一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY3及应用
阅读说明：本技术 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY3及应用 (Lilium regale WRKY transcription factor gene LrWRKY3 and application thereof ) 是由 刘迪秋 普丽梅 王自娥 郑锂蕾 陈虹均 李珊 葛锋 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种岷江百合WRKY转录因子基因<I>LrWRKY3</I>,其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述,编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质,本发明通过功能基因组学相关技术研究证实<I>LrWRKY3</I>基因具有提高植物抗真菌的功能,将本发明抗真菌<I>LrWRKY3</I>基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达,转基因烟草植株具有很强的抗真菌侵染能力,实验结果显示超表达<I>LrWRKY3</I>的转基因烟草叶片对稻黑孢霉、葡萄座腔菌、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、茄腐镰刀菌等五种病原真菌的侵染有很强的抗性。(The invention discloses a Lilium regale WRKY transcription factor gene LrWRKY3 The nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1, encoding the polypeptide shown as SEQ ID NO:2, the invention is proved by related technical research of functional genomics LrWRKY3 The gene has the function of improving the plant antifungal property, and the invention is used for resisting the fungi LrWRKY3 The gene is constructed on a plant expression vector and is transferred into tobacco for over-expression, a transgenic tobacco plant has strong capability of resisting fungal infection, and the experimental result shows that the over-expression is realized LrWRKY3 The transgenic tobacco leaf is used for treating Nilaparhizoma oryzae and grapeThe five pathogenic fungi such as lochiobacter, fusarium graminearum, fusarium verticillium, fusarium solani and the like have strong resistance to infection.)
技术领域
本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌侵染能力的岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY3及应用。
背景技术
植物病害是农业生产中一个非常棘手的问题，尤其是真菌病害，约占到植物总病害的80%，严重影响农作物的产量和品质。植物具有先天免疫系统以避免病原菌的入侵，包括严格调节防御反应的复杂网络，转录因子作为信号途径调控基因在植物抗病反应中扮演重要角色，尤其是WRKY 转录因子家族，参与对生物和非生物防御的调控(Agarwal P,Patel K, Agarwal PK. Ectopic expression of JcWRKY confers enhanced resistancein transgenic tobacco against Macrophomina phaseolina. DNA Cell Biol, 2018,37(4): 298-307.)。
WRKY转录因子是植物中最大的几类转录因子之一，在其蛋白质的N端具有WRKY结构域。WRKY结构域具有保守的WRKYGQK氨基酸序列，通常与名为W盒(W box，C/TTGACT/C)的顺式作用元件结合。WRKY蛋白与靶基因启动子区的顺式作用元件核心结构是TTGAC(C/T)的W-box特异结合，即所有启动子中含W-box的基因都可能是WRKY的靶基因，包括WRKY本身(Dong J, Chen C, Chen Z. Expression profiles of the Arabidopsis WRKY genesuperfamily during plant defense response. Plant Mol Biol, 2003, 51(1): 21-37.)。WRKY结构域由四股β折叠构成，保守的WRKYGQK残基对应于N端的β折叠(strand β-1)，能够进入DNA双螺旋的大沟并与DNA上的W盒发生作用(Ciolkowski I, Wanke D,Birkenbihl RP, et al. Studies on DNA-binding selectivity of WRKYtranscription factors lend structural clues into WRKY-domain function. PlantMol Biol, 2008, 68(1-2): 81-92.)。
WRKY转录因子通过调控植物转录组重新编程以应对不同病原物的入侵。通过参与不同的调控途径从而正向或负向调节下游靶基因的表达，包括参与激素信号通路，与WRKY转录因子家族的其他成员互作等。葡萄WRKY转录因子基因VqWRKY52在拟南芥中的异位表达增强了对白粉病和丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000）的抗性(Wang X, Guo R, Tu M, et al. Ectopic expression of the wild grape WRKYtranscription factor VqWRKY52 in Arabidopsis thaliana enhances resistance tothe biotrophic pathogen powdery mildew But Not to the necrotrophic pathogenBotrytis cinerea. Front Plant Sci, 2017, 8:97.)。睡茄（Withania somnifera）WsWRKY1在烟草中过表达提高了对生物胁迫的耐受性(Singh AK, Kumar SR, Dwivedi V,et al. A WRKY transcription factor from Withania somnifera regulatestriterpenoid withanolide accumulation and biotic stress tolerance throughmodulation of phytosterol and defense pathways. New Phytol, 2017, 215(3):1115-1131.)。此外，鹰嘴豆CaWRKY40正调控防御相关基因的表达从而增强对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的抗性(Chakraborty J, Ghosh P, Sen S, et al. CaMPK9increases the stability of CaWRKY40 transcription factor which triggersdefense response in chickpea upon Fusariumoxysporum f. sp. ciceri Race1infection. Plant Mol Biol, 2019, 100(4-5): 411-431.）。
亚麻（Linum usitatissimum）转录因子 LuWRKY36通过激素和钙信号途径的介导在抗尖孢镰刀菌的防卫反应中起着关键的调控作用，且LuWRKY36在生物胁迫下正调控LuPLR1基因和木质素的生物合成 (Markulin L, Corbin C, Renouard S, et al.Characterization of LuWRKY36, a flax transcription factor promotingsecoisolariciresinol biosynthesis in response to Fusarium oxysporum elicitorsin Linum usitatissimum L. hairy roots. Planta, 2019, 250(1): 347-366.)。草莓（Fragaria vesca）WRKY转录因子FvWRKY42与各种应激相关蛋白质相互作用，在拟南芥中过表达FvWRKY42导致细胞死亡、孢子形成及菌丝生长缓慢从而增强了对白粉病的抗性，并上调了拟南芥中PR1基因的表达 (Wei W, Cui MY, Hu Y, et al. Ectopic expression ofFvWRKY42, a WRKY transcription factor from the diploid woodland strawberry(Fragaria vesca), enhances resistance to powdery mildew, improves osmoticstress resistance, and increases abscisic acid sensitivity in Arabidopsis.Plant Sci, 2018, 275: 60-74.)。拟南芥（Arabidopsis）转录因子AtWRKY50与PR1的两个启动子元件TGA2或TGA5共表达增强了水杨酸（SA）诱导型标记基因PR1的表达水平(HussainRMF, Sheikh AH, Haider I, et al. Arabidopsis WRKY50 and TGA TranscriptionFactors Synergistically Activate Expression of PR1. Front Plant Sci, 2018, 9:930.)。此外，包括辣椒CaWRKY22、CaWRKY6、CaWRKY27、CaWRKY40和CaWRKY58在内的WRKY 转录因子整合形成亚调控网络，并通过水杨酸、茉莉酸和乙烯协同介导的信号途径正调节对青枯病菌（Ralstonia Solanacearum）的抗性(Hussain A, Li X, Weng Y, et al.CaWRKY22 Acts as a Positive Regulator in Pepper Response to Ralstonia Solanacearum by Constituting Networks with CaWRKY6, CaWRKY27, CaWRKY40, andCaWRKY58. Int J Mol Sci, 2018, 19(5): E1426.)。而CaWRKY40b通过调控免疫相关基因在辣椒抗青枯病菌中发挥负调控作用(Ifnan Khan M, Zhang Y, Liu Z, et al.CaWRKY40b in pepper acts as a negative regulator in response to Ralstonia solanacearum by directly modulating defense genes including CaWRKY40. Int JMol Sci, 2018, 19(5): E1403.)。
百合是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物的总称，属多年生球根类花卉。在种球繁殖及鲜切花生产过程中，百合易受到真菌、病毒、细菌等多种病原菌的危害。目前发现的百合病害达几十种之多，其中由镰刀属(Fusarium)真菌引起的枯萎病(又称为基腐病、茎腐病)是百合生产中危害最严重的病害。镰刀菌侵染百合种球后引起基盘坏死、鳞片腐烂脱落，造成种球质量下降；植株感染镰刀菌后叶片变黄、萎蔫下垂，植株提早枯萎死亡，严重影响百合切花的产量和品质。百合枯萎病的病原主要是尖孢镰刀菌，我国是百合的重要原产地，拥有丰富的百合种质资源，比如野生种岷江百合(L. regale)，高抗尖孢镰刀菌。岷江百合为我国特有种，仅分布于岷江流域海拔800～2700m的河谷到山腰的岩石缝中，具有极强的抗真菌、抗病毒特性，是现代百合育种的重要种质资源。由于地质灾害频发、人为采挖、开荒、植树造林等因素的影响，岷江百合野生资源的分布面积及数量明显减少，被世界自然保护联盟列为濒危物种，对珍稀岷江百合野生资源的保护迫在眉睫。因此，充分发掘利用岷江百合具有的抗病基因势在必行。WRKY转录因子是植物抗病防卫反应的关键调节因子，从岷江百合中发掘抗病相关的WRKY转录因子基因，不仅能深入认识岷江百合的抗病调控机制，还能为抗病基因工程提供候选抗病基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY3 及其应用，即在提高烟草对稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、禾谷镰刀菌（F. graminearum）、轮枝镰刀菌（F. verticillioides）、茄腐镰刀菌（F. solani）抗性中的应用。
本发明从岷江百合中克隆获得的具有抗真菌活性的WRKY转录因子的全长基因，WRKY转录因子基因LrWRKY3核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因cDNA全长序列为722bp，包含一个537 bp的开放阅读框、19 bp的5’非翻译区、166 bp的3’非翻译区，编码如SEQID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。
本发明中LrWRKY3基因的编码区是序列表SEQ ID NO:1中第20-556位所示的核苷酸序列。
本发明分离克隆岷江百合的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为LrWRKY3。
上述LrWRKY3基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：
（1）采用扩增LrWRKY3的特异引物，从接种尖孢镰刀菌后的岷江百合根中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增出LrWRKY3的全长编码区，然后将其连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；
（2）用限制性内切酶XbaI和EcoRI酶切pGEM-T-LrWRKY3载体，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pCAMBIA2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得LrWRKY3基因片段与pCAMBIA2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；
（3）以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株对不同病原真菌的抗性水平，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。
本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自岷江百合的LrWRKY3基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、药材、花卉、苗木等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1是本发明LrWRKY3转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果图，图中：Marker为DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；阳性对照为质粒pGEM-T-LrWRKY3为模板的PCR结产物；WT为非转基因烟草(野生型)总DNA为模板PCR的产物；
图2是本发明阳性LrWRKY3转基因烟草中LrWRKY3转录水平的表达分析结果图；图中：Marker是DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；WT是非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；阳性对照是质粒pGEM-T-LrWRKY3为模板的PCR产物；
图3是本发明LrWRKY3转基因烟草抗病能力鉴定的结果图；图中a、b、c、d、e分别是接种稻黑孢霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌的烟草叶片；WT为野生型烟草的叶片，19、20、27、34为LrWRKY3转基因烟草的叶片。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：LrWRKY3全长基因克隆以及序列分析
用尖孢镰刀菌接种岷江百合，用接种24 h后的根提取总RNA，用液氮将接种后的岷江百合根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，采用逆转录酶M-MLV(promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg Total RNA，依次加入50 ng oligo（dT），2 μL dNTP（2.5 mM each）、DEPC水加至反应体积为14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-standbuffer、0.5 μL RNasin（200U）、1 μL M-MLV（200U），混匀并短时离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应；cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。
以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因LrWRKY3，所用上下游引物序列分别为5’ ATTCATGGAGAGCTTCCCCCTAC3’及5’TGGTGCATTGGCTTATTATACTCAT3’。采用AdvantageTM 2PCR Enzyme（Clontech）扩增出目的基因；PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30s，72℃ 40 s，32个循环；72℃ 7 min；反应体系（20 μL）为0.5 μL cDNA、2 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer、0.4 μL 50×dNTP Mix （10mM each）、0.4 μL 正向引物（10 μM）、0.4 μL 反向引物（10 μM）、0.4 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、15.9 μL PCR-Grade water；PCR结束后，取5 μL用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。
电泳检测结果显示PCR产物只有一条DNA带，直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pGEM-T easy Vector SystemⅠ（Promega,USA），反应体系和操作过程为：取1.5 μLPCR产物，依次加入1 μL pGEM-T vector（50 ng/μL）和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16 ℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中。使用含有氨苄青霉素（ampicillin，Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增LrWRKY3的特异引物鉴定出多克隆位点***LrWRKY3的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的LrWRKY3全长cDNA为722 bp，通过NCBI ORF finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个537 bp的开放读码框（见序列表），LrWRKY3编码一个含178个氨基酸的蛋白质LrWRKY3，其分子量约为20.32 KDa，等电点约为9.49，含有2个半胱氨酸残基。借助生物信息学软件SignalP 4.1分析LrWRKY3编码的蛋白序列，检测其是否具有N端信号肽。结果显示在LrWRKY3中没有检测到信号肽的存在，表明LrWRKY3是一种非分泌蛋白。LrWRKY3具有1个WRKYGQK保守结构域，在每个WRKY结构域之后紧接一个C2H2 (C-X4-C-X22/23-H-X1-H)型锌指基序。显然，LrWRKY3编码的蛋白质属于Ⅱ类WRKY转录因子。
实施例2：植物超表达载体构建
采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工）提取***LrWRKY3的大肠杆菌质粒pGEM-T-LrWRKY3以及植物表达载体pCAMBIA2300s的质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶XbaI（TaKaRa）和EcoRI（TaKaRa）和分别对质粒pGEM-T-LrWRKY3和pCAMBIA2300s进行双酶切（100 μL体系），反应体系和操作过程为：取20 μL pGEM-T-LrWRKY3和pCAMBIA2300s质粒、依次加入10 μL 10×M buffer、4μLXbaI、6 μL EcoRI、60 μL ddH2O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对LrWRKY3片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收，整个过程使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）；取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。
利用T4 DNA Ligase（TaKaRa），将回收的LrWRKY3 DNA片段和pCAMBIA2300s载体片段连接起来，反应体系（20 μL）和操作过程为：取10 μL LrWRKY3 DNA片段依次加入2 μLpCAMBIA2300s载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μLddH2O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素（kanamycin，Km）的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增LrWRKY3的特异引物进行PCR，挑选出LrWRKY3与pCAMBIA2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。
采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒（上海生工）提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300s-LrWRKY3质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300s-LrWRKY3转入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μgpCAMBIA2300s-LrWRKY3质粒加入含有200μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1 min，然后迅速置于37℃水浴5 min，之后立即冰浴2 min，加入800μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增LrWRKY3的特异性引物进行PCR，检测pCAMBIA2300s-LrWRKY3是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。
实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选
本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的HgCl2浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16 h/d光照），以后每月用1/2MS培养基继代一次。
从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-LrWRKY3质粒的农杆菌LBA4404菌种，接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h；随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养2-3 h以活化农杆菌。
取烟草无菌苗叶片切成1 cm2左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，浸染时间为15 min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/Lsucrose+6 g/L琼脂，22℃无光条件下共培养2天。
将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L sucrose+6 g/L琼脂+50 mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素（cefotaxime sodium salt，Cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16 h/d光照，8 h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。
采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，将提取的基因组DNA取1μL通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增LrWRKY3的特异引物进行PCR，PCR结束后，取8μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，LrWRKY3转基因烟草共筛选到50株阳性转基因植株。
实施例4：转基因烟草中LrWRKY3的表达分析以及转基因植株抗真菌侵染的功能分析
取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增LrWRKY3的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因单株中LrWRKY3转录水平的表达，总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同，PCR结束之后，取5μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到45个转基因单株中LrWRKY3在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～45。
将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基（200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20g/L葡萄糖）上，28℃暗培养7d。选择温室中生长良好、大小均一且完全伸展的烟草叶片，用手术剪从叶柄除剪下。用无菌塑料枪头在叶片约相同位置戳出大小一致的伤口，分别接种大小相同的病原真菌菌块。将接种后的叶片置于铺有无菌水浸湿的滤纸的平板中，于28℃光照培养箱中培养，每天加水保湿。培养7 d后收集叶片并观察各株系叶片的发病情况。结果如图3所示，分别接种稻黑孢霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌等五种病原真菌后，野生型烟草的叶片形成较大的病斑，叶片出现黄化和腐烂的现象。然而，转基因烟草的发病症状很轻微，形成的病斑面积远小于野生型烟草，可见LrWRKY3转基因烟草对稻黑孢霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌具有很强的抗侵染能力。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY3及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 722
<212> DNA
<213> 岷江百合(Lilium regale Wilson)
<400> 1
ctctctctct ctctcattca tggagagctt ccccctactc ctgaacaatc aaccatcttc 60
atcttatcac ttgccatcca attttgtgag caccagccag ctcttttcca acccacagaa 120
caccatttca aatgggttct tggggttgaa ggaggagacc gtggcttcat ccagctcaaa 180
tgttcaatca gcgattcaaa tggaagcctt ccggggatcc tccgagacca atgccaaaca 240
aggcaaaaag aagggagaca agaaggcgaa gaggccgcgg ttcgccttcc agacccggag 300
caaggtcgat attcttgacg acggctatcg ctggaggaag tatggccaga aggcagtgaa 360
gaacaacaac ttcccaagga gctattatcg gtgcacgcat caaggttgtg atgtgaagaa 420
gcaagttcag cgcctatcaa aagatgagga ggttgtggtc accacttacg agggagtaca 480
tactcacccc atcgagaaat caaacgacaa ctttgagcac atcttaaacc aaatgcaagt 540
ctattcgagc ttttgatcta tgaatgatca tagtaagatt gtttgtaaaa gaaaattcct 600
accacgttaa tgcatgagta taataagcca atgcaccagt gttgttgggt atacctgtac 660
agaggaagta ttatgggcag agtatgtata tctatttaca ttttttttta tcttatctcc 720
ag 722
<210> 2
<211> 178
<212> PRT
<213> 岷江百合(Lilium regale Wilson)
<400> 2
Met Glu Ser Phe Pro Leu Leu Leu Asn Asn Gln Pro Ser Ser Ser Tyr
1 5 10 15
His Leu Pro Ser Asn Phe Val Ser Thr Ser Gln Leu Phe Ser Asn Pro
20 25 30
Gln Asn Thr Ile Ser Asn Gly Phe Leu Gly Leu Lys Glu Glu Thr Val
35 40 45
Ala Ser Ser Ser Ser Asn Val Gln Ser Ala Ile Gln Met Glu Ala Phe
50 55 60
Arg Gly Ser Ser Glu Thr Asn Ala Lys Gln Gly Lys Lys Lys Gly Asp
65 70 75 80
Lys Lys Ala Lys Arg Pro Arg Phe Ala Phe Gln Thr Arg Ser Lys Val
85 90 95
Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Ala
100 105 110
Val Lys Asn Asn Asn Phe Pro Arg Ser Tyr Tyr Arg Cys Thr His Gln
115 120 125
Gly Cys Asp Val Lys Lys Gln Val Gln Arg Leu Ser Lys Asp Glu Glu
130 135 140
Val Val Val Thr Thr Tyr Glu Gly Val His Thr His Pro Ile Glu Lys
145 150 155 160
Ser Asn Asp Asn Phe Glu His Ile Leu Asn Gln Met Gln Val Tyr Ser
165 170 175
Ser Phe
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
attcatggag agcttccccc tac 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
tggtgcattg gcttattata ctcat 25