯化钠浓度为为0.6mol/L。

2.1.2乙醇浓度对醇溶蛋白含量的影响

由图1B可知，随着乙醇浓度的增大，醇溶蛋白含量逐渐增加， 当乙醇浓度为80％时，含量达到4.13mg/g，浓度继续增大，含量 却逐渐下降。这可能是较高乙醇浓度造成蛋白质的结构的破坏，造成 部分沉淀，从而降低了醇溶蛋白的提取量。因此，选择乙醇浓度为80％。

2.1.3氢氧化钠浓度对谷蛋白含量的影响

由图1C可知，随着氢氧化钠浓度的增大，谷蛋白含量逐渐增加， 当氢氧化钠浓度为0.04mol/L时，含量达到14.15mg/g，浓度继续 增大，含量却逐渐下降。这可能是氢氧化钠会与蛋白质发生一定反应， 在较高浓度下会降低蛋白质的溶解性，从而降低了谷蛋白的提取量。 因此，选择氢氧化钠浓度为0.04mol/L。

2.2单因素试验结果

2.2.1料液比对各组分蛋白含量的影响

由图2可知，随着液料比的增加，四种组分蛋白提取量增加，清 蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白分别在液料比为1:20，1:20，1:25， 1:15达到最大值5.59mg/g，15.27mg/g，4.19mg/g，20.26mg/g。当提 取液料比超过最大提取值的液料比时，四种组分蛋白提取量逐渐降低。 这可能由于液料比为1:20，1:20，1:25，1:15时，稻米四种蛋白已基 本溶出，液料比继续增加，可溶性杂质增多，降低蛋白的对溶剂的亲 和，降低提取量。因此，响应面分析时选择清蛋白：1:15、1:20、1:25； 球蛋白：1:15、1:20、1:25；醇溶蛋白：1:20、1:25、1:30；谷蛋白： 1:10、1:15、1:20为合适的液料比。

2.2.2提取温度对各组分蛋白含量的影响

由图3可知，当时间为25～40℃时，四种组分蛋白提取量增 加，清蛋白、球蛋白、醇溶都在35℃达到最大值4.59mg/g(清蛋 白)，10.29mg/g(球蛋白)，2.49mg/g(醇溶蛋白)，谷蛋白在40℃ 达到最大值19.68mg/g。当提取温度超过35℃(清蛋白，醇溶蛋白， 球蛋白)和40℃(谷蛋白)时，四种组分蛋白提取量逐渐降低。这 可能是由于试验中一定的温度(35，40℃)可以加快分子间的运动， 提高提取量，但超过一定温度(35，40℃)时，可能会影响蛋白的结 构，造成蛋白从溶液中析出，降低提取量。因此，响应面分析时选择 清蛋白：30、35、40℃；球蛋白：30、35、40℃；醇溶蛋白：30、 35、40℃谷蛋白：35、40、45℃为合适的温度。

2.2.3提取时间对各组分蛋白含量的影响

由图4可知，当时间为20～60min时，清蛋白和醇溶蛋白提取 量增加，在40min达到最大值4.49mg/g，2.49mg/g。当时间为20 min时谷蛋白和球蛋白的提取达到最大值20.44mg/g，9.26mg/g。 当提取时间超过40min(清蛋白，醇溶蛋白)和20min(谷蛋白，球 蛋白)时，四种组分蛋白提取量逐渐降低。这可能在40min和20min 时稻米四种蛋白已基本溶出，提取时间继续增加，蛋白质发生部分的 沉淀，降低提取量。因此，响应面分析时选择清蛋白：20、40、60min； 球蛋白：10、20、30min；醇溶蛋白：20、40、60min谷蛋白：10、 20、30min为合适的时间。

2.2.4提取次数对各组分蛋白含量的影响

由图5可知，提取次数为2～4次时，清蛋白、球蛋白和谷蛋白 提取量增加，在提取次数为3次时达到最大值4.59mg/g，10.29mg/g， 21.79mg/g。当提取次数为2次时，醇溶的含量达到最大值1.70mg/g。 当提取次数超过3次时(清蛋白，球蛋白，谷蛋白)和2次时(醇 溶蛋白)，四种组分蛋白提取量逐渐降低。这可能在提取3次和提取 2次时稻米四种蛋白已基本溶出，随着提取次数继续增加，其他物质 溶出量增加，使得最终样品液中的蛋白发生部分的析出，降低提取量。 因此，响应面分析时选择清蛋白：2、3、4次；球蛋白：2、3、4次； 醇溶蛋白：1、2、3次谷蛋白：2、3、4次为合适的的提取次数。

2.3响应面试验结果及分析

2.3.1响应面试验设计及结果

基于单因素试验结果拟确定的最佳条件，以稻米中各蛋白组分对 应的提取条件：料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)和提取 次数(D)为自变量，以为响应值(组分蛋白的含量)为因变量，设 计4因素3水平响应面试验，结果见表2。对表2中的结果进行多元 线性回归拟合，得到稻米中各蛋白组分含量对其相应提取的料液比 (A)、提取温度(B)、提取时间(C)、提取次数(D)的二次多项回 归方程模型结果如下：

清蛋白：Y＝1.5813A+0.7815B+0.0055C+3.1192D-0.0126AB+0.00 41AC-0.0615AD+0.0019BC+0.0120BD+0.0044CD-0.0272A²-0.0010B²- 0.0020C²-0.3854D²-29.9904

球蛋白：Y＝0.0608A-0.6058B+0.2492C+0.0892D+0.2000AB-0.335 0AC+0.2475AD+0.0200BC+0.4075BD+0.2825CD-0.5525A²-0.8350B²- 0.7850C²-0.8250D²+10.18

醇溶蛋白：

Y＝0.1575-0.0192B-0.0117C+0.005D-0.1200AB-05075AC+0.0850 AD+0.0375BC+0.055BD+3600CD-0.5666A²-0.2516B²-0.4054C²-0.3229 D²+2.33

谷蛋白：

Y＝0.6967A-0.3917B+0.4542C+0.6792D-0.0025AB+0.7450AC-0.3 025AD+0.7900BC+0.1225BD-0.0275CD-2.47A²-0.186B²-1.15C²-2.03D ²+23.10

表2响应面分析方案

2.3.2回归模型的方差分析与显著性检验

利用Design-Expert 8.0软件对回归模型进行方差分析(analysis of variance,ANOVA)(表3、4、5)，确定各因素对稻米组分蛋白提取的 影响程度，同时也检验回归方程的失拟行。从表3、4、5可知，经 RSM四种组分蛋白获得的模型极显著(P<0.01)，失拟项P值为0.1038 (清蛋白)、0.3441(球蛋白)、0.1234(醇溶蛋白)、0.2718(谷蛋白)， P值均大于0.05，失拟均不显著；相关系数R²＝0.8969(清蛋白)、0.8374 (球蛋白)、0.8569(醇溶蛋白)、0.9000(谷蛋白)，说明该模型拟合 度较好。因此，表明建立的数学模型成功拟合试验数据，在一定范围 内对稻米中各组分蛋白提取量具有较好的预测性。

表3清蛋白响应面回归模型方差分析

各因素对稻米各组分蛋白含量显著性分析可以看出，清蛋白：A、 AC、B、C、D、AD、A²、B²、C²、D²的P值小于0.01，AB的P值 小于0.05，且根据F值的大小，可以得出四个因素对清蛋白提取量的 影响大小为C>A>B>D；球蛋白：B、A²、B²、C²、D²的P值小于0.01， C、BD的P值小于0.05，且根据F值的大小可以得出四个因素对球 蛋白的提取量的影响大小为B>C>D>A，且D、A对球蛋白的提取的 影响未达到显著水平，表明D、A对球蛋白的提取影响较B、C小； 醇溶蛋白：A、CD、A²、B²、C²、D²的P值小于0.01，，且根据F值 的大小可以得出四个因素对球蛋白的提取量的影响大小为A>B>C>D， 且D、B、C对醇溶蛋白的提取的影响未达到显著水平，表明D、B、 C对醇溶蛋白的提取影响较A小；谷蛋白：A、D、A²、B²、C²、D²的P值小于0.01，AC、BC、B、C的P值小于0.05，且根据F值的 大小可以得出四个因素对谷蛋白的提取量的影响大小为A>D>C>B。 各模型的显著性分析也表明各因素对提取的组分蛋白含量的影响并 不是一般的线性关系。

表4醇溶蛋白响应面回归模型方差分析

表5谷蛋白响应面回归模型方差分析

2.3.3响应面分析

根据试验结果，利用Design-Expert11软件作图，得到四种组分 蛋白在不同提取条件下四个因素交互作用的响应面(图6、图7、图 8、图9)，可直观反映各因素的交互作用。响应曲面越平缓反应响应 值对于因素的改变越不敏感，反之，响应面越陡峭，响应值对于因素 的改变越敏感。清蛋白：料液比和提取温度、提取次数、提取时间的 交互曲面陡峭，交互作用显著(图6)，提取温度与提取时间，提取 次数，交互面平缓，交互作用不显著，提取时间和提取次数交互面也 平缓，交互作用不显著，与方差分析结果一致。球蛋白：提取温度和提取次数的，交互曲面陡峭，交互作用显著，其余各因素间的交互曲 面平缓，交互作用不显著。与方差分析结果一致(图7)。醇溶蛋白： 提取时间和提取次数的交互曲面陡峭，交互作用显著，其余各项的交 互曲面平缓，交互作用不显著，与方差分析结果一致(图8)。谷蛋白：料液比与提取时间、提取温度与提取时间、提取时间与提取次数 的交互曲面陡峭，交互作用显著，其余各项的交互曲面平缓，交互作 用不显著，与方差分析结果一致(图9)。随着各因素值的增大，响 应值逐渐增大，但当响应值达到最大值之后，随着各因素值的继续增高，响应值则逐渐降低。

2.3.4验证试验

根据试验所建立的模型，得到各组分蛋白的提取最佳条件为，清 蛋白：液料比1:21.64，提取温度31.57℃，提取时间43.42min，提 取次数3.06次，球蛋白：液料比1:19.65，提取温度33.1℃，提取时 间21.6min，提取次数2.97次，醇溶蛋白：液料比1:20.75，提取温度34.63℃，提取时间21.6min，提取次数2.01次，谷蛋白：料比 1:15.83，提取温度34.7℃，提取时间22.35min，提取次数3.15次。 提在此条件下各组分蛋白的提取量分别为为4.34mg/g，10.31mg/g， 2.34mg/g，23.27mg/g。

考虑到试验操作的可行性，将优化的提取条件修改为，清蛋白： 料液比1:22、提取温度31.6℃、提取时间43min，提取次数3次， 球蛋白：料液比1:20、提取温度33.1℃、提取时间22min，提取次 数3次，醇溶蛋白：料液比1:21、提取温度34.6℃、提取时间40min， 提取次数2次，谷蛋白：料液比1:16、提取温度34.7℃、提取时间 22min，提取次数3次。在此些条件下进行3次重复试验，稻米各 组分蛋白的平均提取量，清蛋白：4.26mg/g,球蛋白：9.76mg/g，醇 溶蛋白：2.27mg/g，谷蛋白：23.60mg/g，与预测值的相对误差为 0.0187(清蛋白),0.0563(球蛋白),0.0308(醇溶蛋白),0.014(谷 蛋白)，表明响应面法优化所得最提取艺条件较好，具有应用价值。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术 人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这 些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利 要求及其等同物限定。