阅读说明：本技术 一种金叶银中杨的创制方法 (Method for creating Chinese poplars with golden leaves ) 是由 李艺迪 姜静 刘桂丰 冮慧欣 陈肃 顾宸瑞 李慧玉 黄海娇 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种金叶银中杨的PaGLK基因及应用,其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。还公开金叶银中杨的创制方法,包括：克隆PaGLK基因；根据该基因保守序列设计特异性引物Ⅰ和特异性引物Ⅱ,PCR扩增分别获取靶向DNA序列和靶向DNA反向互补序列；将pFGC5941载体和靶向DNA序列分别双酶切后,连接获取pFGC5941-Cis载体；将pFGC5941-Cis载体和靶向DNA反向互补序列分别双酶切后,连接获取pGLK-RNAi载体,将该载体采用农杆介导法转化到银中杨中,获得金叶银中杨。通过构建含PaGLK基因表达载体,使PaGLK基因在转基因银中杨中低量表达,叶片呈黄色,为育种提供基础。(The invention discloses a PaGLK gene of Populus tremuloides and application thereof, wherein the nucleotide sequence of the PaGLK gene is shown as SEQ ID NO: 1 is shown. Also discloses a method for creating the populus tremuloides, which comprises the following steps: cloning the PaGLK gene; designing a specific primer I and a specific primer II according to the gene conserved sequence, and respectively obtaining a target DNA sequence and a target DNA reverse complementary sequence by PCR amplification; performing double enzyme digestion on the pFGC5941 vector and the target DNA sequence respectively, and connecting to obtain a pFGC5941-Cis vector; and performing double enzyme digestion on the pFGC5941-Cis vector and the reverse complementary sequence of the target DNA respectively, connecting to obtain a pGLK-RNAi vector, and transforming the vector into the populus tremuloides by adopting a crop-stem-mediated method to obtain the populus tremuloides. By constructing an expression vector containing the PaGLK gene, the PaGLK gene is expressed in transgenic populus argentifolia at low level, leaves are yellow, and a foundation is provided for breeding.)

一种金叶银中杨的创制方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种金叶银中杨的创制方法。

背景技术

银中杨(Populus alba×P.berolinensis)是东北地区阔叶树种之一，但由于随着社会进步和经济发展，人们对城市园林植物色彩的要求愈来愈高，传统的绿化植物材料品种单一，绿化景观单调，已经远远不能满足群众的需要满足日益增长的社会需求。因此，开展银中杨基因工程育种研究势在必行。目前，采用农杆菌介导法已获得了抗虫、抗旱耐盐的转基因银中杨，但彩叶植物正是以其花朵一样绚丽的叶色，极大丰富了城市的景观层次，成为目前园林绿化、美化的新宠，近年来彩叶植物成为园林植物设计中研究的重点。树木叶片细胞内的色素包括叶绿素、花青素和类胡萝卜素，这几种色素在细胞中所占的分量和位置决定着叶子的颜色。当叶绿素在叶片色素中所占的比重较大时，叶片呈现绿色；花青素所占的比重较大时，叶片呈现红色；类胡萝卜素所占的比重较大时，叶片呈现橙或黄色。还有的是叶片的某一部分色素的含量大，如叶子的上部或下部，这样就成了彩叶植物。总之，该创制方法在园林植物配置中，可以丰富构图、调整色彩、形成绚丽的图案和不同的季相结果。在目前城市绿化中成为新宠，发展前景广阔。

鉴于构建彩色植物的需求，而现有技术中目前又尚无利用基因工程构建彩色银中杨的相关报道，因此，本发明研究了一种金叶银中杨的创制方法，为育种银中杨新品种提供了基础。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种金叶银中杨的PaGLK基因，该基因调控叶片颜色。

本发明还有一个目的是提供一种金叶银中杨表达载体pGLK-RNAi，其携带PaGLK基因转入银中杨中，并使PaGLK基因低量表达，叶片呈现黄色。

本发明还有一个目的是提供一种金叶银中杨的创制方法，通过构建pGLK-RNAi载体，采用农杆菌介导法将该载体导入银中杨，使得转基因银中杨中的PaGLK基因低量表达，叶片呈现黄色，创制银中杨新品种。

本发明还有一个目的是提供一种所述的金叶银中杨PaGLK基因的应用，创制具有黄色叶片的银中杨。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种金叶银中杨的PaGLK基因，所述PaGLK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种由权利要求1所述的金叶银中杨的PaGLK基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供一种金叶银中杨表达载体pGLK-RNAi，包含权利要求1所述的PaGLK基因。

本发明还提供一种金叶银中杨的创制方法，包括以下步骤：

步骤1：提取野生型银中杨的RNA，并以反转录的cDNA为模板，克隆获取如权利要求1所述的PaGLK基因；步骤2：根据所述PaGLK基因的保守序列设计特异性引物Ⅰ和特异性引物Ⅱ，经PCR扩增，分别获取靶向DNA序列和靶向DNA反向互补序列；

步骤3：将pFGC5941载体和所述靶向DNA序列分别用NcoI和AscI酶切后，再用连接酶连接，获取pFGC5941-Cis载体；

将所述pFGC5941-Cis载体和所述靶向DNA反向互补序列分别用XbaI和BamHI酶切后，再用连接酶连接，获取pGLK-RNAi载体；

步骤4：将所述pGLK-RNAi载体采用农杆介导法转化到银中杨中，获得金叶银中杨；

其中，所述特异性引物Ⅰ包含特异性靶向DNA的正向引物如SEQ ID NO：2所示和反向引物如SEQ ID NO：3所示；所述特异性引物Ⅱ包含特异性靶向DNA反向互补序列的正向引物如SEQ ID NO：4所示和反向引物如SEQ ID NO：5所示。

优选的是，所述特异性引物ⅠPCR用20μL扩增体系：pfu Buffer2μL、dNTP Mix 2μL、特异性靶向DNA的正向引物0.4μL、特异性靶向DNA的反向引物0.4μL、pfu DNA polymerase0.4μL、DNA 0.5μL以及余量灭菌水；

扩增程序：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃1min，40个循环；72℃3min；16℃保温。

优选的是，所述特异性引物Ⅱ的PCR用20μL扩增体系：pfu Buffer2μL、dNTP Mix 2μL、特异性靶向DNA反向互补序列的正向引物0.4μL、特异性靶向DNA反向互补序列的正向引物0.4μL、pfu DNA polymerase 0.4μL、DNA 0.5μL以及余量灭菌水；

扩增程序：95℃1min；95℃20s，55℃20s，72℃1min，40个循环；72℃3min；16℃保温。

优选的是，步骤4中所述pGLK-RNAi载体采用农杆介导法转化到银中杨，其包含以下步骤：

S1：选取银中杨无菌生根苗叶片作为转基因受体，接种至分化培养基，预培养2-3d；

S2：预培养结束前一天，将含所述pGLK-RNAi的工程菌按体积分数为2％接种于含抗菌素的LB培养液中，28℃，180rpm培养过夜，收取培养物并转入无抗菌素的LB培养液中，继续培养3-4h，获取工程菌液；

S3：将S1预培养的叶片用S3所得的工程菌液浸染，再将叶片上菌液吸走后，将所述叶片接种于分化培养基上，共培养2d；

S4：将共培养的叶片转接至选择培养基，进行选择培养，15d后切口处形成抗性愈伤组织；将所述抗性愈伤组织切下并转接到新的选择培养基中继续筛选，25d后获得不定芽；将所述不定芽转接到生根培养基中进行生根培养，15d后长处不定根，即获得转基因银中杨。

优选的是，S3中所述分化培养基包含以下组分：MS+TDZ0.1mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L；

所述共培养的条件为：28℃黑暗培养。

优选的是，S4中所述选择培养基包含以下组分：MS+TDZ0.1mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L+头孢霉素200mg/L+除草剂1mg/L；

所述生根培养基包含以下组分：1/4MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L。

本发明还提供一种所述的金叶银中杨PaGLK基因的应用，定性干扰PaGLK基因表达，转基因银中杨呈现黄色叶片。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明基于金叶银中杨PaGLK基因的核苷酸序列，通过构建含有PaGLK基因的植物表达载体pGLK-RNAi载体，该载体是以pFGC5941载体为基本骨架(图1)，在CHSA intron上游***GLK靶向DNA序列，CHSA intron下游***GLK靶向DNA反向互补序列获得的。利用农杆菌介导法，进行银中杨叶片的遗传转化，并从基因水平和叶色性状上进行分析，结果显示：转基因银中杨中的PaGLK基因低量表达，且叶片呈现黄色，说明银中杨PaGLK基因参与调控叶片的颜色，这为银中杨新品种的培育提供基础。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明pFGC5941载体图谱；

图2为本发明pGLK-RNAi干扰表达载体示意图；

图3为本发明银中杨pGLK-RNAi干扰表达株系的获得过程示意图，其中，A：农杆菌侵染后的选择培养；B：转pGLK-RNAi银中杨抗性愈伤；C：转pGLK-RNAi银中杨抗性不定芽；D：移栽的pGLK-RNAi银中杨；E：移栽3个月的pGLK-RNAi银中杨；

图4为本发明银中杨pGLK-RNAi干扰表达株系，其中，A：(左为野生型银中杨叶片WT；右为转基因银中杨株系叶片)；B：由左至右1为野生型银中杨株系WT；2-4为转基因银中杨株系；

图5为本发明pFGC5941-Cis农杆菌菌液PCR电泳图谱；M：DNA Maker DL2000；1：pFGC5941-Cis质粒；2：水；3-5：挑取的3个单克隆；

图6为本发明pGLK-RNAi农杆菌菌液PCR电泳图谱；M：DNA Maker DL2000；1：pGLK-RNAi质粒；2：水；3-5：挑取的3个单克隆。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

1、克隆获得PaGLK基因序列

提取野生型银中杨叶片(东北林业大学育种基地采集)RNA，以反转录的cDNA为模板，经PCR扩增，获得PaGLK基因序列(如SEQ ID NO：1所示)。其中扩增所用引物如下所示：

PaGLK-F：5′-GGGGTACCATGCAAAACACTGCAACCAC-3′

PaGLK-R：5′-GCTCTAGACGTTGGTGGTATCTTTGGAACT-3′

2、设计PaGLK-RNAi载体构建引物

根据获取的PaGLK基因的保守序列，选取200bp序列，作为RNAi载体中的靶向序列，分别设计如表1的引物序列。

表1 pGLK-RNAi载体构建引物

以表1中的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3为引物，扩增获取带有NcoI和AscI酶切位点的靶向DNA序列；以表1中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为引物，扩增获取带有XbaI和BamHI酶切位点的靶向DNA反向互补序列。

其中，用特异性引物Ⅰ获得靶向DNA序列的扩增体系如表2所示，扩增条件如表3所示；

表2 特异性引物Ⅰ扩增体系

表3 特异性引物Ⅰ扩增条件

特异性引物Ⅱ获得靶向DNA反向序列的扩增体系如表4所示，扩增程序如表5所示。

表4 特异性引物Ⅱ扩增体系

表5 特异性引物Ⅱ扩增条件

3、pFGC5941-Cis载体的获得

pFGC5941载体(如图1所示)和上述所得靶向DNA序列分别用NcoI和AscI酶切后，再用T4DNA连接酶连接酶切后的pFGC5941载体与PaGLK靶向DNA目的片段，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，放到28℃培养箱进行培养。挑取单个菌落并进行富集培养，用质粒提取试剂盒(Biospin Plasmid DNA Extraction Kit)由BioFlux公司生产，提取重组载体质粒进行测序。

4、pGLK-RNAi载体的获得

测序正确的pFGC5941-Cis载体和上述所得靶向DNA反向互补序列分别用XbaI和BamHI的酶切，用T4DNA连接酶连接酶切后的pFGC5941-Cis载体与靶向DNA反向互补序列目的片段，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，放到28℃培养箱进行培养。挑取单个菌落并进行富集培养，挑取单个菌落并进行富集培养，用质粒提取试剂盒(BiospinPlasmid DNA Extraction Kit)由BioFlux公司生产，提取重组载体质粒进行测序。

即pGLK-RNAi载体(如图2所示)是以pFGC5941载体为基本骨架(如图1所示)，在CHSA intron上游***GLK靶向DNA序列，CHSA intron下游***GLK靶向DNA反向互补序列获得的。

5、转基因金叶银中杨的获取

(1)选取银中杨无菌生根苗叶片作为转基因受体。

(2)选取步骤(1)中挑选的叶片，在超净工作台中，将叶片剪成小块(0.5cm×0.5cm)，接种至分化培养基，在组培架上室温条件预培养2-3d，用于下一步农杆菌的侵染；

分化培养基包含以下组分：MS+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L。

(3)在预培养结束的前一天21时，取储存于-80℃的EHA105(pGLK-RNAi)工程菌，接种于30ml含有卡那和利福平的LB培养液中，在28℃，180rpm/min恒温摇床上过夜培养；

第二天(上午9时)取上述过夜培养物，按体积分数为2％的比例转入新鲜的无抗菌素的LB培养液中，继续培养至OD₆₀₀值为0.5左右时(中午12时至13时)，此工程菌液用于银中杨受体的侵染。侵染10分钟，期间要不断摇晃小瓶。

(4)将浸染后的叶片放在灭过菌的纸上，将菌液吸走，不要吸太干，然后将叶片近轴面向下接种在分化培养基上，28℃条件下于黑暗处进行共培养2d。

(5)将共培养的叶片转接至选择培养基(如图3A所示)，放到组培室进行选择培养，每天都要进行脱菌，(在超净工作台内将叶片放入灭过菌的头孢水里，摇晃1min，放入灭过菌的纸上，将水吸干)4d后，每隔3天脱一次菌，直至农杆菌脱干净。15d后，在切口处可见绿色抗性愈伤组织(如图3B所示)形成，将抗性愈伤组织切下转接到新的选择培养基中，进行二次筛选，25d后，产生抗性不定芽(如图3C所示)，待不定芽长到1～1.5cm时，转接到生根培养基上进行生根培养，15d左右长出不定根，即获得转基因银中杨。

将产生不定根的转基因银中杨移栽到花盆中培养(如图3D所示)，可见转基因银中杨叶片呈现黄色；移栽3个月的pGLK-RNAi银中杨生长繁茂，正常生长(如图3E所示)。

其中，选择培养基包含以下组分：MS+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L+头孢霉素200mg/L+除草剂1mg/L；

生根培养基包含以下组分：1/4MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 一种金叶银中杨的创制方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1269

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaaaaca ctgcaaccac caaagatgag agccaagaac aaatggagag ttattctacc 60

attttcaatg gagagttccc tgacttctcc gaagggagct tgctcgaaag catcgatttc 120

gatgatcttt ttgttagtat tgatgatgaa gatgtgttgc caaatttgga gatggatcct 180

gaaatccttg ctgaattctc tgttagtggt agcggaggtg aggaatcgga tgtaaacaca 240

tcggtatcaa atgagaaagt ggaggatagc attcatagaa aagatgagga agataagttt 300

tcaggtttgg actcgagttt gagcactaga ggagaggaga tagtgagtga gagagacgag 360

tccgtggttg ttaatccggt gcctaacaaa gatggtgaga agggaagaaa atcagcagct 420

catgccaaga acaacaataa tcaagggaag aggaaagtga aggtggattg gacaccagag 480

ctgcacagga ggttcgtgca agcagtggag cagctagggg tggataaggc agtgccttcg 540

aggattttag aacttatggg aattgactgt ctcactcgcc ataatattgc tagccatctt 600

caaaaatatc gatcacaccg gaaacatttg ctagcgcgcg aggctgaggc agcaaactgg 660

agccaaagac ggcaaatgta tggagccgcg gcagccggtg gaggtggcaa gagagacatt 720

agcgcatggc atgcactcac catggggttc cctcccataa ctcaccccat gcaccaccac 780

tttagaccgt tacatgtatg gggacatcct tccatggacc catccccaat gcatatgtgg 840

cctaagcatc tagctcattc accttcaccg cctcggccgc tgccaccacc tacatggcac 900

ccaccacctc caccaccaga tccttcatat tggcaccacc accctcacca aagggttccg 960

aacggactaa ccccagggac accttgcttt ccacagccac tggcaactag atttcctgca 1020

cctcctgtcc ccggcatccc gccccatgcc atgtacaaag tagaccccgg cattggcctc 1080

cttaccggac agccaggccc cagccctctc tttgactttc atccgtcaaa agagagtgta 1140

gacgcagtta ttggagatgt tttatcaaag ccatggctgc cacttcctct tgggcttaaa 1200

gctccagcta ctgatagtgt gctggtggag ctgcaaaagc aaggagttcc aaagatacca 1260

ccaacgtga 1269

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgccatgg ccatccccaa tgcatatgtg 30

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttggcgcgcc gcaggaaatc tagttgccag t 31

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctctagacc atccccaatg catatgtg 28

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggatccg caggaaatct agttgccagt 30

<210> 6

<211> 422

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gln Asn Thr Ala Thr Thr Lys Asp Glu Ser Gln Glu Gln Met Glu

1 5 10 15

Ser Tyr Ser Thr Ile Phe Asn Gly Glu Phe Pro Asp Phe Ser Glu Gly

20 25 30

Ser Leu Leu Glu Ser Ile Asp Phe Asp Asp Leu Phe Val Ser Ile Asp

35 40 45

Asp Glu Asp Val Leu Pro Asn Leu Glu Met Asp Pro Glu Ile Leu Ala

50 55 60

Glu Phe Ser Val Ser Gly Ser Gly Gly Glu Glu Ser Asp Val Asn Thr

65 70 75 80

Ser Val Ser Asn Glu Lys Val Glu Asp Ser Ile His Arg Lys Asp Glu

85 90 95

Glu Asp Lys Phe Ser Gly Leu Asp Ser Ser Leu Ser Thr Arg Gly Glu

100 105 110

Glu Ile Val Ser Glu Arg Asp Glu Ser Val Val Val Asn Pro Val Pro

115 120 125

Asn Lys Asp Gly Glu Lys Gly Arg Lys Ser Ala Ala His Ala Lys Asn

130 135 140

Asn Asn Asn Gln Gly Lys Arg Lys Val Lys Val Asp Trp Thr Pro Glu

145 150 155 160

Leu His Arg Arg Phe Val Gln Ala Val Glu Gln Leu Gly Val Asp Lys

165 170 175

Ala Val Pro Ser Arg Ile Leu Glu Leu Met Gly Ile Asp Cys Leu Thr

180 185 190

Arg His Asn Ile Ala Ser His Leu Gln Lys Tyr Arg Ser His Arg Lys

195 200 205

His Leu Leu Ala Arg Glu Ala Glu Ala Ala Asn Trp Ser Gln Arg Arg

210 215 220

Gln Met Tyr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Lys Arg Asp Ile

225 230 235 240

Ser Ala Trp His Ala Leu Thr Met Gly Phe Pro Pro Ile Thr His Pro

245 250 255

Met His His His Phe Arg Pro Leu His Val Trp Gly His Pro Ser Met

260 265 270

Asp Pro Ser Pro Met His Met Trp Pro Lys His Leu Ala His Ser Pro

275 280 285

Ser Pro Pro Arg Pro Leu Pro Pro Pro Thr Trp His Pro Pro Pro Pro

290 295 300

Pro Pro Asp Pro Ser Tyr Trp His His His Pro His Gln Arg Val Pro

305 310 315 320

Asn Gly Leu Thr Pro Gly Thr Pro Cys Phe Pro Gln Pro Leu Ala Thr

325 330 335

Arg Phe Pro Ala Pro Pro Val Pro Gly Ile Pro Pro His Ala Met Tyr

340 345 350

Lys Val Asp Pro Gly Ile Gly Leu Leu Thr Gly Gln Pro Gly Pro Ser

355 360 365

Pro Leu Phe Asp Phe His Pro Ser Lys Glu Ser Val Asp Ala Val Ile

370 375 380

Gly Asp Val Leu Ser Lys Pro Trp Leu Pro Leu Pro Leu Gly Leu Lys

385 390 395 400

Ala Pro Ala Thr Asp Ser Val Leu Val Glu Leu Gln Lys Gln Gly Val

405 410 415

Pro Lys Ile Pro Pro Thr

420