阅读说明：本技术 一种固定化酶法制备三磷酸胞苷的方法 (Method for preparing cytidine triphosphate by immobilized enzyme method ) 是由 邓壮梅 王宏 傅得响 张燕 于 2019-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种固定化酶法制备三磷酸胞苷的方法,具体包括以下步骤：(1)制备CTP生产酶、(2)固定化CTP生产酶、(3)分离产物；本发明采用PPK、HY两种CTP生产酶,只需两步酶促反应即可合成CTP,与传统啤酒酵母生产CTP繁琐的工艺过程相比,反应过程更简单,反应更容易控制,产品质量更加稳定；采用固定化酶催化的方法制备CTP,固定化酶可连续、反复多次使用,大幅的降低了生产成本。同时避免了使用酵母引入的色素及其他类型的核苷酸等杂质,更加易于纯化；且该方法适用于大规模生产CTP。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to a method for preparing cytidine triphosphate by an immobilized enzyme method, which specifically comprises the following steps: (1) preparing a CTP production enzyme, (2) immobilizing the CTP production enzyme, and (3) separating a product; according to the invention, two CTP (phospho-pyruvate carboxylase) enzymes PPK and HY are adopted to produce the enzyme, and the CTP can be synthesized only by two-step enzymatic reaction, so that compared with the traditional process for producing CTP by beer yeast, the reaction process is simpler, the reaction is easier to control, and the product quality is more stable; the CTP is prepared by adopting an immobilized enzyme catalysis method, the immobilized enzyme can be continuously and repeatedly used, and the production cost is greatly reduced. Meanwhile, pigment and other types of nucleotide and other impurities introduced by using yeast are avoided, and the purification is easier; and the method is suitable for large-scale production of CTP.)

一种固定化酶法制备三磷酸胞苷的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种固定化酶法制备三磷酸胞苷的方法。

背景技术

利用酵母菌的糖酵解途径，以胞苷酸为底物，进行基质水平磷酸化合成CTP是最常用的方法，也是目前工业化生产三磷酸胞苷(CTP)普遍采用的方法。然而，经酵母细胞酶系催化合成CTP的反应过程复杂，参与催化反应的酶系众多，反应过程不易控制，产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。酵母细酶系质量不稳定，酶活力下降快，使用寿命短，一般是一次性使用。反应过程需要加入大量的酵母细胞酶液，引入了大量的色素以及酵母中本身存在的其他类核苷酸等杂质给后期纯化带来了很大的困难。在实际应用中酶的成本昂贵，利用游离酶生产CTP，酶活下降迅速，无法有效的回收利用，势必会导致生产成本过高，影响了实际应用价值。

目前，我国CTP生产水平总体还比较低，产品的成本控制、产品质量等方面还有所欠缺。面对以上的技术问题，急需开发新型稳定的反应工艺，简化反应过程提高产品的质量。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种固定化酶法制备三磷酸胞苷的方法，将CTP生产酶固定化，可实现酶的重复和连续利用，大大降低了生产成本，同时固定化酶的使用，产物更容易纯化产品质量更加稳定。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种固定化酶法制备三磷酸胞苷的方法，具体包括以下步骤：

(1)制备CTP生产酶：将CTP生产酶固定于固定化载体上，采用多聚磷酸激酶(EC2.7.4.1,PPK)、尿苷酸激酶(EC 2.7.4.22,Hy)两种酶促反应即可合成，制备固定化CTP生产酶；

(2)固定化CTP生产酶：利用固定化CTP生产酶，催化制备三磷酸胞苷反应液，过滤收集载体，得固定化CTP生产酶；

(3)分离产物：将上述固定化CTP生产酶在反应罐中直接分离，分离后的反应液经滤袋回收固定化CTP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸胞苷干品(CTP)。

优选地，所述制备CTP生产酶：制备高表达多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1,PPK)、尿苷酸激酶(EC 2.7.4.22,Hy)菌株，经发酵完成后离心收集菌体；分别取含PPK的菌体1.0-2.0kg，含Hy的菌体1.0-2.0kg，用10L 0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得CTP生产酶。

优选地，所述固定化CTP生产酶：在恒温搅拌反应罐中加琼脂糖-IDA-Ni2+螯合载体与上述CTP生产酶10L混合，在室温条件下，150rpm搅拌4-6h；过滤收集载体，用0.1MpH7.0磷酸盐缓冲液(含1mol/L氯化钠)洗涤2-4遍，得固定化CTP生产酶。

优选地，所述分离产物：在20L反应罐中配制总体积10L的反应液，含CMP 150-250g，含六偏磷酸钠170-180g，含氯化镁140-160g，CTP4-6g,其余为水；用NaOH调节反应液的pH至7.0，加入上述固定化CTP生产酶0.5-0.8kg，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应4-6h后，经高效液相色谱检测CTP的生成量；反应后的反应液经滤袋回收固定化CTP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸胞苷干品(CTP)。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明采用PPK、HY两种CTP生产酶，只需两步酶促反应即可合成CTP，与传统啤酒酵母生产CTP繁琐的工艺过程相比，反应过程更简单，反应更容易控制，产品质量更加稳定。

2、采用固定化酶催化的方法制备CTP，固定化酶可连续、反复多次使用，大幅的降低了生产成本。同时避免了使用酵母引入的色素及其他类型的核苷酸等杂质，更加易于纯化；且该方法适用于大规模生产CTP。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例一：

一种固定化酶法制备三磷酸胞苷的方法，具体包括以下步骤：

(1)制备CTP生产酶：将CTP生产酶固定于固定化载体上，采用多聚磷酸激酶(EC2.7.4.1,PPK)、尿苷酸激酶(EC 2.7.4.22,Hy)两种酶促反应即可合成，制备固定化CTP生产酶；

(2)固定化CTP生产酶：利用固定化CTP生产酶，催化制备三磷酸胞苷反应液，过滤收集载体，得固定化CTP生产酶；

(3)分离产物：将上述固定化CTP生产酶在反应罐中直接分离，分离后的反应液经滤袋回收固定化CTP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸胞苷干品(CTP)。

具体的，所述制备CTP生产酶：制备高表达多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1,PPK)、尿苷酸激酶(EC 2.7.4.22,Hy)菌株，经发酵完成后离心收集菌体；分别取含PPK的菌体1.0kg，含Hy的菌体1.0kg，用10L 0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得CTP生产酶。

具体的，所述固定化CTP生产酶：在恒温搅拌反应罐中加琼脂糖-IDA-Ni2+螯合载体与上述CTP生产酶10L混合，在室温条件下，150rpm搅拌4h；过滤收集载体，用0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液(含1mol/L氯化钠)洗涤2遍，得固定化CTP生产酶。

具体的，所述分离产物：在20L反应罐中配制总体积10L的反应液，含CMP 150g，含六偏磷酸钠170g，含氯化镁140g，CTP4g,其余为水；用NaOH调节反应液的pH至7.0，加入上述固定化CTP生产酶0.5kg，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应4h后，经高效液相色谱检测CTP的生成量；反应后的反应液经滤袋回收固定化CTP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸胞苷干品(CTP)155g。

实施例二：

一种固定化酶法制备三磷酸胞苷的方法，具体包括以下步骤：

(1)制备CTP生产酶：将CTP生产酶固定于固定化载体上，采用多聚磷酸激酶(EC2.7.4.1,PPK)、尿苷酸激酶(EC 2.7.4.22,Hy)两种酶促反应即可合成，制备固定化CTP生产酶；

(2)固定化CTP生产酶：利用固定化CTP生产酶，催化制备三磷酸胞苷反应液，过滤收集载体，得固定化CTP生产酶；

(3)分离产物：将上述固定化CTP生产酶在反应罐中直接分离，分离后的反应液经滤袋回收固定化CTP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸胞苷干品(CTP)。

具体的，所述制备CTP生产酶：制备高表达多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1,PPK)、尿苷酸激酶(EC 2.7.4.22,Hy)菌株，经发酵完成后离心收集菌体；分别取含PPK的菌体2.0kg，含Hy的菌体2.0kg，用10L 0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得CTP生产酶。

具体的，所述固定化CTP生产酶：在恒温搅拌反应罐中加琼脂糖-IDA-Ni2+螯合载体与上述CTP生产酶10L混合，在室温条件下，150rpm搅拌6h；过滤收集载体，用0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液(含1mol/L氯化钠)洗涤4遍，得固定化CTP生产酶。

具体的，所述分离产物：在20L反应罐中配制总体积10L的反应液，含CMP 250g，含六偏磷酸钠180g，含氯化镁160g，CTP6g,其余为水；用NaOH调节反应液的pH至7.0，加入上述固定化CTP生产酶0.8kg，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应6h后，经高效液相色谱检测CTP的生成量；反应后的反应液经滤袋回收固定化CTP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸胞苷干品(CTP)195g。

实施例三：

一种固定化酶法制备三磷酸胞苷的方法，具体包括以下步骤：

(1)制备CTP生产酶：将CTP生产酶固定于固定化载体上，采用多聚磷酸激酶(EC2.7.4.1,PPK)、尿苷酸激酶(EC 2.7.4.22,Hy)两种酶促反应即可合成，制备固定化CTP生产酶；

(2)固定化CTP生产酶：利用固定化CTP生产酶，催化制备三磷酸胞苷反应液，过滤收集载体，得固定化CTP生产酶；

(3)分离产物：将上述固定化CTP生产酶在反应罐中直接分离，分离后的反应液经滤袋回收固定化CTP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸胞苷干品(CTP)。

具体的，所述制备CTP生产酶：制备高表达多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1,PPK)、尿苷酸激酶(EC 2.7.4.22,Hy)菌株，经发酵完成后离心收集菌体；分别取含PPK的菌体1.5kg，含Hy的菌体1.5kg，用10L 0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得CTP生产酶。

具体的，所述固定化CTP生产酶：在恒温搅拌反应罐中加琼脂糖-IDA-Ni2+螯合载体与上述CTP生产酶10L混合，在室温条件下，150rpm搅拌5h；过滤收集载体，用0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液(含1mol/L氯化钠)洗涤3遍，得固定化CTP生产酶。

具体的，所述分离产物：在20L反应罐中配制总体积10L的反应液，含CMP 200g，含六偏磷酸钠175g，含氯化镁150g，CTP5g,其余为水；用NaOH调节反应液的pH至7.0，加入上述固定化CTP生产酶0.7kg，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应5h后，经高效液相色谱检测CTP的生成量；反应后的反应液经滤袋回收固定化CTP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸胞苷干品(CTP)175g。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。