植物多基因控制性状的单基因分离群体构建方法

文档序号：1467597 发布日期：2020-02-21 浏览：28次 >En<

阅读说明：本技术 植物多基因控制性状的单基因分离群体构建方法 (Single gene segregation population construction method for plant polygene control character ) 是由杨行海张宗琼夏秀忠农保选李丹婷邓国富曾宇吴艳艳许娟高菊梁海福于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物多基因控制性状的单基因分离群体构建方法，本发明所公开的一种水稻多基因控制性状的单基因分离群体构建方法，该方法针对开关基因控制的相关性状，通过对后代基因的定向筛选，能够快速、高效、准确地进行复杂性状中单个基因的效应及精细定位研究，方法还通过申请人采用F<Sub>2</Sub>代与显性亲本不断回交的方法，解决了基因测序样本量过大，表型表达不能快速锁定目标基因基因型的问题，能更快速的找到目的样本减少回交代数，提高筛选的精确性和效率。(The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a method for constructing a single-gene segregation population of plant polygene control traits, and discloses a method for constructing a single-gene segregation population of rice polygene control traits 2 The method for continuous backcross of generations and dominant parents solves the problems that the gene sequencing sample amount is too large, and the phenotype expression cannot quickly lock the target gene genotype, can more quickly find a target sample to reduce the number of backcross generations, and improves the accuracy and efficiency of screening.)

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物多基因控制性状的单基因分离群体构建方法。

【背景技术】

在全球气候变暖、耕地减少的情形下，增加粮食产量面临巨大挑战。植物的复杂性状在其适应环境和人工选择有着重要意义。复杂性状由多个基因共同控制，单个基因可能具有相对小的表型效应，且容易受到环境的影响。因此，解析复杂性状的控制基因一直是比较困难的。

构建适宜的作图群体是实现基因精准定位的关键。为了解析水稻复杂性状中每个基因的遗传效应，研究人员采用回交和自交获得只有一个或极少数个供体亲本等位基因差异的导入片段群体，包括近等基因系(near isogenic lines，NILs)、单片段代换系(singlesegment substitution lines，SSSLs)、染色体片段代换系(chromosome segmentsubstitution lines，CSSLs)等。这些群体可消除遗传背景的干扰，基因定位精确、灵敏。但对于存在开关基因的性状来说，只有开关基因存在时其它基因间的相互作用才能在表型中显现，而且现有技术中研究发现，存在开关基因的性状除了受到开关基因的影响外，不同基因之间也存在紧密连锁效应对相关性状产生相互关联的影响，表型表现并不突出；因此，存在开关基因性状的基因控制要比其他基因控制机理复杂得多，受到基因间的连锁调控影响也更大；如果根据现有技术的根据后代表型来确定目标单株，从而确定基因型的话，是不准确的，为此为了进一步加强对基因的定位研究，针对开关基因的控制特点，对性状中的某一基因进行定位，构建单基因分离群体将对后续的基因研究提供更准确、精确的遗传材料，能促进基因定位体系的发展。

【

发明内容

】

鉴于上述内容，有必要针对存在开关基因的性状进行，并提供一套精准的定位体系，用于针对存在开关基因的性状进行精确定位。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

植物多基因控制性状的单基因分离群体构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)选差异性状明显的亲本杂交得到F1代，F1代自交得到F2代，构建F2代群体；

(2)对亲本进行测序并和参考基因组序列比对；比对结果正常后，根据InDel位点设计引物；

(3)基因定位：对步骤(1)的F2群体进行基因定位，关联出控制某一性状的的多个相关基因，所述性状存在开关基因；选取某一非开关基因，作为目标基因进行后续分析；

(4)InDel标记筛选：根据步骤(3)的多个相关基因或基因候选区域设计两对多态性InDel标记；

(5)单基因分离群体构建：利用步骤(4)筛选好的多态性InDel标记去分析F2群体或F2群体与显性亲本回交的后代群体中每个单株的基因型，筛选出目标基因为杂合片段，其他非目标基因为显性纯合片段的植株；并将该植株发展成为群体，即构建得到单基因分离群体。

进一步的，所述植物为水稻。

进一步的，步骤(1)所述亲本为东兰墨米和黄华占。

进一步的，步骤(3)所述性状为种皮花青素。

进一步的，步骤(3)的相关基因分别为：开关基因Kala4，相关基因Rd，BP2，BP3，BP3.1，BP3.2，OsCHI，BP6，BP9和BP12；目标基因为BP3.1。

进一步的，步骤(5)所述分析F₂群体或F₂群体回交后代的基因型方法为：用InDel标记去分析F₂群体中每个单株的基因型，找出目标基因杂合，其它基因显性纯合的子代植株，如果在F₂群体中没有找到相关植株，就将F₂代与显性纯合的亲本进行回交，回交1代记为F₃代，回交2代记为F₄代，然后收获(F₂、F₃、F₄)代种子种植，继续采用分子标记法鉴定基因型，直至筛选到目标基因杂合，其它连锁基因显性纯合的植株。

进一步的，所述目标基因的精细定位方法还包括：利用构建得到的单基因分离群体通过代换作图法定位目标基因。

进一步的，所述步骤(4)InDel标记筛选的引物序列如SEQ ID NO.1～40所示。

本发明具有如下有益效果：

本发明所公开的一种水稻多基因控制性状的单基因分离群体构建方法，该方法是针对开关基因控制性状的单基因定位研究，该方法能有效除去其他杂音，能够快速、高效、准确地进行复杂性状中单个基因的效应及精细定位研究；主要是针对开关基因控制的性状，定向的筛选目标基因为杂合片段，其他非目标基因为显性纯合片段的植株构建单基因分离群体，为后续的基因型研究提供一个更精准的遗传材料；因为开关基因控制的性状存在表型会有可能与基因型不统一的现象，如果仅仅通过表型去筛选判断后代基因型，很难做到精细定位，如果在研究过程中由于表型不突出，大量样本的存在将会增加研究人员的工作量，因此，在构建研究样本时，申请人采用F₂代与显性亲本不断回交的方法，能更快速的找到目的样本减少回交代数，解决了基因测序样本量过大，表型表达不能快速锁定目标基因基因型的问题，提高筛选的精确性和效率。

【附图说明】

图1是本发明实施例的10个基因紧密连锁的分子标记电泳图；图中，1是纯合隐性亲本黄华占；2是纯合显性亲本东兰墨米；3-31为不同子代；a-j分别对应Rd,BP2,BP3.2,BP3.1,BP3,oSCHI,Kala4,BP6,BP9,BP12。

图2是本发明实施例的候选基因LOC_Os03g32470在黄华占与东兰墨米中表达量图。

【

具体实施方式

】

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1：

本实施例提供了一种水稻多基因控制性状的单基因分离群体构建方法，包括以下步骤：

(1)亲本选择及F₂群体构建：东兰墨米种皮黑色、花青素含量高(主要为矢车菊素，占总花青素含量的98.4％，为黑皮的显性纯合基因亲本)；黄华占种皮白色、几乎不含花青素(为黑皮的隐性纯合亲本)，利用黄华占与东兰墨米杂交得到F₁代，用F₁代自交，构建F₂群体。

(2)InDel标记开发：利用Illumina HiSeq2500测序技术对黄华占和东兰墨米进行全基因组重测序，分别获得了14.3Gb和14.6Gb的有效数据,与水稻日本晴参考基因组序列比对率分别为95.31％和97.71％，比对结果正常，可以用于InDel标记开发。利用生物信息学软件BWA、SAMtools、Primer3等，从两个亲本的基因组序列中鉴定出369,745个差异InDel位点(＜50bp)，成功地开发出348,725对InDel引物。

(3)基因定位：水稻东兰墨米种皮花青素生物合成相关基因鉴定方法参考发明专利“一种水稻复杂性状基因定位的方法”(ZL201910057825.X)。利用该技术关联出10个水稻花青素生物合成相关基因，分别为开关基因Kala4，Rd，BP2，BP3，BP3.1，BP3.2，OsCHI，BP6，BP9和BP12，除Rd，OsCHI和Kala4三个已知克隆基因外，余下7个基因的候选区间为0.09Mb-9.05Mb。在本研究中，我们选取BP3.1做为目标基因进行后续分析。

(4)InDel标记筛选：在每个基因或基因候选区域两侧侧翼都设计两对多态性InDel标记。

(5)单基因分离群体构建：利用步骤(4)筛选好的多态性InDel标记去分析F₂群体中每个单株的基因型，找出Rd，BP2，BP3，BP3.2，OsCHI，Kala4，BP6，BP9和BP12所在的染色体片段为杂合或显性纯合(与东兰墨米基因型相同)，且BP3.1为杂合片段的植株；如果，在上述步骤中没有筛选到合适基因型的F₂代，就通过将F₂代与东兰墨米(显性纯合)进行回交，回交1代记为F₃代，回交2代记为F₄代，依次类推，然后收获(F₂、F₃、F₄、F₅……)代种子种植，继续采用相同的方法鉴定基因型，直至筛选到Rd，BP2，BP3，BP3.2，OsCHI，Kala4，BP6，BP9和BP12为显性纯合片段(与东兰墨米基因型相同)，而BP3.1为杂合片段的植株。利用BP3.1为杂合(其余9个基因显性纯合)植株发展而成群体即为单基因分离群体。

步骤(4)中，InDel标记的引物序列如下表1所示：

表1 InDel标记筛选的引物序列(SEQ ID NO.1～40)

实施例2：

本实施例是对实施例1单基因分离群体进行验证的实施例，具体步骤如下：

(1)遗传效应分析：检测实施例1步骤(5)的单基因分离群体后代572个植株籽粒种皮颜色和花青素含量，其中433株种皮为黑色，139株种皮为不完全黑色，符合3:1的分离比例(χ2＝0.15＜χ20.05＝3.84)。基因型为BP3.1/BP3.1或BP3.1/bp3.1的植株籽料种皮为黑色，花青素含量分别为1739.5μg/g和1682.6μg/g；基因型为bp3.1/bp3.1的植株籽粒种皮颜色表现不完全黑色，花青素含量为90.1μg/g，二者花青素含量相差18.3倍。

(2)BP3.1精细定位：利用分子标记筛选出10个单株(BP3.1位点杂合，另外9个位点纯合且与东兰墨米的基因型相同)发展成5,328株F₄单基因分离群体。最终，通过代换作图法把基因BP3.1定位在57.4kb的区间内。

(3)候选基因分析：利用水稻基因组注释数据库MSU-RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)对候选基因组区段进行基因注释分析，该区间内有8个预测基因，其中LOC_Os03g32470编码花青素合成酶(leucoanthocyanidin dioxygenase，ANS/LDOX)。前人的究表明，ANS/LDOX在植物花青素生物合成中起着重要作用。该酶催化无色花色素转变为有色花青素。开花后13d时，利用qRT-PCR技术检测候选基因LOC_Os03g32470在东兰墨米和黄华占中的表达水平，达到极显著差异(194.8倍)。因此，LOC_Os03g32470可能是BP3.1的真正候选基因。

图1是本申请的10个基因紧密连锁的分子标记电泳图；图中，1是纯合隐性亲本黄华占；2是纯合显性亲本东兰墨米；3-31为不同子代；a-j分别对应Rd,BP2,BP3.2,BP3.1,BP3,oSCHI,Kala4,BP6,BP9,BP12，通过该图我们可以看到利用分子标记我们可以快速筛选到携带目标基因的单株9；9号子代显示，其基因BP3.1(对应d)为杂合其余的a-c(对应Rd,BP2,BP3.2)和e-j(对应BP3,oSCHI,Kala4,BP6,BP9,BP12)均与亲本东兰墨米(2)的基因型相同，是显性纯合。

图2是本申请实施例LOC_Os03g32470的表达量图，通过该图我们可以看到该基因在东兰墨米中的表达水平远远高于黄华占。

综上所述，使用本申请的方法，能针对开关基因控制的性状进行单基因分离群体的构建，是一种简单、高效、准确的构建单基因分离群体的方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所

<120> 植物多基因控制性状的单基因分离群体构建方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA