氧化铈纳米颗粒在制备治疗和预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用
阅读说明：本技术 氧化铈纳米颗粒在制备治疗和预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用 (Application of cerium oxide nanoparticles in preparation of medicines for treating and preventing renal ischemia-reperfusion injury ) 是由 周澜 唐舒沛 吴玉章 于 2021-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及氧化铈纳米颗粒在制备治疗和/或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用,属于生物医药技术领域,本发明所制备的氧化铈纳米颗粒降低了HK2细胞(人肾小管上皮细胞)的线粒体膜电位水平和活性氧的产量,提高了HK2细胞在缺氧后复氧的环境中的存活率,并且在动物实验中发现,氧化铈纳米颗粒通过调控炎症反应减轻了缺血再灌注引起的肾脏损伤和后期肾脏纤维化的发生发展。氧化铈纳米颗粒的新应用为临床上治疗和预防肾脏缺血再灌注损伤治疗提供了新思路。(The invention relates to application of cerium oxide nanoparticles in preparation of a medicine for treating and/or preventing renal ischemia-reperfusion injury, and belongs to the technical field of biological medicines. The new application of the cerium oxide nanoparticles provides a new idea for clinically treating and preventing the renal ischemia-reperfusion injury.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及氧化铈纳米颗粒在制备治疗和/或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用。
背景技术
急性肾损伤是临床上的常见疾病，以贫血，酸碱平衡和电解质紊乱，血容量超载为主要症状。急性肾损伤具有高致病率和高致死率的特点，每年造成了全球约200万人的死亡，并且存活的病人还容易继发终末性肾病和慢性肾脏疾病。在急性肾损伤的众多病因中，肾脏缺血再灌注损伤是成年人中最主要的致病因素。氧化应激和炎症反应在肾脏缺血再灌注损伤中都起到了重要的作用。
临床上，肾脏缺血再灌注损伤常发生在肾移植手术，肾结石取石术和其他手术过程中。目前临床上缺乏有效的早期诊断和治疗肾脏缺血再灌注的手段和治疗方法，大多数的病人都是在疾病已经发生和发展后才被诊断出来，所以只能使用体液治疗和透析的保守治疗方法。但是保守治疗的方法效果有限且不能有效的预防后期肾脏纤维化和肾衰竭的发生。
目前随着纳米技术的发展，越来越多的纳米颗粒被用于肾脏缺血再灌注治疗的研究中。但是大多数的纳米颗粒只是被当作药物的载体或是多肽等物质的载体。具备很多缺陷，诸如：造价昂贵，消耗时间过长，不能够大量的制备用于实际临床治疗中；载药率或载多肽率很低，使用时需要大剂量使用，造成肝肾毒性的发生等。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种氧化铈纳米颗粒在制备治疗和/或预防肾脏缺血再灌注损伤的药物中的应用，本发明的目的之二在于提供一种含有氧化铈纳米颗粒的制剂在制备治疗和/或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、氧化铈纳米颗粒在制备治疗和/或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用。
作为优选的技术方案之一，所述氧化铈纳米颗粒的粒径为46～118nm。
作为优选的技术方案之一，所述治疗和/或预防为：
a、减少肾脏纤维化；
b、减少肾脏细胞中巨噬细胞的浸润；
c、降低炎症因子的基因和蛋白表达水平；
d、清除细胞中活性氧。
2、含有氧化铈纳米颗粒的制剂在制备治疗和/或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用。
作为优选的技术方案之一，所示制剂包括氧化铈纳米颗粒和一种或多种药学上可以接受的载体或辅料。
本发明的有益效果在于：
本发明通过细胞实验证实了氧化铈纳米颗粒对HK2细胞没有细胞毒性，并且能够被HK2细胞吞噬进入细胞内。在缺氧后复氧的环境中能够有效的降低细胞的线粒体膜电位，清除细胞内的活性氧，活性氧产生的减少使得经历了缺氧后复氧的细胞的存活率显著提高。本发明通过动物实验证实了氧化铈纳米颗粒对小鼠主要组织器官没有毒性，并且不会影响小鼠血生化指标。在小鼠肾脏缺血再灌注模型中，术前注射氧化铈纳米颗粒可以调节炎症反应，保护肾脏免受损害并且防止了后期肾脏纤维化的发生和发展。氧化铈纳米颗粒的新应用为临床上预防和治疗肾脏缺血再灌注损伤提供了新思路。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为氧化铈纳米颗粒的设计和表征。A为三种不同大小氧化铈纳米颗粒电镜结构图；B为氧化铈纳米颗粒的SOD酶活性检测；C为氧化铈纳米颗粒HORAC酶学活性检测；D为氧化铈纳米颗粒清除活性氧示意图。
图2为氧化铈纳米颗粒的体内毒性检测，通过HE染色分别检测了主要组织脏器(心、肝、脾、肺、肾)的情况。
图3为氧化铈纳米颗粒对肝肾功能的影响检测，分别检测了血肌酐，血尿素氮，谷丙转氨酶，谷草转氨酶的水平。
图4为氧化铈纳米颗粒保护肾脏免受缺血再灌注的损害并防止后期纤维化的形成。A为实验的模式图，B为HE染色检测肾脏形态结构变化，C为血肌酐情况统计，D为血尿素氮水平检测，E为肾脏损伤指数统计，F为肾脏凋亡细胞数量统计，G为TUNEL染色检测肾脏凋亡细胞情况，KIM-1蛋白在肾脏细胞中表达情况，H为马松染色和天狼星红染色检测手术后28天时肾脏间质纤维化情况。
图5为氧化铈纳米颗粒对炎症反应的调控。A为CD45+细胞染色检测免疫细胞浸润情况；B为CD45+细胞数量统计；C为流式检测肾脏中浸润的巨噬细胞的数量；D为浸润的巨噬细胞占总的白细胞的百分比；E为浸润的巨噬细胞的绝对数量；F检测了肾脏炎症基因的表达情况；G为western-blot检测了炎症相关蛋白的表达情况。
图6为不同浓度氧化铈纳米颗粒对HK2细胞毒性情况检测。
图7为氧化铈纳米颗粒清除活性氧保护HK2细胞。A为细胞实验模式图；B为HK2细胞和氧化铈纳米颗粒共培养后的电镜图；C为HK2细胞活性检测图；D为流式细胞学检测HK2细胞活性氧水平；E为荧光显微镜检测HK2细胞活性氧水平；F为检测HK2细胞线粒体膜电位水平。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
3种不同粒径的氧化铈纳米颗粒的制备及性能检测
(1)氧化铈纳米颗粒的制备
46nm氧化铈纳米颗粒：称取217mg Ce(NO3)3·6H2O和290mg三正辛基氧膦(Trioctylphosphine oxide,TOPO)，加入2mL无水乙醇，80℃溶清后再加入5mL ODE，以80℃为起始温度，升至180℃，保持30min。(Ce/TOPO＝1.0/1.5)
78nm氧化铈纳米颗粒：称取217mg Ce(NO3)3·6H2O和232mg三正辛基氧膦(Trioctylphosphine oxide,TOPO)，加入2mL无水乙醇，80℃溶清后再加入5mL ODE，以80℃为起始温度，升至180℃，保持30min。(Ce/TOPO＝1.0/1.2)
118nm：称取217mg Ce(NO3)3·6H2O和232mg三正辛基氧膦(Trioctylphosphineoxide,TOPO)，加入2mL无水乙醇，80℃溶清后再加入5mL ODE，以80℃为起始温度，升至180℃，保持15min。称取217mg Ce(NO3)3·6H2O和232mg TOPO于4mL EP管中，加入500μL无水乙醇溶清，制得混合液。待上述反应15min结束时，将混合液用蠕动泵以5rpm转速泵入，分3次补加，每次补加间隔5min，补加完后反应15min。(Ce/TOPO＝1.0/1.2)
电镜检测3种不同大小的氧化铈纳米颗粒形态，并用WST-8总超氧化物歧化酶检测试剂盒(S0101S，Beyotime)测定不同浓度(20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)CNPs的超氧化物歧化酶模拟活性，用羟自由基检测试剂盒(A018-1-1,Nanjing Jiancheng BioengineeringInstitute)测定不同浓度(20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)CNPs的羟基自由基清除活性，结果如图1所示。
(2)氧化铈纳米颗粒的生物毒性检测
取6-8周的C57小鼠，称量体重后，分别按照1mg/kg的浓度于尾静脉注射3种不同粒径的氧化铈纳米颗粒。24小时后，摘取眼球取血，室温放置1小时后，6000rpm、10min离心，吸取上层血清送往陆军军医大学新桥医院检验科进行检测。处死小鼠后，取小鼠的主要组织脏器(心，肝，脾，肺，肾)放置于4％多聚甲醛溶液中，经过脱水，浸蜡后制成蜡块。制备好的蜡块切片，通过组织HE染色，检测氧化铈纳米颗粒对重要组织脏器是否具有毒性。结果如图2、3所示，注射氧化铈纳米颗粒后，小鼠的重要脏器(心，肝，脾，肺，肾)的形态和结构完整，没有明显损害(图2)，同时小鼠的血肌酐，血尿素氮，谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平在氧化铈纳米颗粒体内注射后并没有增高(图3)，以上的结果说明氧化铈纳米颗粒没有生物毒性，具有很好的生物相容性。
实施例2
氧化铈纳米颗粒保护肾脏免受肾缺血再灌注的损伤并防止后期纤维化的发生
(1)肾脏缺血再灌注模型的构建
将6-8周大小鼠用麻药麻醉后，去除腹部毛发，并用75％浓度的酒精消毒皮肤。将小鼠放置于加热的手术垫上，使用低粘性胶带固定小鼠上下肢。使用剪刀沿腹中线剖开小鼠腹部进入腹腔，将小鼠肠道轻轻推向腹腔左侧以显露出右肾和右侧输尿管，分离右肾血管和输尿管，用6/0手术线结扎并切除小鼠右肾和输尿管。同理分离小鼠左肾，用血管夹夹闭肾脏动静脉后小鼠肾脏逐渐均匀变黑，夹闭40分钟后松开夹子，肾脏迅速变为深粉红色，证明建模成功，全程注意小鼠保温。
(2)氧化铈纳米颗粒保护肾脏免受缺血再灌注的损伤
在造模前2小时，称量小鼠体重，分别按照1mg/kg的浓度于尾静脉注射3种不同粒径的氧化铈纳米颗粒。随后按照步骤(1)中方法，构建小鼠肾脏缺血再灌注模型，操作过程如图4中A所示。造模后24小时，进行如下检测：
①取小鼠血清检测血肌酐、血尿素氮水平；取小鼠肾脏做HE染色，检测小鼠肾脏损伤情况。
HE染色和免疫组化染色方法如下：
取需要检测的组织样本于4％多聚甲醛中，固定约12小时。然后分别在75％，80％，90％，100％的乙醇溶液中浸泡半小时，100％乙醇溶液中15分钟脱水。经过透明、浸蜡后进行石蜡包埋。包埋好的组织蜡块可用于后续实验。
HE染色，将组织蜡块切成5微米厚的切片并贴于载玻片上，45度恒温箱中烘干。切片经过脱蜡后用染液(H.E染色：苏木精染料和伊红染料；马松染色：苏木精染料，丽春红染料和苯胺蓝染料；天狼星红染色：苏木素染液和天狼星红染液)进行染色，染色完毕的切片经过脱水透明和封固用于后续观察；
免疫组化染色，将组织蜡块切成5微米厚的切片并贴于载玻片上，45℃恒温箱中烘干。切片经过脱蜡后分别进行抗原修复和封闭内源性过氧化氢酶，然后加入一抗(所有抗体均按照1:50稀释，KIM1,ab47635,Abcam；TUNEL,11684817910，Roche；CD45,ab10558,Abcam)置于湿盒过夜，清洗后加入DAB显色液显示，在通过苏木精复染后脱水封片用于后续观察。
结果如图4中B、C、D、E所示，造模后RIRI组小鼠相较于假手术组小鼠的肌酐和尿素氮水平明显升高，同时HE染色显示出肾脏组织损伤严重(肾小管水肿，蛋白渗出增多，肾小管上皮细胞纤毛减少等)。但氧化铈纳米颗粒组相较于RIRI组却有着明显的保护作用，包括血肌酐，血尿素氮水平的下降，肾脏HE染色显示出肾脏损伤减轻，肾脏损伤指数下降。
②TUNEL染色检测肾脏细胞凋亡，并对肾脏进行免疫组化染色检测KIM1蛋白表达。
结果如图4中F、G所示，氧化铈纳米颗粒减少了肾脏实质细胞的凋亡，同时肾脏实质细胞受损时会表达出KIM1蛋白于细胞质中，通过免疫组化染色发现氧化铈纳米颗粒减少了肾脏缺血再灌注损伤后KIM1蛋白的表达。
以上结果说明了氧化铈纳米颗粒可以有效保护肾脏免受缺血再灌注损伤的损害。
(3)氧化铈纳米颗粒防止了受损肾脏纤维化的发生和发展
虽然肾脏拥有非常强大的再生能力，但是急性肾损伤所造成的慢性肾脏病和肾脏衰竭是目前世界上发病率和致死率最高的疾病。肾脏缺血再灌注发生后，肾脏固有细胞损伤会造成纤维的沉积和积聚并最终导致肾实质硬化和瘢痕的形成。
称量小鼠体重，尾静脉注射浓度为1mg/kg的3种不同粒径的氧化铈纳米颗粒，2小时后，按照步骤(1)中方法，构建小鼠肾脏缺血再灌注模型，在肾脏缺血再灌注损伤后28天检测受损肾脏的纤维化情况。结果如图4中H所示，通过马松染色和天狼星红染色可以发现，RIRI组相较于sham(假手术组)组，肾脏纤维化明显增多，而在氧化铈纳米颗粒注射组，纤维化水平有着明显的改善，以上说明氧化铈纳米颗粒可以防止受损肾脏纤维化的发生和发展。
实施例3
氧化铈纳米颗粒调节肾脏损伤后的炎症反应
称量小鼠体重，尾静脉注射浓度为1mg/kg的3种不同粒径的氧化铈纳米颗粒，2小时后，按照步骤(1)中方法，构建小鼠肾脏缺血再灌注模型，24h后，作如下检测：
①取肾脏组织，进行免疫组化染色，检测CD45+细胞在肾脏中的浸润情况。结果如图5中A、B所示，检测发现氧化铈纳米颗粒减少了免疫细胞在肾脏组织中的浸润，巨噬细胞在肾脏缺血再灌注损伤中发挥了重要的作用。
②将肾脏在筛网中研磨成单细胞悬液，取4million的细胞进行流式细胞学染色(F4/80(clone BM8,Biolegend),CD11b(clone M1/70,Biolegend))检测肾脏组织中浸润的巨噬细胞的数量。将细胞以每孔约4×106个细胞加入96孔板中，1800rpm离心2min，去上清。用现配的FACS溶液清洗细胞。用排枪吸取200μL液体量的FACS溶液，加入96孔板中，吹打混匀，1800rpm离心2min，去除上清，清洗2次，以1:100的比例加入预冷的相应表面染色抗体。每孔加入100μL抗体混悬液(按照不同的实验目的进行配置)，混匀后，置于4℃冰箱中避光孵育30min。将96孔板以1800rpm离心2min，弃去上清。
结果如图5中C、D、E所示，检测发现氧化铈纳米颗粒减少了肾脏细胞中巨噬细胞浸润的总量。
③实时荧光定量PCR检测肾脏中的炎症炎症相关基因(Cxcl1、Il-1β、Il-6、Tnf-α)的mRNA表达，Western blot检测炎症蛋白(IL-1β、p-p65、p65)的表达情况。结果如图5中F、G所示，氧化铈纳米颗粒降低了炎症基因的表达和炎症蛋白的水平。
Western blot方法如下：
按照每组样本30ug的蛋白量加入10％的SDS-PAGE胶中进行蛋白电泳，随后将蛋白转膜到PVDF膜上。转膜完毕后，PVDF膜用5％脱脂牛奶进行封闭，随后按照1：1000的比例加入一抗(β-actin(clone 8H10D10,Cell Signaling Technology),IL1β(12426S,CellSignaling Technology),p65(ab16502,Abcam),phospho-p65(3033S,Cell SignalingTechnology))检测目的蛋白。过夜孵育后加入二抗，染色1小时进行检测。
实施例4
氧化铈纳米颗粒对活性氧的清除能力检测
①氧化铈纳米颗粒对HK2的细胞毒性检测
培养HK2细胞，将细胞按照5000/孔接种到细胞板中，培养12h，分别加入不同浓度(0、2、5、10、20、50ug/mL)的3种不同粒径的氧化铈纳米颗粒，24h后，用CCK8染色检测细胞存活率，过程如图7中A所示。结果如图6和图7中B所示，氧化铈纳米颗粒对HK2细胞没有细胞毒性，并且HK2细胞能够吞噬氧化铈纳米颗粒。
②氧化铈纳米颗粒保护HK2细胞免受缺氧后复氧的损害
将HK2细胞按照5000/孔接种在96孔板中12小时后按照20ug/ml的浓度加入氧化铈纳米颗粒共同培养24小时后，将HK2细胞置于无血清培养基并且充满氮气的环境中，2小时后，恢复为正常环境培养。测氧化铈纳米颗粒对HK2细胞的保护性作用，用CCK8染色检测细胞存活率；使用美国Abcam公司的ROS Detection Assay Kit试剂盒进行ROS的染色实验，检测ROS水平；使用MultiSciences company公司的Mitochondria Staining Kit(JC-1)试剂盒进行染色，检测细胞的线粒体膜电位水平。
图7中C～F所示，检测发现氧化铈纳米颗粒可以有效保护HK2细胞的存活(图7中C)；氧化铈纳米颗粒降低了HK2细胞的线粒体膜电位和活性氧水平(图7中D、E、F)。
以上的结果说明氧化铈纳米颗粒通过清除活性氧和降低线粒体膜电位水平，从而保护HK2细胞免受缺氧后复氧的损害。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。