阅读说明：本技术 用于肿瘤检测的高分子生物传感器及制备方法及应用 (Polymer biosensor for tumor detection and preparation method and application thereof ) 是由 马军岩 徐耀瑜 司伟杰 张振兴 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：用于肿瘤检测的高分子生物传感器,所述的高分子生物传感器为聚(9-甲基-9-烷基-1,4-芴烯乙烯)。用于肿瘤检测的高分子生物传感器制备方法,所述的制备方法包括单体制备和单体聚合反应。用于肿瘤检测的高分子生物传感器的应用,所述的高分子生物传感器采用上述的聚合物,所述的高分子生物传感器用于检测肿瘤细胞过氧化物。本材料同时降低生产成本,降低了环境污染；对样本的前期处理要求简单,易操作；检测反应迅速。(The polymer biosensor for detecting tumors is poly (9-methyl-9-alkyl-1, 4-fluorenylethylene). The preparation method of the macromolecular biosensor for tumor detection comprises monomer preparation and monomer polymerization reaction. The polymer biosensor adopts the polymer, and is used for detecting tumor cell peroxides. The material reduces the production cost and the environmental pollution; the pretreatment requirement on the sample is simple and the operation is easy; the detection reaction is rapid.)

用于肿瘤检测的高分子生物传感器及制备方法及应用

技术领域

本发明涉及高分子聚合物生物传感器，属于化学技术领域。

背景技术

聚苯乙烯（PPV）及其衍生物是近二十年来常用的聚合物发光材料。与传统的无机发光二极管相比，聚合物发光材料显示出一些突出优势。然而，很少有人关注它在生物分子系统检测中的应用，肿瘤是人类目前的一大健康威胁而如何高效低成本的检测早期肿瘤是当今的一大热门课题，通过对细胞的过氧化物检测是发现早期肿瘤的一条有效途径。用于检测肿瘤细胞过氧化物的生物传感器高分子材料主要报道如下：

1.Teixeira等人报道了以偶氮类高分子Azo-polymer修饰电极，以电化学的方法来检测癌细胞外的过氧化物含量ACS Sens. 2019, 4, 1, 118-125；

2. Jang等人报道了以聚丙烯晴（BPAN）高分子的荧光检测法来检测癌细胞外的过氧化物含量ACS Nano 2012, 6, 10, 8516-8524；

上述两种检测方式存在步骤繁琐、成本高等缺点，聚苯乙烯（PPV）及其衍生物高分子材料用于检测肿瘤细胞体外的过氧化物含量未见文献报道，若能开发这类材料，必将降低肿瘤的检测成本。

发明内容

本发明的目的在于克服目前的肿瘤细胞过氧化物检测中存在的上述问题，提供一种用于肿瘤检测的高分子生物传感器及制备方法及应用。

为实现本发明的目的，采用了下述的技术方案：用于肿瘤检测的高分子生物传感器，所述的高分子生物传感器采用单体聚合得到，聚合物具有式Ⅴ所示的结构：

其中R为烷基，烷基为丁基或己基或辛基或十一烷基或十三烷基，n的大小为10-20。

用于肿瘤检测的高分子生物传感器制备方法，所述的制备方法包括单体制备和单体聚合反应，单体的路线如下：

单体聚合反应如下：

上述各式中，其中R为烷基，烷基为丁基或己基或辛基或十一烷基或十三烷基，n的大小为10-20；具体步骤包括以下：

A：单体制备：

A1: 采用式Ⅰ制备式Ⅱ

将正丁基锂溶液注入置于冰浴中的式Ⅰ所示的碘代1,4-二甲基苯并的无水四氢呋喃溶液中，搅拌1小时后加入酮，所述的酮为2-己酮或2-辛酮或2-癸酮或 2-十三烷酮或 2-十五烷酮，将反应升温至室温，并在氮气下搅拌12小时以上，然后用水将反应物淬灭，并继续搅拌30分钟，采用二氯甲烷萃取反应混合物，并用去离子水洗涤三次，收集有机层，减压去除溶剂，然后将产物真空干燥1h，得到淡黄色油状液体，用正己烷洗脱硅胶柱层析进一步纯化，得到式Ⅱ所示的产物；

A2：采用式Ⅱ制备式Ⅲ

将步骤A1得到的产物式Ⅱ置入烧瓶中，加入二氯甲烷作为溶剂，并在氮气下搅拌30分钟，

将三氟化硼***添加到烧瓶中，反应在氮气下60℃搅拌12小时，然后，用甲醇淬火并在氮气下搅拌20分钟，在减压下除去溶剂，向反应混合物中加入冷甲醇，放入冰箱中1小时，收集沉降在烧瓶底部的油状液体，最终得到式Ⅲ所示的产物；

A3：采用式Ⅲ制备式Ⅳ

将步骤A2得到的产物式Ⅲ置入烧瓶中，加入四氯化碳、N-溴代琥珀酰亚胺和过氧化苯甲酰，在70℃下加热并在氮气下搅拌反应4小时，将反应混合物冷却至室温并过滤，向滤液中加入含水Na2SO3，然后，将滤液搅拌；用100ml去离子水洗涤反应混合物三次，通过减压除溶剂去，用正己烷洗脱硅胶柱层析进一步纯化化合物得到式Ⅳ所示的产物单体；

B：聚合反应：

将步骤A3的得到的式Ⅳ所示的单体以四氢呋喃作为溶剂在室温下进行聚合反应，反应时间12小时，得到式Ⅴ所示的聚合物。

用于肿瘤检测的高分子生物传感器的应用，所述的高分子生物传感器采用上述的聚合物，所述的高分子生物传感器用于检测肿瘤细胞过氧化物。

进一步的：所述的高分子生物传感器用于检测肿瘤细胞过氧化物的步骤如下：

步骤1：在超净实验台上，将聚合物约3mg均匀涂布到透明石英载玻片表面，在氮气保护下放置于80℃烘箱中24小时；待聚合物固化后，涂层以薄膜的形式均匀分散于载玻片，放置于0.1M PBS PH=7.4的缓冲液中室温密闭保存24h；使用前，将待使用的高分子涂层载玻片用去离子水清洗3次，置于37℃烘箱中静置6h；

步骤2：细胞样品的制备：

在超净实验台上，实验室培养各种肿瘤细胞样本，取各种肿瘤细胞100μL，加入1.5mL离心管中, 加入1mL 0.1M PBS PH=7.4缓冲液，于37℃条件下震荡预孵3分钟；在4℃下静置30min，细胞破碎后离心，用高速冷冻离心机在4℃，20 ,000× g的条件下，高速离心30分钟后，取上清液为测试样品；将每种上清液与活性炭0.1g充分震荡10min后，通过0.2μL的过滤网，取滤液，进行电泳检测，电泳检测具体为：将玻璃板凝胶放入电泳槽中，并在糟中加入1X电泳缓冲液，取所制备样品上清20ul，蛋白Maker 5 ul分别上样，设定电泳程序：S1-80V-35min；S2-160V-1h，证明滤液中不含有蛋白及核酸杂质后作为测定样品；

步骤3：检测：

在氮气保护的氛围下，将步骤1得到的涂有高分子涂层石英载玻片放到表面皿中，将步骤2制备好的肿瘤细胞提取液加入表面皿中，将表面皿静置一定时间，拿出载玻片，用去离子水50mL水充分清洗表面2次；常温下烘干后，对载玻片进行荧光检测。

本发明方法与现有技术相比，具有以下有益效果：

1.无需金属催化剂和氧化剂，降低了产物中金属离子的含量。同时降低生产成本，降低了环境污染；

2. 在检测中使用体外细胞测试，对样本的前期处理要求简单，易操作；

3. 使用荧光检测方法，对过氧化物检测的灵敏度高，检测反应迅速；

4. 此类高分子材料具有良好的亲脂性结构，对细胞膜表面的附着力强，易于与细胞本体释放的过氧化物进行接触反应；

5. 烷基链长度大幅度的改变，其荧光光谱的吸收峰几乎不变（见图1），证明其本身有着极好的光学稳定性，对于在极其特殊条件下发生的长链断裂现象有着优秀的光谱自我修正作用；

6. 此类高分子材料是一种高度柔性材料，易于组装为各种类型的体外诊断器件；

7. 对过氧化物的特质性选择度高，避免了其他杂质的影响。

附图说明

图1：本发明高分子材料烷基不同的情况下吸收光谱曲线的重合情况。

图2：本发明高分子材料烷基不同的情况下荧光光谱特征曲线的重合情况。

图3：用于测定细胞过氧化物含量的定量标准曲线。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的实施实例，这些实施实例仅仅是对本发明的阐述，不限制本发明的范围。

实施例一：R为丁基时高分子材料的制备：

制备路线如下：

步骤A：单体的制备：

A1：2-（2'，5'-二甲基-[1,1'-联苯]-2-基）己烷-2-醇（上式中的b）的制备：

将正丁基锂溶液（7.1mL，17.8.mmol）缓慢注入置于冰浴中的碘代1,4-二甲基苯并（5g，16 mmol）的无水四氢呋喃溶液中，搅拌1小时后加入2-己酮（14.8 mmol）。将反应缓慢升温至室温，并在氮气下搅拌过夜。然后用40毫升水将反应物淬灭，并继续搅拌30分钟。用80ml二氯甲烷萃取反应混合物，并用100ml洗涤三次。收集有机层，减压去除溶剂。然后，将产物真空干燥1h，得到淡黄色油状液体。用正己烷洗脱硅胶柱层析进一步纯化。最终得到2.297g产物，产率为55.4%。

2-(2',5'-dimethyl-[1,1'-biphenyl]-2-yl)hexan-2-ol

1H NMR (301 MHz, Chloroform-d) δ 7.62 – 7.40 (m, 1H), 7.38 – 7.20 (m,2H), 7.19 – 7.06 (m, 2H), 7.04 – 6.88 (m, 2H), 2.32 (d, J = 9.1 Hz, 3H), 2.15– 1.93 (m, 3H), 1.85 (s, 1H), 1.78 – 1.54 (m, 2H), 1.52 – 0.96 (m, 7H), 0.88(dtd, J = 10.5, 7.2, 6.6, 2.9 Hz, 3H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ= 14.13,14.17, 20.28, 20.30, 21.01, 22.79, 23.11, 23.15, 26.42, 26.61, 29.82, 31.19,31.72, 76.42, 76.73, 126.11, 126.16, 126.92, 127.01, 127.12, 128.32, 128.38,130.06, 130.12, 130.13, 130.33, 131.64, 131.75, 133.74, 133.62, 134.51,134.53, 138.83, 139.05, 142.59, 142.76, 144.82, 145.09. HRMS–ESI (m/z): [M+H]+ calcd for C20H26O, 282.1984; found: 282.1976。

A2：9-丁基-1,4,9-三甲基-9H-芴（上式中的c）的制备：

在含有2-（2'，5'-二甲基-[1,1'-联苯]-2-基）癸-2-醇 (2.704 g, 7.988 mmol)的烧瓶加入100毫升二氯甲烷作为溶剂，并在氮气下搅拌30分钟。将2毫升三氟化硼***分别缓慢添加到这五个烧瓶中，反应在氮气下60℃搅拌过夜。然后，用15ml甲醇淬火并在氮气下搅拌20分钟。在减压下除去溶剂。向反应混合物中加入150毫升冷甲醇，放入冰箱中1小时，收集沉降在烧瓶底部的油状液体。最终得到1.385 g产物，产率为54.1%。3b，3d，3e的合成方法与上述一致。

-butyl-1,4,9-trimethyl-9H-fluorene

1H NMR (301 MHz, Chloroform-d) δ 7.90 – 7.84 (m, 1H), 7.41 (dd, J = 6.7,2.1 Hz, 1H), 7.36 – 7.31 (m, 2H), 7.08 – 6.94 (m, 2H), 2.69 (s, 3H), 2.51 (s,3H), 2.38 (ddd, J = 13.5, 12.1, 4.8 Hz, 1H), 2.01 (ddd, J = 13.6, 12.0, 4.6Hz, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.10 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 0.69 (t, J = 7.4 Hz, 3H),0.62 – 0.36 (m, 2H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ= 13.89, 19.01, 21.29, 23.09,25.50, 26.45, 38.07, 51.67, 122.01, 123.05, 126.49, 126.72, 129.50, 129.57,130.60, 131.43, 138.76, 141.25, 148.71, 153.38. HRMS–ESI (m/z): [M+H]+ calcdfor C20H24, 264.1878; found: 264.1869

A3：1,4-双（溴甲基）-9-丁基-9-甲基-9H-芴（上式中的d）的制备

在含有0.385g 9-丁基-1,4,9-三甲基-9H-芴的圆底烧瓶中加入20毫升四氯化碳、0.647g N-溴代琥珀酰亚胺和过氧化苯甲酰。将反应在70℃下加热并在氮气下搅拌4 h。将反应混合物冷却至室温并通过过滤去除丁二酰亚胺。向滤液中加入50ml含水Na2SO3。然后，将滤液搅拌以除去过量的溴。用100ml去离子水洗涤反应混合物三次，所有溶剂均通过减压除去。用正己烷洗脱硅胶柱层析进一步纯化化合物。

1,4-bis(bromomethyl)-9-butyl-9-methyl-9H-fluorene

¹H NMR (301 MHz, Chloroform-d) δ 8.35 – 7.93 (m, 1H), 7.86 (dd, J = 16.1,8.1 Hz, 1H), 7.51 – 7.33 (m, 4H), 4.95 – 4.70 (m, 2H), 2.38 – 2.05 (m, 2H),1.61 (d, J = 10.5 Hz, 3H), 1.17 – 1.04 (m, 2H), 0.91 – 0.85 (m, 2H), 0.66(td, J = 7.3, 2.9 Hz, 3H), 0.60 – 0.30 (m, 2H). ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz): δ=14.12, 20.18, 20.93, 22.66, 23.87, 24.17, 24.37, 29.15, 29.36, 29.50, 29.55,25.93, 30.02, 31.09, 31.83, 31.88, 43.81, 43.84, 45.25, 76.33, 76.62, 126.01,126.04, 126.80, 126.90, 127.00, 128.20, 128.25, 129.93, 130.01, 130.02,130.19, 131.53, 131.54, 133.35, 133.52, 134.38, 134.40, 138.81, 138.94,142.51, 142.57, 144.74, 145.00. HRMS–ESI (m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₀H₂₂,262.1722; found: 262.1719

步骤B：聚（9-甲基-9-丁基-1,4-芴烯乙烯）的制备（即R为丁基时的本发明的高分子材料，如e所示）

在干燥手套箱内，在含有0.145g的1,4-双（溴甲基）-9-丁基-9-甲基-9H-芴的加压瓶内加入30毫升无水THF，0.249g叔丁醇钾，反应在氮气下搅拌室温反应12小时，反应压力2-5个大气压，反应完成后用40毫升二氯甲烷提取溶液，用100毫升水洗涤三次。收集有机层并在减压下除去所有溶剂。将固体溶解于2毫升二氯甲烷中并加入15毫升甲醇中。用离心机沉淀、收集亮黄色固体。减压干燥2小时得到0.022g 亮黄色的固体，产率24.7%。

poly (9-methyl-9- butyl-1,4-fluorenylene vinylene)

P1a: 1H NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ= 0.12-2.67 (m, 12H), 7.10-8.22 (m, 8H)。

实施例二：R为辛基时高分子材料的制备：

制备路线如下：

步骤A：单体的制备：

A1：2-（2'，5'-二甲基-[1,1'-联苯]-2-基）癸-2-醇（上形式中的f）制备：

将正丁基锂溶液（7.1mL，17.8.mmol）缓慢注入置于冰浴中的碘代1,4-二甲基苯并（5g，16 mmol）的无水四氢呋喃溶液中，搅拌1小时后加入2-2-癸酮（14.8 mmol）。将反应缓慢升温至室温，并在氮气下搅拌过夜。然后用40毫升水将反应物淬灭，并继续搅拌30分钟。用80ml二氯甲烷萃取反应混合物，并用100ml洗涤三次。收集有机层，减压去除溶剂。然后，将产物真空干燥1h，得到淡黄色油状液体。用正己烷洗脱硅胶柱层析进一步纯化。最终得到2.583 g产物，产率为56.6%。

2-(2',5'-dimethyl-[1,1'-biphenyl]-2-yl)decan-2-ol

¹H NMR (301 MHz, Benzene-d ₆) δ 7.50 – 7.28 (m, 1H), 7.22 (dddd, J = 8.0,7.2, 3.4, 1.6 Hz, 1H), 7.18 – 7.08 (m, 1H), 7.08 – 6.94 (m, 2H), 6.92 – 6.78(m, 2H), 2.38 – 2.08 (m, 3H), 2.06 – 1.81 (m, 3H), 1.72 (s, 1H), 1.63 – 1.43(m, 2H), 1.42 – 0.91 (m, 15H), 0.82 – 0.73 (m, 3H).¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz): δ=14.12, 20.18, 20.93, 22.66, 23.87, 24.17, 24.31, 29.15, 29.29, 29.36, 29.50,29.55, 29.93, 30.02, 31.09, 31.83, 31.88, 43.81, 43.84, 45.25, 76.33, 76.62,126.01, 126.04, 126.80, 126.90, 127.00, 128.20, 128.25, 129.93, 130.01,130.02, 130.19, 131.53, 131.64, 133.36, 133.52, 134.38, 134.40, 138.81,138.91, 142.51, 142.67, 144.74, 145.00. HRMS–ESI (m/z): [M+H]⁺ calcd forC₂₄H₃₄O, 338.2610 found: 338.2615

A2：1,4,9-三甲基-9-辛基-9H-芴（上式中的g）的制备

含有2-（2'，5'-二甲基-[1,1'-联苯]-2-基）己烷-2-醇 (1.374 g, 4.866 mmol)的烧瓶加入100毫升二氯甲烷作为溶剂，并在氮气下搅拌30分钟。将2毫升三氟化硼***分别缓慢添加到这五个烧瓶中，反应在氮气下60℃搅拌过夜。然后，用15ml甲醇淬火并在氮气下搅拌20分钟。在减压下除去溶剂。向反应混合物中加入150毫升冷甲醇，放入冰箱中1小时，收集沉降在烧瓶底部的油状液体。最终得到0.559 g产物，产率为43.5%。

1,4,9-trimethyl-9-octyl-9H-fluorene

¹H NMR (301 MHz, Chloroform-d) δ 7.93 – 7.82 (m, 1H), 7.46 – 7.37 (m,1H), 7.37 – 7.29 (m, 2H), 7.08 – 6.93 (m, 2H), 2.70 (s, 3H), 2.51 (s, 3H),2.43 – 2.32 (m, 1H), 2.02 (ddd, J = 13.5, 12.0, 4.6 Hz, 1H), 1.55 (s, 3H),1.25 – 1.03 (m, 10H), 0.84 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 0.52 (ddd, J = 25.4, 12.0,4.7 Hz, 2H).¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz): δ= 14.21, 19.05, 21.30, 22.72, 24.29,25.51, 29.29, 29.37, 30.09, 31.91, 38.30, 51.71, 122.01, 123.05, 126.49,126.73, 129.50, 129.58, 130.60, 131.43, 138.77, 141.26, 148.72, 153.39. HRMS–ESI (m/z): [M+H]⁺ calcd for C₂₄H₃₂, 320.2504; found: 320.2495

A3：1,4-双（溴甲基）-9-甲基-9-辛基-9H-芴（上式中的h）的制备：

在含有0.520g 1,4,9-三甲基-9-辛基-9H-芴的圆底烧瓶中加入20毫升四氯化碳、0.647g N-溴代琥珀酰亚胺和适量的过氧化苯甲酰。将反应在70℃下加热并在氮气下搅拌4h。将反应混合物冷却至室温并通过过滤去除丁二酰亚胺。向滤液中加入50ml含水Na2SO3。然后，将滤液搅拌以除去过量的溴。用100ml洗涤反应混合物三次，所有溶剂均通过减压除去。用正己烷洗脱硅胶柱层析进一步纯化化合物。

1,4-bis(bromomethyl)-9-methyl-9-octyl-9H-fluorene

¹H NMR (301 MHz, Chloroform-d) δ 8.34 – 7.79 (m, 2H), 7.64 – 7.29 (m,4H), 4.98 – 4.66 (m, 2H), 2.38 – 2.02 (m, 2H), 1.67 – 1.57 (m, 3H), 1.57 –0.86 (m, 12H), 0.80 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 0.62 – 0.31 (m, 2H).¹³C NMR (CDCl₃,75 MHz): δ= 14.17, 22.66, 24.20, 26.75, 29.18, 29.25, 29.75, 31.81, 32.46,37.03, 40.01, 40.49, 122.25, 124.22, 127.73, 128.17, 129.43, 131.18, 133.34,137.94, 138.54, 139.42, 145.21, 152.83. HRMS–ESI (m/z): [M+H]⁺ calcd forC₂₄H₃₀, 318.2348; found: 318.2341

B：聚（9-甲基-9-辛基-1,4-芴烯乙烯）（上式中的m）的制备

在干燥手套箱内，在含有0.142g的1,4-双（溴甲基）-9-辛基-9-甲基-9H-芴的加压瓶内加入30毫升无水THF，0.249g叔丁醇钾。反应在氮气下搅拌室温12小时，反应压力为2-5个大气压，用40毫升二氯甲烷提取溶液，用100毫升水洗涤三次。收集有机层并在减压下除去所有溶剂。将固体溶解于2毫升二氯甲烷中并加入15毫升甲醇中。用离心机沉淀、收集亮黄色固体。减压干燥2小时得到0.032g 亮黄色的固体，产率34.5%。Poly (9-methyl-9- octyl-1,4-fluorenylene vinylene)

1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ= 0.09-2.69 (m, 20H), 7.18-8.47 (m, 8H)。

应用实施例：

步骤1：高分子材料的前处理：

1. 在超净实验台上，将上述高分子P1a-e每种约3mg均匀涂布到透明石英载玻片表面（2cm*10cm），在氮气保护下放置于80℃烘箱中24小时；

2. 等高分子固化后，图层以薄膜的形式均匀分散于玻璃片，并放置于0.1M PBS PH=7.4的缓冲液中室温密闭保存24h；

3. 将待使用的高分子图层载玻片用去离子水清洗3次，置于37℃烘箱中静置6h。

步骤2：肿瘤细胞样品的制备：

1. 在超净实验台上，实验室培养食道癌肿瘤细胞样本，取食道癌肿瘤细胞100μL，加入1.5mL离心管中, 加入1mL 0.1M PBS PH=7.4缓冲液，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

2. 对照组为正常的人体肝细胞株（HL7702），同样取100μL，加入到1.5mL的离心管中，加入1mL 0.1M PBS PH=7.4缓冲液，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

3. 在4℃下静置30min，细胞破碎后离心，用高速冷冻离心机在4℃，20 ,000× g的条件下，高速离心30分钟后，取上清液为测试样品；

4.将每种上清液与活性炭0.1g充分震荡10min后，通过0.2μL的过滤网，取滤液，进行SDS-PAGE电泳检测；

5. 将玻璃板凝胶放入电泳槽中，并在糟中加入1X电泳缓冲液。取所制备样品上清20ul，蛋白Maker 5 ul分别上样。设定电泳程序：S1-80V-35min；S2-160V-1h。证明滤液中不含有蛋白及核酸杂质后作为测定样品。

步骤3：测试

1. 在氮气保护的氛围下，将涂有高分子石英载玻片放到表面皿中，将制备好的肿瘤细胞提取液按照不同的比例（1:10,1:100,1:1000，1:10000）稀释，加入表面皿中静置；

2. 将不同的表面皿静置10min，30min，1h，2h，4h，10h，20h，拿出载玻片，用去离子水50mL水充分清洗表面2次；

3. 常温下烘干后，对所有的载玻片进行荧光检测（Ex = 430 nm，Em = 503 nm），测试各载玻片的荧光强度及产率，每组的平均值与正常肝细胞的对照组比较，通过产物的荧光强度与过氧化物（细胞底物浓度）含量做标准曲线，统计并记录数据。最终得出，此种方法对过氧化物含量的灵敏度约为2μm。

优选的，所述肿瘤细胞为乳腺癌症(MCF-7)，食道癌(EC109)，非小细胞肺癌(A549)，子***(Hela)。

在详细说明本发明的实施方式之后，熟悉该项技术的人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围，且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。