一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系
阅读说明：本技术 一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系 (Method for improving resistant starch content of wheat through genome editing and technical system thereof ) 是由 夏兰琴 李晶莹 马有志 孙永伟 陈隽 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系。本发明提供了一种通过基因编辑技术提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量的方法,包括如下步骤：降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度。所述“降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度”具体可通过对SBEIIa基因进行基因编辑实现。本发明的发明人利用CRISPR/Cas9技术,定点编辑小麦SBEIIa基因,通过造成移码突变,敲除了小麦SBEIIa基因,获得了直链淀粉、抗性淀粉以及总戊聚糖(健康纤维)含量明显提高的新一代小麦新种质。本发明对于小麦育种具有重大的应用推广价值。(The invention discloses a method for improving the resistant starch content of wheat by genome editing and a technical system thereof. The invention provides a method for improving resistant starch content and/or amylose content and/or total pentosan content in wheat seeds by a gene editing technology, which comprises the following steps: reducing the abundance of SBEIIa protein in wheat. The "reduction of the abundance of the SBEIIa protein in wheat" can be specifically realized by gene editing of the SBEIIa gene. The invention utilizes CRISPR/Cas9 technology to edit wheat SBEIIa gene at fixed point, knocks out the wheat SBEIIa gene by causing frameshift mutation, and obtains a new generation of wheat new germplasm with obviously improved amylose, resistant starch and total pentosan (healthy fiber) content. The invention has great application and popularization value for wheat breeding.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系。
背景技术
糖尿病、肥胖症和结肠癌等疾病是严重危害人类健康的慢性非传染性疾病。糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种因部分或完全胰岛素缺失、或细胞胰岛素受体减少、或受体敏感性下降导致的疾病，是由遗传和环境因素共同作用而导致的一种慢性、全身性的代谢性疾病。糖尿病及其并发症已成为严重危害人类健康的世界性公共卫生问题，引起了世界各国的高度重视。据国家***2004年报告，我国糖尿病患病人数已超过2000万。另据世界卫生组织预测，到2030年时，我国的糖尿病患者人数有可能翻一倍，达到4230万。糖尿病已被列为全球继心血管病、肿瘤之后第3位威胁人类健康的慢性非传染性疾病。糖尿病引起的血糖的代谢异常往往又引起血脂的代谢紊乱，出现高血脂症。这两种因素可导致血液黏稠度升高、血流缓慢，而易形成血栓、动脉硬化，造成血管病变，引起多种严重的慢性系列并发症出现。流行病学证据强烈提示在血糖水平、动脉粥样硬化形成、心血管事件的发生以及发病率和死亡率增加之间的相关关系。
抗性淀粉(resistant starch)又称抗酶解淀粉及难消化淀粉，主要存在于高直链、低支链淀粉籽粒或块茎中，其含量与高直链淀粉含量直线正相关。研究表明，抗性淀粉不能在小肠消化吸收和提供葡萄糖，可直接进人大肠被生理性细菌发酵，产生多种短链脂肪酸(丁酸等)和气体。此外，抗性淀粉还有刺激有益菌群生长、减少人体热量摄取、控制体重等功能。在小鼠和人类研究中，抗性淀粉可以预防大肠癌，提高大肠中短链脂肪酸含量。高直链淀粉(抗性淀粉)有助于防止非可逆性胰岛素抵抗的发展，降低血浆总脂、胆固醇和甘油三酯的浓度。Mantis等研究表明抗性淀粉可以促进餐后的脂质氧化，长时间食用则可以降低脂肪的累积，帮助控制体重。人体摄入高抗性淀粉食物，具有较少胰岛素反应，可延缓餐后血糖上升，有效控制糖尿病病情。丁玉琴等人对II型糖尿病大鼠血糖血脂水平与抗性淀粉的相关性进行研究，表明抗性淀粉能降低II型糖尿病大鼠血糖血脂和尿素氮，提示抗性淀粉具有减轻糖尿病症状的作用并可能有保护肾脏功能的作用。王竹等研究的抗性淀粉的代谢及对血糖的调节作用，证明抗性淀粉具有吸收慢的代谢特点，对调节血糖稳态，降低餐后胰岛素分泌，增强胰岛素敏感性有一定作用，并初步论述了抗性淀粉对餐后体内葡萄糖转运的影响，综合其他研究成果，预示抗性淀粉可能对预防慢性疾病的发生，减少餐后组织负荷有益。1992年，世界粮农组织(FAO)根据Englyst和欧洲抗性淀粉研究协作网(EURESTA)的建议，将抗性淀粉定义为：健康者小肠中不吸收的淀粉及其降解产物。此外，抗性淀粉具有低持水能力等加工特性，可以用于改善食品的加工工艺，增加食品的脆度、膨胀性及提高最终产品的质地。因此，可将其作为食品膳食纤维的功能成分，适量添加在食品中，制成不同特色的风味食品和功能食品。目前，国外已将抗性淀粉作为食品原配料或膳食纤维的强化剂应用到面类食品中，如面包、馒头、包子、通心面、饼干等。其中，值得一提的是抗性淀粉在面包中的应用。添加抗性淀粉的面包不仅膳食纤维成分得到了强化，而且在气孔结构、均匀性、体积和颜色等感官品质方面均比添加其他传统膳食纤维的营养强化面包好。抗性淀粉添加到通心粉和面条中可增加其耐煮性，有利于维持韧性结构，避免煮后出现粘连现象。因此，培育高抗性淀粉小麦，对人类健康和丰富膳食多样性具有重要意义。
普通小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD,2n＝6x＝42)是重要的粮食作物，在世界范围内超过40％的人口以小麦为主食。它是人类蛋白质主要摄取来源，同时富含维生素B、维生素E、纤维及镁、磷等物质。淀粉是小麦籽粒的主要组成部分，占小麦胚乳重量的80％以上。淀粉是由直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)以一定形式排列、堆积形成的具有结晶区和无定形区的颗粒，其中直链淀粉占胚乳淀粉的15％-25％，支链淀粉占75％-85％。根据形态大小，小麦淀粉又可分为A型、B型和C型淀粉三类。其中，A型淀粉一般为圆形，颗粒直径一般在10-35μm之间，B型淀粉一般为球形或多边形，颗粒直径一般在3-10μm之间，C型淀粉颗粒一般小于3μm。淀粉合成过程受到一系列酶的调控。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系。
本发明提供了一种提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量的方法，包括如下步骤：降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度。
所述“降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度”具体可通过抑制SBEIIa基因表达实现。所述“降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度”具体可通过敲除SBEIIa基因实现。所述敲除包括敲除整个基因，也包括敲除基因的部分区段。
所述“降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度”具体可通过沉默SBEIIa基因实现。
所述“降低小麦中SBEIIa蛋白的丰度”具体可通过对SBEIIa基因进行基因编辑实现。
本发明提供了一种提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量的方法，包括如下步骤：对SBEIIa基因进行基因编辑。
以上任一所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。
所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA(sgRNA1)的靶标序列如下：tcctgagccgcgcggcctct。
所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA(sgRNA2)的靶标序列如下：gggaaggtcctggtgcctga。
所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA1的编码基因的特异DNA分子实现的。所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有所述特异DNA分子的重组质粒实现的。
所述基因编辑是通过在受体小麦中导入分别含有Cas9蛋白的编码基因的DNA分子和含有sgRNA1的编码基因的DNA分子实现的。
所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA2的编码基因的特异DNA分子实现的。所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有所述特异DNA分子的重组质粒实现的。
所述基因编辑是通过在受体小麦中导入分别含有Cas9蛋白的编码基因的DNA分子和含有sgRNA2的编码基因的DNA分子实现的。
本发明还保护特异sgRNA。所述特异sgRNA为sgRNA1或sgRNA2。
本发明还保护特异重组质粒。所述特异重组质粒为pCXUN-Cas9-gRNA1或pCXUN-Cas9-gRNA2。
sgRNA1的靶标序列如下：tcctgagccgcgcggcctct。
sgRNA2的靶标序列如下：gggaaggtcctggtgcctga。
pCXUN-Cas9-gRNA1含有Cas9蛋白的编码基因和所述sgRNA1的编码基因。
pCXUN-Cas9-gRNA2含有Cas9蛋白的编码基因和所述sgRNA2的编码基因。
所述Cas9蛋白的编码基因具体可为与序列表的序列1中第392-4522位核苷酸反向互补的DNA分子。
pCXUN-Cas9-gRNA1具体可如序列表的序列1所示。
与pCXUN-Cas9-gRNA1相比，pCXUN-Cas9-gRNA2的差异仅在于，用“GGGAAGGTCCTGGTGCCTGA”取代了“AGAGGCCGCGCGGCTCAGGA”。
本发明还保护一种制备转基因小麦的方法，包括如下步骤：将所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入受体小麦，得到种子中抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量高于所述受体小麦的转基因小麦。所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因具体通过所述重组质粒导入受体小麦。
本发明还保护一种制备基因编辑小麦的方法，包括如下步骤：将所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入受体小麦，得到转基因小麦,从中鉴定发生基因编辑的小麦及其基因编辑类型(从转基因小麦中筛选发生基因编辑且SBEIIa基因表达被抑制的小麦)；然后将转基因基因编辑小麦自交，获得自交后代；然后从自交后代中筛选无转基因的基因编辑小麦，所述无转基因的基因编辑小麦种子中抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量高于所述受体小麦。所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因具体通过所述重组质粒导入受体小麦。
所述基因编辑小麦为满足如下条件的小麦：A基因组、B基因组和D基因组均在靶区域发生突变，且均为纯合突变型。
所述基因编辑小麦为满足如下条件的小麦：A基因组、B基因组和D基因组均在靶区域发生突变，且均为纯合突变型；不携带载体序列。
所述基因编辑小麦具体可为：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”的T1代植株。
所述基因编辑小麦具体可为：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型且不携带载体序列”的T1代植株。
将基因编辑小麦自交得到的后代，即为基因编辑株系。
本发明还保护所述特异sgRNA或所述特异重组质粒在小麦育种中的应用；所述小麦育种的目的为提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量。
本发明还保护一种提高小麦种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量和/或总戊聚糖含量的方法，包括如下步骤：抑制小麦中SBEIIa蛋白的活性。
所述SBEIIa蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由序列表中序列2或序列4或序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质；
(a3)来源于小麦且与(a1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
所述SBEIIa基因为编码所述SBEIIa蛋白的核酸分子。
所述SBEIIa基因为如下1)或2)或3)或4)或5)或6)或7)或8)的DNA分子：
1)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；
2)编码区如序列表中序列5所示的DNA分子；
3)编码区如序列表中序列7所示的DNA分子；
4)序列表中序列3所示的DNA分子；
5)序列表中序列5所示的DNA分子；
6)序列表中序列7所示的DNA分子；
7)在严格条件下与1)至6)中任一限定的DNA序列杂交且编码所述SBEIIa蛋白的DNA分子；
8)来源于小麦且与1)至6)中任一限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码所述SBEIIa蛋白的DNA分子。
所述sgRNA1的编码基因如序列表的序列1中第6915-7017位核苷酸所示。
与sgRNA1的编码基因相比，sgRNA2的编码基因的差异仅在于，用“GGGAAGGTCCTGGTGCCTGA”取代了“AGAGGCCGCGCGGCTCAGGA”。
所述受体小麦具体可为小麦品种郑麦7698。
本发明的发明人利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑小麦SBEIIa基因，通过造成移码突变，敲除了小麦SBEIIa基因，获得了直链淀粉、抗性淀粉以及总戊聚糖(健康纤维)含量明显提高的新一代小麦新种质。获得的SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的编辑株系与野生型对照相比，种子直链淀粉、抗性淀粉以及总戊聚糖含量均明显增加，聚合度DP 9–12之间的支链淀粉减少，而聚合度DP>13的长链淀粉增加。RVA测定结果表明：其淀粉峰值粘度值和最终粘度值均明显下降。本发明对于小麦育种具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为实施例2中5株再生植株进行酶切后的电泳图
图2为实施例2中5株再生植株进行测序后的结果
图3为实施例2中部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果
图4为实施例3中2株再生植株进行酶切后的电泳图
图5为实施例3中2株再生植株的部分测序结果
图6为实施例3中部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果
图7为实施例4中淀粉颗粒性状分析的结果。
图8为实施例4中直链淀粉及抗性淀粉含量测定的结果。
图9为实施例4中淀粉RVA值的测定的结果。
图10为实施例4中淀粉链长分布分析的结果。
图11位实施例4中总戊聚糖含量测定的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
小麦品种郑麦7698。提及“郑麦7698”的文献(在文献中称为“Zhengmai7698”)：GuoG,Lei M,Wang Y,Song B,Yang J，et al.Accumulation of As,Cd,and Pb in sixteenwheat cultivars grown in contaminated soils and associated health riskassessment[J].Journal of Environmental Research and Public Health,2018,15(11):2601.。郑麦7698用WT表示，A基因组中的相应序列用WT-A表示，B基因组中的相应序列用WT-B表示，D基因组中的相应序列用WT-D表示。
实施例1、制备重组质粒
人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1和重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1和重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2均为环形质粒。
重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，第115-367位核苷酸与NOS终止子反向互补，第392-4522位核苷酸与Cas9蛋白的编码基因反向互补，第4544-6533位核苷酸与Ubi启动子反向互补，第6552-6914位核苷酸为U6启动子，第6915-7017位核苷酸为sgRNA1的编码基因(其中第6915-6934位核苷酸为靶序列识别区)。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1表达sgRNA1，sgRNA1的靶序列位于小麦SBEIIa基因的第二外显子中。
与重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1相比，重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2的差异仅在于，用“GGGAAGGTCCTGGTGCCTGA”取代了“AGAGGCCGCGCGGCTCAGGA”。“GGGAAGGTCCTGGTGCCTGA”为sgRNA2的靶序列识别区。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2表达sgRNA2，sgRNA2的靶序列位于小麦SBEIIa基因的第二外显子中。
小麦cDNA中：A基因组(对应A染色体组)中的SBEIIa基因的编码区如序列表的序列3所示(编码序列表的序列2所示的蛋白质)，序列3中第146-243位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子；B基因组(对应B染色体组)中的SBEIIa基因的编码区如序列表的序列5所示(编码序列表的序列4所示的蛋白质)，序列5中第143-243位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子；D基因组(对应D染色体组)中的SBEIIa基因的编码区如序列表的序列7所示(编码序列表的序列6所示的蛋白质)，序列7中第134-231位核苷酸为基因组DNA中该基因的第二外显子。
实施例2、利用sgRNA1通过基因枪法获得基因编辑小麦
一、基因枪介导的小麦遗传转化
1、取授粉后14天左右的小麦品种郑麦7698的幼胚，作为外植体。将外植体接种于诱导培养基(MS+1mg/L VB1+150mg/L ASP+2mg/L 2,4-D)，22-25℃暗培养1-2天。
2、以重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1作为待转化DNA，采用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因枪对完成步骤1的幼胚进行轰击(Psi900，27.5cm Hg柱)，轰击后的幼胚转移到新的诱导培养基上，22-25℃暗培养2-3周。
3、取完成步骤2的外植体，依次进行再生、筛选和壮苗，得到T0代再生植株。
二、定点编辑的检测
1、对T0代再生植株的鉴定
供试植株为：102株步骤一得到的T0代再生植株、郑麦7698(作为再生植株的参照植株)。
(1)提取供试植株的叶片的基因组DNA，分别采用三个特异引物对进行PCR扩增。三个特异引物对分别为：SBE-C2-AF1和SBE-C2-AR1组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列8所示，小麦A基因组中SBEIIa基因的第二外显子位于其中)、SBE-C2-BF1和SBE-C2-BR1组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列9所示，小麦B基因组中SBEIIa基因的第二外显子位于其中)、SBE-C2-DF1和SBE-C2-DR1组成的引物对(小麦基因组DNA中引物对的靶序列如序列表的序列10所示，小麦D基因组中SBEIIa基因的第二外显子位于其中)。
SBE-C2-AF1：CGCTCCAATCTCCCCGTCCA；SBE-C2-AR1：GAAGATTTCCCGGCACGATG；
SBE-C2-BF1：TCTCCCCGTCTGTTTTTGGG；SBE-C2-BR1：GTTGCGCTGGAGTGGCCGCC；
SBE-C2-DF1：CTCGAATCTCCCCCGTCTGGC；SBE-C2-DR1：CCTGACGCATCCGTGGTTG。
(2)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，用限制性内切酶DdeI进行单酶切，然后进行电泳。
(3)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，进行测序。
如果再生植株的PCR扩增产物只有一种，且与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，该再生植株为野生型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，一种与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，另一种与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、***或替换)，该再生植株为杂合型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，均与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、***或替换)，该再生植株为双等位突变型。如果再生植株的PCR扩增产物为一种，且与郑麦7698的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、***或替换)，该再生植株为纯合突变型。野生型的再生植株的酶切产物电泳显示两条带，杂合型的再生植株的酶切产物电泳显示三条带，双等位突变型的再生植株和纯合突变型的再生植株显示一条带。如果再生植株的PCR扩增产物为三种以上，该再生植株为嵌合型。杂合型、双等位突变型、纯合突变型、嵌合型的植株统称为编辑植株。
102株再生植株中，5株为编辑植株(4.9％)，97株为野生型(94.1％)。
5株再生植株进行酶切后的电泳图见图1。图1中：M：DL2000 Marker；1代表T0代植株B017-1、2代表T0代植株B13-C14、3代表T0代植株B62-16、4代表T0代植株B86-E8、5代表T0代植株B49-S70；Wild type代表郑麦7698，+代表酶切产物，-代表PCR扩增产物。
5株再生植株进行测序后的结果见图2。图2中：CCG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，“-”表示碱基删除。
(4)提取供试植株的叶片的基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因，采用TaU6F和gRNAR组成的引物对鉴定sgRNA基因；采用HptF和HptR组成的引物对鉴定hptII基因。
Cas9-F：5’-TCGACAAGAAGTACTCCATCGGC-3’；Cas9-R：5’-CAAGAGAGAGGGCGATCAGGTTG-3’。
TaU6F：5’-GCACTGCAGGAATTCGATATCAAGC-3’；gRNAR：5’-CCAATACGCAAACCGCCTCTC-3’。
HptF：5’-GAGGGCGTGGATATGTCCTG-3’；HptR：5’-ATTGACCGATTCCTTGCGGT-3’。
5株再生植株基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带sgRNA1基因的情况和携带hptII基因的情况见表1。
表1
注：i代表***，i1代表***1个核苷酸，依次类推；d代表缺失，d1代表缺失1个核苷酸，依次类推；wt代表野生型；“/”的前和后分别代表两条染色体；例如，d15/d42代表对于A基因组中的靶序列来说，一条染色体为d15，另一条染色体为d42。例如，d5i3代表对于B基因组中的靶序列来说，两条染色体均为d5i3。Y代表鉴定结果为阳性，N代表鉴定结果为阴性。
2、对T1代植株的鉴定
取T0代植株B017-1、T0代植株B13-C14、T0代植株B62-16、T0代植株B86-E8、T0代植株B49-S70，分别进行自交并收获T1代种子，培育T1代种子获得T1代植株。
按照步骤1的方法，对各个T1代植株进行鉴定。
部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果见图3(Actin为内参基因)。图3中，WT代表郑麦7698，1-23代表不同的T1代植株。
各项鉴定的结果见表2。
表2
注：相关符号的含义同表1；6d42/d15代表6株为d42/d15杂合双等位突变,16d5i3代表16株为d5i3纯合突变，以此类推。
结果表明，T0代SBEIIa被定点突变的纯合株系可以稳定遗传T1代，对于定点编辑的SBEIIa的双等位突变株系通过严格的自交，T1分离情况符合孟德尔遗传规律，在T1代株系中没有发现新的变异类型。在T1代可获得靶区域发生突变且不携带载体序列的编辑株系。
3、CRISPR/Cas9的脱靶分析
根据网上预测软件(http://crispr.dbcls.jp/)，对SBEIIa基因的sgRNA1靶点可能存在的脱靶位点进行预测，并根据可能存在脱靶位点的侧翼序列设计引物：OFT1F1和OFT1R1组成的引物对，OFT1F2和OFT1R2组成的引物对，OFT1F3和OFT1R3组成的引物对。
OFT1F1：5’-AGCGCTTGCTTTACTAGGGT-3’；OFT1R1：5’-GTCATCGGCATGTGGCAAAG-3’。
OFT1F2：5’-AGGGGGTAAACCTTGTGCAG-3’；OFT1R2：5’-CGAAACTTTTCCACGCGCAG-3’。
OFT1F3：5’-GAAGACACGTTCCTGCTCCA-3；OFT1R3：5’-GCCCGGCGGAGAATAGATAC-3’。
(1)取102株步骤一得到的再生植株(即步骤1中的102株植株)，提取基因组DNA。
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用OFT1F1和OFT1R1组成的引物对、OFT1F2和OFT1R2组成的引物对、OFT1F3和OFT1R3组成的引物对进行PCR扩增。
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行测序。
脱靶位点的信息见表3。
表3
结果表明，对于上述3个预测的可能脱靶位点，102株植株均未检测到脱靶现象，即gRNA1并不存在脱靶情况。
实施例3、利用sgRNA2通过基因枪法获得基因编辑小麦
一、转基因植物的获得
用重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2代替重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA1，按照实施例2的步骤一进行操作。
二、定点编辑的检测
1、对T0代再生植株的鉴定
供试植株为：62株步骤一得到的T0代再生植株、郑麦7698(作为再生植株的参照植株)。
(1)提取供试植株的叶片的基因组DNA，分别采用三个特异引物对进行PCR扩增。三个特异引物对分别为：SBE-C2-AF1和SBE-C2-AR1组成的引物对、SBE-C2-BF1和SBE-C2-BR1组成的引物对、SBE-C2-DF1和SBE-C2-DR1组成的引物对。
(2)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，将PCR扩增产物与郑麦7698的PCR产物等量混匀，然后依次进行加热变性和退火复性，然后采用T7 endonuclease I(T7EI)进行单酶切，然后进行电泳。T7EI能识别并切割不完全配对DNA。
(3)完成步骤(1)后，回收PCR扩增产物，进行测序。
62株再生植株中，2株为编辑植株(3.22％)，60株为野生型(96.78％)。
2株再生植株进行酶切后的电泳图见图4。图4中：M：DL2000 Marker；1代表T0代植株B028-8、2代表T0代植株B041-S103；Wild type代表郑麦7698，+代表酶切产物，-代表PCR扩增产物。
2株再生植株的部分测序结果见图5。图5中：CGG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，“-”表示碱基删除。
(4)提取供试植株的叶片的基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9基因，采用TaU6F和gRNAR组成的引物对鉴定sgRNA基因；采用HptF和HptR组成的引物对鉴定hptII基因。
2株再生植株基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况、携带sgRNA2基因的情况和携带hptII基因的情况见表4。
表4
注：相关符号的含义同表1和表2。
2、对T1代植株的鉴定
取T0代植株B028-8和B041-S103，分别进行自交并收获T1代种子，培育T1代种子获得T1代植株。
按照步骤1的方法，对各个T1代植株进行鉴定。
部分T1代植株进行步骤(4)的鉴定结果见图6(Actin为内参基因)。图6中，WT代表郑麦7698，1-12代表不同的T1代植株。
各项鉴定的结果见表5。
表5
注：相关符号的含义同表1和表2。
结果表明，T0代SBEIIa被定点突变的纯合株系可以稳定遗传T1代，对于定点编辑的SBEIIa的双等位突变株系通过严格的自交，T1分离情况符合孟德尔遗传规律，在T1代株系中没有发现新的变异类型。在T1代可获得靶区域发生突变且不携带载体序列的编辑株系。
3、CRISPR/Cas9的脱靶分析
根据网上预测软件(http://crispr.dbcls.jp/)，对SBEIIa基因的sgRNA2靶点可能存在的脱靶位点进行预测，并根据可能存在脱靶位点的侧翼序列设计引物：OFT2F1和OFT2R1组成的引物对，OFT2F2和OFT2R2组成的引物对。
OFT2F1：5-CATCCGCTCGAACCTGCC-3’；OFT2R1：5-CGACGAGGACAAAACGGC-3’。
OFT2F2：5-CATGCATCGCTTTCGCTTGG-3’；OFT2R2：5-GTGCTATGTGCACCTTCACG-3’。
(1)取62株步骤一得到的再生植株(即步骤1中的62株植株)，提取基因组DNA。
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用OFT2F1和OFT2R1组成的引物对和OFT2F2和OFT2R2组成的引物对进行PCR扩增。
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行测序。
脱靶位点的信息见表6。
表6
结果表明，对于上述2个预测可能脱靶位点，62株植株均未存在脱靶现象，即gRNA2并不存在脱靶情况。
实施例4、性状的检测
一、淀粉颗粒性状分析
供试编辑植株：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株。供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。
正常种植供试编辑植株，收获籽粒。
籽粒中的淀粉颗粒的电镜扫描照片见图7A。与郑麦7698的淀粉粒相比，SBEIIa基因三个基因组均定点突变的植株的淀粉颗粒形状不规则，A型淀粉颗粒较多。
籽粒发育过程中淀粉粒径观察照片见图7B。与郑麦7698的淀粉粒相比，SBEIIa基因三个基因组均定点突变的植株的淀粉颗粒明显表现出不规则形状。
二、直链淀粉及抗性淀粉含量测定
供试编辑植株：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株。供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。
正常培育供试编辑植株，收获籽粒，脱壳，磨粉，去皮，得到待测面粉。
检测待测面粉中总淀粉的质量百分含量(采用Megazyme公司的Total StarchAssay Kit并按说明书进行检测，试剂盒货号K-TSTA)。结果见图8A。结果表明：与郑麦7698相比，SBEIIa基因ABD基因组均被定点敲除的编辑植株的种子制备的待测面粉中，总淀粉含量降低。
检测待测面粉中直链淀粉和支链淀粉的质量百分含量(采用Megazyme公司的Amylose/Amylopectin Assay Kit并按说明书进行检测，试剂盒货号K-AMYL)，计算直链淀粉与支链淀粉的质量比。直链淀粉的质量百分含量见图8B。直链淀粉与支链淀粉的质量比见图8C。结果表明：SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的直链淀粉含量达45％左右，极显著高于对照受体材料郑麦7698；SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的直链淀粉与支链淀粉比值极显著高于对照受体材料郑麦7698。
检测待测面粉中抗性淀粉的质量百分含量(采用Megazyme公司的ResistantStarch Assay Kit并按说明书进行检测，试剂盒货号K-RSTAR)。结果见图8D。郑麦7698种子制备的待测面粉的抗性淀粉含量小于0.5％0，SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的抗性淀粉含量高达5％。
结果表明，SBEIIa基因在小麦三个基因组中的敲除突变，可明显提高直链淀粉和抗性淀粉的含量。
三、淀粉RVA值的测定
供试编辑植株：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株。供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。
正常培育供试编辑植株，收获籽粒，脱壳，去皮，磨粉，得到待测面粉。采用配套软件为TCW(Thermal Cycle for Windows)的3D型黏度速测仪(澳大利亚NewportScientific仪器公司)检测待测面粉的淀粉黏滞性谱(RVA谱)。
结果见图9。结果表明，SBEIIa基因ABD三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的淀粉峰值粘度值和最终粘度值显著低于郑麦7698。
四、淀粉链长分布分析
供试编辑植株：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株。供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。
正常培育供试编辑植株，收获籽粒，脱壳，去皮，磨粉，得到待测面粉。利用美国DionexCo公司生产的BioLC分析仪器检测待测面粉的支链淀粉链长聚合度平均值进行比较分析。
相对链长分布＝转基因植株的种子制备的待测面粉中支链淀粉的链长分布-郑麦7698种子制备的待测面粉中支链淀粉的链长分布。
链长分布的结果见图10A，相对链长分布的结果见图10B。结果表明：与郑麦7698相比，SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉中，聚合度DP<9的支链淀粉增加，DP 9-12之间的支链淀粉减少，DP 13-19的支链淀粉增加，DP 20-33的支链淀粉减少，而聚合度DP>35的长链淀粉增加。
五、总戊聚糖含量测定
供试编辑植株1：实施例3得到的T0代植株B028-8自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组wt野生型且B基因组wt野生型且D基因组d7纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。
供试编辑植株2：实施例2得到的T0代植株B86-E8自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d8纯合突变型且B基因组d1纯合突变型且D基因组wt野生型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。
供试编辑植株3：实施例2得到的T0代植株B49-S70自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组i1纯合突变型且B基因组wt野生型且D基因组d1纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。
供试编辑植株4：实施例2得到的T0代植株B13-C14自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d6纯合突变型且B基因组d7纯合突变型且D基因组i1纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。
供试编辑植株5：实施例3得到的T0代植株B041-S103自交得到T1代植株,从中选择基于靶序列的突变类型为“A基因组d13纯合突变型且B基因组d10纯合突变型且D基因组d41纯合突变型”并且不携带载体序列的T1代植株，将选择的该T1代植株自交，获得T2代植株，该T2代植株作为供试编辑植株。
郑麦7698作为供试编辑植株的野生型对照植株。
每种供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。
正常培育供试编辑植株，收获籽粒，脱壳，磨粉，去皮，得到待测面粉。检测待测面粉中的总戊聚糖含量。总戊聚糖含量的测定方法见文献：Butardo VM,Fitzgerald MA,BirdAR,Gidley MJ,Flanagan BM,Larroque O,Resurreccion AP,Laidlaw HK,Jobling SA,Morell MK,Rahman S，et al.Impact of down-regulation of starch branching enzymeIIb in rice by artificial microRNA-and hairpin RNA-mediated RNA Silencing[J]Journal of Experimental Botany,2011Oct；62(14):4927-41.。
待测面粉中总戊聚糖的质量百分含量(％)见图11。结果表明：与郑麦7698相比，SBEIIa基因被敲除的不同基因型的植株的种子制备的待测面粉中戊聚糖的含量均有所提高，SBEIIa基因的三个基因组均被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的总戊聚糖含量最高。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系
<130> GNCYX192067
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15756
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gaattcgagc tcggtacccc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt 60
aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcccgatcta 120
gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt 180
ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata 240
acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta attcaacaga aattatatga 300
taatcatcgc aagaccggca acaggattca atcttaagaa actttattgc caaatgtttg 360
aacgatcggg gaaattcgga tccccaatac ttcaatcgcc gccgagttgt gagaggtcga 420
tgcgtgtctc gtagaggcct gtgatagact ggtggatgag ggtggcgtcg agaacctcct 480
tggtagaggt gtagcgcttg cggtcgatgg tggtgtcgaa gtacttgaag gcggctggag 540
cgccgaggtt ggtgagggtg aagaggtgga tgatgttctc ggcctgctcg cgaattggct 600
tatcgcggtg cttgttgtag gcgctgagca ccttatcgag gttggcatcg gcgaggatca 660
cgcgcttgga gaactcggag atctgctcga tgatctcgtc gaggtagtgc ttgtgctgct 720
cgacgaacag ctgcttttgc tcgttgtcct ctggggagcc cttgagcttc tcgtagtggg 780
aggcgaggta gaggaagttc acgtacttgg acgggagagc aagctcgttg cccttctgaa 840
gctcgccagc agaggcgagc attctcttgc ggccgttctc aagctcgaag aggctgtact 900
tcgggagctt gatgatgagg tccttcttca cctccttgta gcccttggcc tcgaggaagt 960
cgattgggtt cttctcgaag ctgctgcgct ccatgatcgt gatgcccagc agctccttga 1020
cggacttgag cttcttgctc ttgcccttct cgaccttggc aaccacgagc acagagtagg 1080
ccacggtcgg agaatcgaag ccgccatact tcttcgggtc ccagtccttc ttgcgggcga 1140
tcagcttgtc ggagttgcgc tttgggagga tggactcctt ggagaagccg ccggtctgaa 1200
cctcggtctt cttcacgatg ttcacttgcg gcatggagag caccttgcgc actgtggcga 1260
aatccctgcc cttgtcccac acgatctcgc ctgtctcgcc gtttgtctcg atgagcggcc 1320
tcttcctaat ctcgccgttg gcgagcgtga tctcggtctt gaagaaattc atgatgttgg 1380
agtagaagaa gtacttggcg gtcgccttgc cgatctcttg ctcggacttg gcgatcatct 1440
tgcgcacgtc gtacaccttg tagtcgccgt acacgaactc ggactcgagc tttgggtact 1500
tcttgatgag ggctgtgccc accacggcat tgaggtaggc gtcgtgggcg tggtggtagt 1560
tgttgatctc gcgcaccttg tagaactgga agtccttgcg gaagtcggac acgagcttgg 1620
acttgagggt gatgaccttc acctcgcgga tgagcttgtc gttctcgtcg tacttggtgt 1680
tcatgcggga gtcgaggatc tgggccacgt gctttgtgat ctggcgtgtc tcgacgagct 1740
ggcgcttgat gaagccggcc ttatcaagct cggaaaggcc gcctctctcg gccttggtga 1800
ggttgtcgaa cttcctctgg gtgatgagct tggcgttgag gagctggcgc cagtagttct 1860
tcatcttctt gacgacctct tcggacggca cgttatcgga cttgcccctg ttcttgtcgg 1920
agcgggtgag caccttgttg tcgatggagt cgtccttcag gaaggactgc ggcacaatat 1980
ggtccacgtc gtagtcggag aggcggttga tgtccagctc ttggtccacg tacatgtcgc 2040
ggccgttctg gaggtagtag aggtagagct tctcgttctg gagctgggtg ttctcgactg 2100
ggtgctcctt gaggatctgg gagcccagct ccttaatgcc ctcctcgatc ctcttcatgc 2160
gctcgcggga gttcttttgg cccttctgtg tggtctggtt ctcgcgggcc atctcgatca 2220
cgatgttctc tggcttgtgc ctgcccatca ccttcaccag ctcgtccacc accttcacgg 2280
tctggagaat gcccttcttg atagccgggg agccggcgag attggcgata tgctcatgga 2340
gggaatcgcc ttggccggac acctgggcct tttggatgtc ctccttgaag gtgagggagt 2400
cgtcgtggat gagctgcatg aagttgcggt tggcgaagcc gtcggacttg aggaagtcga 2460
ggatcgtctt gccggactgc ttgtcgcgga tgccgttgat gagcttccta gagagcctgc 2520
cccagccggt atagcgcctg cgcttcagct gcttcatcac cttgtcgtcg aagaggtggg 2580
cgtatgtctt gaggcgctcc tcgatcatct cgcggtcctc gaagagggtg agggtgagca 2640
cgatgtcctc gaggatgtcc tcgttctcct cgttgtcgag gaagtccttg tccttgataa 2700
tcttgaggag gtcgtggtag gtcccgaggg aggcattgaa cctatcctcg acgccggaga 2760
tctcgacgga gtcgaagcac tcgattttct tgaagtagtc ctccttgagc tgcttcacgg 2820
tcaccttgcg gttggtcttg aacagcaggt cgacgatggc cttcttttgc tcgccgctaa 2880
ggaaagctgg cttcctcatc ccctcggtca cgtacttcac cttggtcagc tcgttgtaca 2940
cggtgaagta ctcgtagagg agtgagtgct tcgggagcac cttctcgttc gggaggttct 3000
tgtcgaagtt ggtcatgcgc tcgatgaaag actgggcaga ggcgccctta tccaccacct 3060
cctcgaagtt ccagggggtg attgtctcct cggactttct ggtcatccag gcgaacctgg 3120
agttgcccct ggcgagcggg cccacgtagt acgggatgcg gaaggtgagg atcttctcaa 3180
tcttctcgcg gttgtccttg aggaacgggt agaagtcctc ttgcctgcgg aggatagcat 3240
gaagctcgcc gaggtggatc tggtgcggga tggagccatt atcgaaggtg cgctgcttgc 3300
ggaggaggtc ctctctattg agcttcacga gcagctcctc ggtgccgtcc atcttctcga 3360
ggatcggctt gatgaacttg tagaactcct cttgagaagc gccgccatcg atgtagccgg 3420
cgtagccgtt cttggactgg tcgaagaaga tctccttgta cttctctggg agctgctgtc 3480
tcacgagggc cttgaggagt gtgaggtcct ggtggtgctc gtcgtacctc ttgatcatgg 3540
aggcggagag tggggccttg gtgatctcgg tgttcaccct gaggatgtcg ctgaggagga 3600
tggcgtcgga gagattcttg gcggcgagga acagatcggc gtactgatcg ccaatctggg 3660
cgaggagatt gtcgaggtcg tcgtcgtagg tgtccttgga aagctggagc ttggcgtcct 3720
cggcgaggtc gaagttggac ttgaagttcg gggtgaggcc aagagagagg gcgatcaggt 3780
tgccgaagag gccattcttc ttctcgcccg gaagttgggc gatcagattc tcgagcctgc 3840
gggacttaga gagcctggca gagagaatag ccttggcgtc aacgccagag gcgttgatcg 3900
ggttctcctc gaacagctgg ttgtaggtct gcacgagctg gatgaacagc ttgtccacat 3960
cggagttgtc cgggttgagg tcgccctcga tgaggaagtg gcccctgaac ttgatcatgt 4020
gggcgagggc gaggtagatg agcctgaggt cggccttatc ggtggagtcg acgagcttct 4080
tgcggaggtg gtagatggtc gggtacttct cgtggtaggc cacctcatcc acgatgttgc 4140
cgaagatcgg atggcgctcg tgcttcttgt cctcctcgac gaggaagctc tcctcgagcc 4200
tgtggaagaa gctgtcgtcc accttggcca tctcgttgga gaagatctct tggaggtagc 4260
agatgcggtt cttgcgcctg gtgtacctgc gtctagcggt cctcttgagc cttgtagcct 4320
cggctgtctc gccagagtcg aacagcaggg cgccgatgag attcttcttg atggagtggc 4380
ggtcggtgtt gccgaggacc ttgaacttct tggacggcac cttgtactcg tcggtgatca 4440
cggcccagcc aacagaattg gtgccgatgt cgaggccgat ggagtacttc ttgtcgacct 4500
tgcgcttctt ctttggggcc atagtattgg ggatcccccg ggctgcagaa gtaacaccaa 4560
acaacagggt gagcatcgac aaaagaaaca gtaccaagca aataaatagc gtatgaaggc 4620
agggctaaaa aaatccacat atagctgctg catatgccat catccaagta tatcaagatc 4680
aaaataatta taaaacatac ttgtttatta taatagatag gtactcaagg ttagagcata 4740
tgaatagatg ctgcatatgc catcatgtat atgcatcagt aaaacccaca tcaacatgta 4800
tacctatcct agatcgatat ttccatccat cttaaactcg taactatgaa gatgtatgac 4860
acacacatac agttccaaaa ttaataaata caccaggtag tttgaaacag tattctactc 4920
cgatctagaa cgaatgaacg accgcccaac cacaccacat catcacaacc aagcgaacaa 4980
aaagcatctc tgtatatgca tcagtaaaac ccgcatcaac atgtatacct atcctagatc 5040
gatatttcca tccatcatct tcaattcgta actatgaata tgtatggcac acacatacag 5100
atccaaaatt aataaatcca ccaggtagtt tgaaacagaa ttctactccg atctagaacg 5160
accgcccaac cagaccacat catcacaacc aagacaaaaa aaagcatgaa aagatgaccc 5220
gacaaacaag tgcacggcat atattgaaat aaaggaaaag ggcaaaccaa accctatgca 5280
acgaaacaaa aaaaatcatg aaatcgatcc cgtctgcgga acggctagag ccatcccagg 5340
attccccaaa gagaaacact ggcaagttag caatcagaac gtgtctgacg tacaggtcgc 5400
atccgtgtac gaacgctagc agcacggatc taacacaaac acggatctaa cacaaacatg 5460
aacagaagta gaactaccgg gccctaacca tggaccggaa cgccgatcta gagaaggtag 5520
agaggggggg ggggggagga cgagcggcgt accttgaagc ggaggtgccg acgggtggat 5580
ttgggggaga tctggttgtg tgtgtgtgcg ctccgaacaa cacgaggttg gggaaagagg 5640
gtgtggaggg ggtgtctatt tattacggcg ggcgaggaag ggaaagcgaa ggagcggtgg 5700
gaaaggaatc ccccgtagct gccgtgccgt gagaggagga ggaggccgcc tgccgtgccg 5760
gctcacgtct gccgctccgc cacgcatttc tggatgccga cagcggagca agtccaacgg 5820
tggagcggaa ctctcgagag gggtccagag gcagcgacag agatgccgtg ccgtctgctt 5880
cgcttggccc gacgcgacgc tgctggttcg ctggttggtg tccgttagac tcgtcgacgg 5940
cgtttaacag gctggcatta tctactcgaa acaagaaaaa tgtttcctta gtttttttaa 6000
tttcttaaag ggtatttgtt taatttttag tcactttatt ttattctatt ttatatctaa 6060
attattaaat aaaaaaacta aaatagagtt ttagttttct taatttagag gctaaaatag 6120
aataaaatag atgtactaaa aaaattagtc tataaaaacc attaacccta aaccctaaat 6180
ggatgtacta ataaaatgga tgaagtatta tataggtgaa gctatttgca aaaaaaaagg 6240
agaacacatg cacactaaaa agataaaact gtagagtcct gttgtcaaaa tactcaattg 6300
tcctttagac catgtctaac tgttcattta tatgattctc taaaacactg atattattgt 6360
agtactatag attatattat tcgtagagta aagtttaaat atatgtataa agatagataa 6420
actgcacttc aaacaagtgt gacaaaaaaa atatgtggta attttttata acttagacat 6480
gcaatgctca ttatctctag agaggggcac gaccgggtca cgctgcactg caggaattcg 6540
atatcaagct tgaccaagcc cgttattctg acagttctgg tgctcaacac atttatattt 6600
atcaaggagc acattgttac tcactgctag gagggaatcg aactaggaat attgatcaga 6660
ggaactacga gagagctgaa gataactgcc ctctagctct cactgatctg ggtcgcatag 6720
tgagatgcag cccacgtgag ttcagcaacg gtctagcgct gggcttttag gcccgcatga 6780
tcgggctttt gtcgggtggt cgacgtgttc acgattgggg agagcaacgc agcagttcct 6840
cttagtttag tcccacctcg cctgtccagc agagttctga ccggtttata aactcgcttg 6900
ctgcatcaga cttgagaggc cgcgcggctc aggagtttta gagctagaaa tagcaagtta 6960
aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttggt 7020
accctgcatg ggagaggcgg tttgcgtatt ggtttaaaca tagctaaact atcagtgttt 7080
gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taacggatat 7140
ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc caaccacagg 7200
gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg ctgctatagt gcagtcggct 7260
tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc gcacaagtcc taagttacgc 7320
gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt agtcgcataa 7380
agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat gaacaagagc gccgccgctg 7440
gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac caacgggccg 7500
aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc accaggcgcg 7560
accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctagccct ggcgacgttg tgacagtgac 7620
caggctagac cgcctggccc gcagcacccg cgacctactg gacattgccg agcgcatcca 7680
ggaggccggc gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc 7740
cggccgcatg gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat 7800
cgaccgcacc cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg 7860
ccctaccctc accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg 7920
caccgtgaaa gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact 7980
tgagcgcagc gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga 8040
cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc 8100
atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg 8160
gagatgatcg cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg 8220
catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc cagcttggcc 8280
gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta aaacagcttg 8340
cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg caaggggaac 8400
gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg accatcgcaa 8460
cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc gattccgatc 8520
cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta accgttgtcg 8580
gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc gacttcgtag 8640
tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag gcagccgact 8700
tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg ggcaaccgcc gacctggtgg 8760
agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc tttgtcgtgt 8820
cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg gccgggtacg 8880
agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc actgccgccg 8940
ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag gtccaggcgc 9000
tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga aaatgagcaa 9060
aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt 9120
ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga 9180
tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc 9240
tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt 9300
tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat 9360
gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc 9420
cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc 9480
ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg 9540
caggccgccc agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg 9600
gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt 9660
aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg 9720
ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac 9780
cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca 9840
gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat 9900
ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc 9960
cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa 10020
gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg 10080
aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc 10140
tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat 10200
tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat 10260
tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca 10320
ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga 10380
gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag 10440
tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac 10500
ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt 10560
gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg 10620
aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt 10680
gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc 10740
taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct 10800
ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta 10860
cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta 10920
cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc 10980
ccacatcaag gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 11040
gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 11100
tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag 11160
cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg 11220
caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc 11280
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 11340
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 11400
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 11460
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 11520
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 11580
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 11640
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tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 11760
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cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 11940
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 12000
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 12060
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 12120
gtcatgcatt ctaggtacta aaacaattca tccagtaaaa tataatattt tattttctcc 12180
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ggacaatccg atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata cagctcgata 12600
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ttataccggc tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat tttctcccac cagcttatat 12840
accttagcag gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc gatcagtttt 12900
ttcaattccg gtgatattct cattttagcc atttattatt tccttcctct tttctacagt 12960
atttaaagat accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg 13020
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caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt actgaattaa 13440
cgccgaatta attcggggga tctggatttt agtactggat tttggtttta ggaattagaa 13500
attttattga tagaagtatt ttacaaatac aaatacatac taagggtttc ttatatgctc 13560
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<210> 2
<211> 823
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 2
Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Ala Thr Leu Gly Val Ala Arg Pro
1 5 10 15
Ala Gly Ala Gly Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Gly Ser Glu Arg Arg
20 25 30
Gly Gly Val Asp Leu Pro Ser Leu Leu Leu Arg Lys Lys Asp Ser Ser
35 40 45
Arg Ala Val Leu Ser Arg Ala Ala Ser Pro Gly Lys Val Leu Val Pro
50 55 60
Asp Gly Glu Ser Asp Asp Leu Ala Ser Pro Ala Gln Pro Glu Glu Leu
65 70 75 80
Gln Ile Pro Glu Asp Ile Glu Glu Gln Thr Ala Glu Val Asn Met Thr
85 90 95
Gly Gly Thr Ala Glu Lys Leu Glu Ser Ser Glu Pro Thr Gln Gly Ile
100 105 110
Val Glu Thr Ile Thr Asp Gly Val Thr Lys Gly Val Lys Glu Leu Val
115 120 125
Val Gly Glu Lys Pro Arg Val Val Pro Lys Pro Gly Asp Gly Gln Lys
130 135 140
Ile Tyr Glu Ile Asp Pro Thr Leu Lys Asp Phe Arg Ser His Leu Asp
145 150 155 160
Tyr Arg Tyr Ser Glu Tyr Arg Arg Ile Arg Ala Ala Ile Asp Gln His
165 170 175
Glu Gly Gly Leu Glu Ala Phe Ser Arg Gly Tyr Glu Lys Leu Gly Phe
180 185 190
Thr Arg Ser Ala Glu Gly Ile Thr Tyr Arg Glu Trp Ala Pro Gly Ala
195 200 205
His Ser Ala Ala Leu Val Gly Asp Phe Asn Asn Trp Asn Pro Asn Ala
210 215 220
Asp Thr Met Thr Arg Asp Asp Tyr Gly Val Trp Glu Ile Phe Leu Pro
225 230 235 240
Asn Asn Ala Asp Gly Ser Pro Ala Ile Pro His Gly Ser Arg Val Lys
245 250 255
Ile Arg Met Asp Thr Pro Ser Gly Val Lys Asp Ser Ile Ser Ala Trp
260 265 270
Ile Lys Phe Ser Val Gln Ala Pro Gly Glu Ile Pro Phe Asn Gly Ile
275 280 285
Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Lys Tyr Val Phe Gln His Pro Gln
290 295 300
Pro Lys Arg Pro Glu Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Ser His Ile Gly Met
305 310 315 320
Ser Ser Pro Glu Pro Lys Ile Asn Ser Tyr Ala Asn Phe Arg Asp Glu
325 330 335
Val Leu Pro Arg Ile Lys Arg Leu Gly Tyr Asn Ala Val Gln Ile Met
340 345 350
Ala Ile Gln Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr His Val Thr
355 360 365
Asn Phe Phe Ala Pro Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro Glu Asp Leu Lys
370 375 380
Ser Leu Ile Asp Arg Ala His Glu Leu Gly Leu Leu Val Leu Met Asp
385 390 395 400
Ile Val His Ser His Ser Ser Asn Asn Thr Leu Asp Gly Leu Asn Gly
405 410 415
Phe Asp Gly Thr Asp Thr His Tyr Phe His Gly Gly Pro Arg Gly His
420 425 430
His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Ser Trp Glu Val
435 440 445
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450 455 460
Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Met Tyr Thr His
465 470 475 480
His Gly Leu Gln Met Thr Phe Thr Gly Asn Tyr Gly Glu Tyr Phe Gly
485 490 495
Phe Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Val Asn Asp
500 505 510
Leu Ile His Gly Leu His Pro Asp Ala Val Ser Ile Gly Glu Asp Val
515 520 525
Ser Gly Met Pro Thr Phe Cys Ile Pro Val Pro Asp Gly Gly Val Gly
530 535 540
Phe Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Val Ala Asp Lys Trp Ile Glu Leu
545 550 555 560
Leu Lys Gln Ser Asp Glu Ser Trp Lys Met Gly Asp Ile Val His Thr
565 570 575
Leu Thr Asn Arg Arg Trp Leu Glu Lys Cys Val Thr Tyr Ala Glu Ser
580 585 590
His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe Trp Leu Met
595 600 605
Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg Pro Ser Thr Pro
610 615 620
Arg Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu Val Thr
625 630 635 640
Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn Glu Phe
645 650 655
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Met Thr Ser Glu His Gln Tyr Val Ser Arg Lys His Glu Glu Asp Lys
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Val Ile Ile Phe Glu Arg Gly Asp Leu Val Phe Val Phe Asn Phe His
740 745 750
Trp Ser Asn Ser Phe Phe Asp Tyr Arg Val Gly Cys Ser Arg Pro Gly
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Lys Tyr Lys Val Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ala Leu Phe Gly Gly Phe
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Ser Arg Leu Asp His Asp Val Asp Tyr Phe Thr Thr Glu His Pro His
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Asp Asn Arg Pro Arg Ser Phe Ser Val Tyr Thr Pro Ser Arg Thr Ala
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Val Val Tyr Ala Leu Thr Glu
820
<210> 3
<211> 2472
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 3
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<211> 823
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 4
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Gly Val Asp Leu Pro Ser Leu Leu Leu Arg Lys Lys Asp Ser Ser Arg
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Ala Val Leu Ser Arg Ala Ala Ser Pro Gly Lys Val Leu Val Pro Asp
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Asn Asn Ala Asp Gly Ser Pro Ala Ile Pro His Gly Ser Arg Val Lys
245 250 255
Ile Arg Met Asp Thr Pro Ser Gly Val Lys Asp Ser Ile Ser Ala Trp
260 265 270
Ile Lys Phe Ser Val Gln Ala Pro Gly Glu Ile Pro Phe Asn Gly Ile
275 280 285
Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Lys Tyr Val Phe Gln His Pro Gln
290 295 300
Pro Lys Arg Pro Glu Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Ser His Ile Gly Met
305 310 315 320
Ser Ser Pro Glu Pro Lys Ile Asn Ser Tyr Ala Asn Phe Arg Asp Gly
325 330 335
Val Leu Pro Arg Ile Lys Arg Leu Gly Tyr Asn Ala Val Gln Ile Met
340 345 350
Ala Ile Gln Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr His Val Thr
355 360 365
Asn Phe Phe Ala Pro Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro Glu Asp Leu Lys
370 375 380
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385 390 395 400
Ile Val His Ser His Ser Ser Asn Asn Thr Leu Asp Gly Leu Asn Gly
405 410 415
Phe Asp Gly Thr Asp Thr His Tyr Phe His Gly Gly Pro Arg Gly His
420 425 430
His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Ser Trp Glu Val
435 440 445
Leu Arg Phe Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu Glu Glu Tyr Lys
450 455 460
Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Met Tyr Thr His
465 470 475 480
His Gly Leu Gln Met Thr Phe Thr Gly Asn Tyr Gly Glu Tyr Phe Gly
485 490 495
Phe Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Val Asn Asp
500 505 510
Leu Ile His Gly Leu Tyr Pro Asp Ala Val Ser Ile Gly Glu Asp Val
515 520 525
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530 535 540
Phe Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Val Ala Asp Lys Trp Ile Glu Leu
545 550 555 560
Leu Lys Gln Ser Asp Glu Ser Trp Lys Met Gly Asp Ile Val His Thr
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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actccatctg gtgtgaagga ttcgatttct gcttggatca agttctctgt gcaggctcca 840
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