阅读说明：本技术 一种基于酶法的高纯度nmn制备工艺 (High-purity NMN preparation process based on enzyme method ) 是由 马宏峰 赵伟 王梓 陈晨 于 2020-04-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及NMN制备技术领域,且公开了一种基于酶法的高纯度NMN制备工艺,制备工艺步骤如下：①原料预处理：首先以烟酰胺核糖进行微滤和纳滤,收集浓缩的粗品溶液。②生产工艺：粗品溶液在烟酰胺核糖激酶或含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞的催化下反应生成β-烟酰胺单核苷酸。③纯化工艺：将生产的β-烟酰胺单核苷酸溶液pH值调至3-7,进样上反相高效液相色谱制备柱,进行梯度洗脱纯化,得到纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液。该基于酶法的高纯度NMN制备工艺,保证烟酰胺单核苷酸的生产率,提高了产品纯度,可以使烟酰胺单核苷酸在缓解和改善缺血性心脑组织损伤效果更具明显性,烟酰胺单核苷酸可以较好改善氧化相关的退行性疾病和身体机能障碍。(The invention relates to the technical field of NMN preparation, and discloses a high-purity NMN preparation process based on an enzyme method, which comprises the following steps of ① raw material pretreatment, namely microfiltration and nanofiltration are carried out on nicotinamide ribose, a concentrated crude product solution is collected, ② a production process is carried out, wherein the crude product solution reacts under the catalysis of nicotinamide ribokinase or recombinant cells containing nicotinamide ribokinase to generate β -nicotinamide mononucleotide, ③ a purification process is carried out, the pH value of the produced β -nicotinamide mononucleotide solution is adjusted to 3-7, a reversed-phase high-performance liquid chromatography preparation column is fed for sample injection, and gradient elution purification is carried out to obtain a purified β -nicotinamide mononucleotide solution.)

一种基于酶法的高纯度NMN制备工艺

技术领域

本发明涉及NMN制备技术领域，具体为一种基于酶法的高纯度NMN制备工艺。

背景技术

NMN(烟酰胺单核苷酸)是烟酰胺磷酸核糖转移酶反应的产物，是NAD+的关键前体之一。在哺乳动物体内，NMN由烟酰胺在Nampt的催化下生成，随后 NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的催化下生成NAD+。细胞外NMN需要去磷酸转化为烟酰胺核苷才能进入肝细胞内部，进入胞内后，NR在烟酰胺核苷激酶1的作用下磷酸化生成NMN，随后NMN和ATP结合生成NAD+。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。近期研究发现，通过调节生物体内NMN的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。

烟酰胺单核苷酸作为NAD+补救途径中的中间体，具有抗氧化、减少氧化应激的作用，在一些具体疾病的治疗，如脑卒中、心脏缺血再灌注、阿尔茨海默氏病、帕金森病、急性肾损伤、视网膜退行性疾病、2型糖尿病等中也有良好表现。特别是在抗衰老方面，NMN可以减缓生物体的生理衰退，增强能量代谢，延长寿命。鉴于NMN是人体内源性物质，安全性较高，且热稳定性较好，因此NMN作为活性物质在功能食品领域开发中具有广阔前景。

传统的烟酰胺单核苷酸生产方法是以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到，生产率较低，产品纯度低，而且用到大量的有机溶剂，对环境破坏严重，由此烟酰胺单核苷酸在缓解和改善缺血性心脑组织损伤效果不明显，烟酰胺单核苷酸无法较大程度的改善氧化相关的退行性疾病和身体机能障碍，为此我们提出一种基于酶法的高纯度NMN制备工艺。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于酶法的高纯度NMN制备工艺，具备保证烟酰胺单核苷酸的生产率，提高了产品纯度，避免因大量的有机溶剂对环境造成严重破坏，可以使烟酰胺单核苷酸在缓解和改善缺血性心脑组织损伤效果更具明显性，烟酰胺单核苷酸可以较好改善氧化相关的退行性疾病和身体机能障碍等优点，解决了传统的烟酰胺单核苷酸生产方法是以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到，生产率较低，产品纯度低，而且用到大量的有机溶剂，对环境破坏严重，由此烟酰胺单核苷酸在缓解和改善缺血性心脑组织损伤效果不明显，烟酰胺单核苷酸无法较大程度的改善氧化相关的退行性疾病和身体机能障碍的问题。

为实现上述保证烟酰胺单核苷酸的生产率，提高了产品纯度，避免因大量的有机溶剂对环境造成严重破坏，可以使烟酰胺单核苷酸在缓解和改善缺血性心脑组织损伤效果更具明显性，烟酰胺单核苷酸可以较好改善氧化相关的退行性疾病和身体机能障碍目的，本发明提供如下技术方案：一种基于酶法的高纯度NMN制备工艺，制备工艺步骤如下：①原料预处理：首先以烟酰胺核糖进行微滤和纳滤，收集浓缩的粗品溶液。②生产工艺：粗品溶液在烟酰胺核糖激酶或含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞的催化下反应生成β-烟酰胺单核苷酸。③纯化工艺：将生产的β-烟酰胺单核苷酸溶液pH值调至3-7，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A 为盐酸溶液配成的pH3-7的溶液，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液。

优选的，所述的步骤③中将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的β-烟酰胺单核苷酸。

优选的，所述的反应所用的全部原料加入到反应釜中，混合均匀后，置于设定温度下，搅拌反应。

优选的，所述的反应在含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞的催化下进行，所述的重组细胞为微生物细胞。

优选的，所述的微生物为大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。

优选的，所述的反应在温度为32-40℃以及pH为5.5-8.5的水相体系中进行。

优选的，所述步骤③中梯度洗脱时的洗脱时问为40-50min。

与现有技术相比，本发明提供了一种基于酶法的高纯度NMN制备工艺，具备以下有益效果：

该基于酶法的高纯度NMN制备工艺，通过将生产的β-烟酰胺单核苷酸溶液pH值调至3-7，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为盐酸溶液配成的pH3-7的溶液，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液，保证烟酰胺单核苷酸的生产率，提高了产品纯度，避免因大量的有机溶剂对环境造成严重破坏，可以使烟酰胺单核苷酸在缓解和改善缺血性心脑组织损伤效果更具明显性，烟酰胺单核苷酸可以较好改善氧化相关的退行性疾病和身体机能障碍。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种基于酶法的高纯度NMN制备工艺，制备工艺步骤如下：

①原料预处理：首先以烟酰胺核糖进行微滤和纳滤，收集浓缩的粗品溶液。②生产工艺：粗品溶液在烟酰胺核糖激酶或含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞的催化下反应生成β-烟酰胺单核苷酸。③纯化工艺：将生产的β-烟酰胺单核苷酸溶液pH值调至3-7，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为盐酸溶液配成的pH3-7的溶液，流动相B 为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液。的步骤③中将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的β-烟酰胺单核苷酸；的反应所用的全部原料加入到反应釜中，混合均匀后，置于设定温度下，搅拌反应；的反应在含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞的催化下进行，的重组细胞为微生物细胞；的微生物为大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母；的反应在温度为32-40℃以及pH为 5.5-8.5的水相体系中进行；步骤③中梯度洗脱时的洗脱时问为40-50min。

该基于酶法的高纯度NMN制备工艺，制备流程如下：首先以烟酰胺核糖进行微滤和纳滤，收集浓缩的粗品溶液，然后粗品溶液在烟酰胺核糖激酶或含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞的催化下反应生成β-烟酰胺单核苷酸，将生产的β-烟酰胺单核苷酸溶液pH值调至3-7，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为盐酸溶液配成的pH3-7的溶液，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液，再将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的β-烟酰胺单核苷酸，其中反应在温度为32-40℃以及pH为5.5-8.5 的水相体系中进行，步骤③中梯度洗脱时的洗脱时问为40-50min。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。