阅读说明：本技术 一种睡莲无菌材料的制备方法 (Preparation method of water lily sterile material ) 是由 朱木兰 吉琴 杨宽 郑珂媛 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种睡莲无菌材料的制备方法,以睡莲种子为起始材料,经预处理、消毒、预培养和萌发培养等步骤,种子萌发比自然萌发时间周期至少可缩短一半,能很快获得大量睡莲无菌材料,由此获得睡莲材料无菌率非常高。可以以此进行后续再生体系研究及作为转基因的受体材料进一步制备转基因植株,使之既能保持亲本的遗传表型,又具有所转入的外源目的基因的性状。(The invention discloses a preparation method of a water lily aseptic material, which takes water lily seeds as a starting material, and the water lily aseptic material can be quickly obtained by the steps of pretreatment, disinfection, pre-culture, germination culture and the like, wherein the time period of the seed germination can be at least shortened by half compared with the time period of natural germination, and thus, the aseptic rate of the obtained water lily material is very high. The transgenic plant can be further prepared by using the transgenic plant as a transgenic receptor material and subsequent regeneration system research, so that the transgenic plant can not only keep the genetic phenotype of a parent, but also have the character of the transferred exogenous target gene.)

一种睡莲无菌材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种植物再生和快速技术领域，具体睡莲无菌材料的制备方法。

背景技术

睡莲是睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)植物，主要分布在温带及热带。睡莲花色丰富、香气怡人、茎叶对水中富营养物和有害物质具有强吸附能力，被广泛应用于园林水景中。自2000年以来，国家制定并出台了一系列恢复、保护湿地的政策，城市中亲近自然、回归自然的水景设计也得到人们的喜爱和推崇，睡莲是热门水生植物之一，市场需求广阔。

睡莲的繁殖方式有分株和播种两种(黄国振,邓惠勤,邹秀文,李钢.睡莲属植物的繁殖形式[J].中国花卉园艺,2003(04):26-27)。睡莲栽培品种一般杂合程度较高，不宜用种子繁殖；分株法繁殖系数低，对温度要求严格，受季节限制大。睡莲新品种培育主要集中在耐寒型、热带型、跨亚属杂交等研究，我国睡莲育种起步于20世纪90年代，杂交育种和选择育种是我国育种者培育睡莲新品种的主要方法(李钢，.睡莲、荷花新品种的研发与产业发展[J].花木盆景(花卉园艺),2008(09)：49-50)。目前，睡莲育种中绝大多数还是通过人工杂交和自然杂交的手段，结果的随机性较强(唐毓玮,毛立彦,於艳萍,陆祖正,丁丽琼,荣涛,龙凌云,谢振兴.我国睡莲属植物育种研究进展.农业研究与应用，2019，32(01)：36-41；李淑娟,尉倩,陈尘,张燕,吴永朋,余刚.中国睡莲属植物育种研究进展.植物遗传资源学报，2019,20(04)：829-835)。余翠薇等(热带睡莲胆碱氧化酶基因CodA的转化及其耐寒生理研究..浙江大学(硕士论文)，2017)利用花粉管通道法将转基因技术应用到睡莲育种中，但这仅仅只是一个开始，今后还应加大分子育种技术在睡莲育种中应用的力度和范围，如独特的花色、抗逆性、株型的大小等，可提高定向育种的效率。这种无菌材料制备方法是基因编辑技术的前提。转基因技术和基因编辑技术是当下热门的两项基因操作新技术，主要通过对基因组进行定向改造来获得目的种质材料。植物组织及细胞培养技术成为植物遗传转化和基因编辑的关键限速步骤。可见，无论是睡莲离体繁育，还是基因工程育种，都需要建立睡莲的离体再生体系。

然而，睡莲属于水生植物，喜肥沃的淤泥环境，无菌材料的获得成为睡莲离体再生体系建立的技术瓶颈。基于其主要原因是睡莲是水生植物，花从淤泥水中长出，难以获得无菌材料。目前虽然有睡莲离体再生的尝试，如白芳芳，闫长松报道(.荷花、睡莲根段繁殖试验.陕西林业科技，2019，47(03)：22-24)采根段进行繁殖。但尚没有建立有效的离体再生体系。因此，国内外未见睡莲离体再生的成功报道，需要研发睡莲的再生体系。

发明内容

为尽快实现睡莲高效离体再生体系建立和加快睡莲育种进程，本发明人开展了睡莲的无菌材料制备研究，获得了其无菌材料的制备方法。因而本发明首次以睡莲种子培养成功获得无菌材料。

本发明首先提供一种睡莲无菌材料的制备方法，其包括如下步骤：

(1)清洗去除表面假种皮且进行初步表面消毒；

(2)将种子浸泡处理液进行种子催芽1至3天，所述种子浸泡液含0.5至1.5mg/LGA₃和0.05至0.2mg/L BA的溶液；

(3)将浸泡处理的种子用乙醇和次氯酸钠溶液依次消毒；

(4)再将种子于萌发培养基上培养到发芽。

优选地，第(1)步消毒进一步分成两步消毒，即：

(a)将清洗的睡莲种子于洗洁精和吐温溶液浸泡，期间搅拌；更优选地，用搅拌器中速搅拌烧杯中液体10-30min后取出睡莲种子；

(b)再将种子置于高锰酸钾溶液中涡旋振荡消毒；更优选地，是在0.4-0.6％(最优选为0.5％)的高锰酸钾溶液中涡旋1-3min(优选2min)后，用清水洗净，重复2-4次。

优选地，第(2)步中，将第(1)步所得的睡莲种子置于附含0.5-1.5mg/L GA₃和0.05-0.15mg/L BA的溶液中浸泡1-3d。更优选地，激素浓度为1mg/L GA₃和0.1mg/L BA。

优选地，第(3)步中，所述消毒是用70％的乙醇消毒1-2min；再用10％的次氯酸钠涡旋10-20min，无菌水冲洗5-10次。

优选地，第(4)步分成两个阶段：

第一阶段为预培养，种子接种于附含0.3-1mg/L GA₃的培养基的中预培养3-7d；，优选的培养条件为：光照50-70μmol.m^-2.s^-1，14-18h/d培养，培养温度为23-27℃；更优选地，步骤4的预培养中，所述激素GA₃的含量为0.5-0.8mg/L；

第二阶段将预培养后的种子接种于2-4mg/l BA、0.3-0.8mg/l NAA和0.1-0.5mg/LGA₃的培养基中培养到萌发，优选的培养条件为：光照50-70μmol.m^-2.s^-1，14-18h/d培养，培养温度为23-27℃。

上述的更优选培养条件为：光照60μmol.m-2.s-1，16h/d培养，培养温度为25℃。

进一步地，第(4)步采用wpm基本培养基是改良培养，即其中的NH₄NO₃含量由400调高到500-800mg/l，优选为550-650mg/l，最优选为600mg/l，并增加了谷氨酸，优选的谷氨酸含量为50-150mg/l，优选为80-120mg/l，最优选为100mg/l。

更具体的所述培养基含量组成如下(也简称为SL培养基)：

本发明的方法适用于各种睡莲品种，例如埃及蓝睡莲、小白子午莲、米奴塔睡莲、延药睡莲等。

在一个具体实施例中，所述一种睡莲无菌材料的制备方法，其包括如下步骤：

(1)清洗：将埃及睡莲种子放入干净的纱布中，在流水下搓洗，去除种子表面杂质后用纱布包裹好种子并用皮筋扎好，放入加有洗洁精和吐温溶液的烧杯中，顶端用夹子固定在杯沿，用搅拌器中速搅拌烧杯中液体20min后取出睡莲种子。

(2)将步骤(1)所得的睡莲种子置于2ml EP管中，每个EP管中种子量不超过EP管容量的1/3。配置0.5％的高锰酸钾溶液加入EP管中，涡旋2min后用清水洗净，重复3次。

(3)将步骤(2)所得的睡莲种子置于附含1mg/L GA₃和0.1mg/L BA的溶液中浸泡1-3d。

(3)消毒：将步骤(3)所得的睡莲种子吸干表面水珠，置于2ml EP管中，在超净工作台上用70％的乙醇消毒1-2min；10％的次氯酸钠涡旋15min，无菌水冲洗10次，无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠。

(5)预培养：将步骤(4)所得的睡莲种子接种于附含0.5mg/L GA₃的SL培养基的培养皿中培养5d。培养条件：光照(60μmol.m^-2.s^-1)16h/d培养，培养温度为25±2℃。

(6)将步骤(5)所得的种子接种于附含3mg/l BA、0.5mg/l NAA和0.3mg/L GA₃的SL培养基中培养5-10d种子开始萌发；培养10-20d，萌发率可达90-100％；培养20-40d得到生长健壮的睡莲无菌材料。

本发明方法适用于睡莲(Nymphaea L.)的大多数品种，如小白子午莲(N.tetragona)，10d即可萌发，萌发率100％；埃及蓝睡莲(N.caerulea)，10d即可萌发，萌发率100％；米奴塔睡莲(N.minuta)，25d即可萌发，萌发率90％。因此，本发明通过有效清毒提高无效率，通过预培养以及萌发培养的处理(通过培养基成分的调整和优化)，能够在短时间内使睡莲种子大量的萌发。同期实验表明，采用本发明的方法，种子萌发比自然萌发时间周期至少可缩短一半，且萌发率可达百分之百。按本发明的方法重复三次试验，均可获得至少90％以上的无菌材料，且长势一致。而且这种萌发方法不受季节限制，可以常年制备，具较广阔的应用前景。

附图说明

图1睡莲种子横切图。

图2预培养3d的埃及蓝睡莲。

图3培养10d的埃及蓝睡莲。

图4培养20d的埃及蓝睡莲。

图5培养30d的埃及蓝睡莲。

图6培养10d的小白子午莲。

图7培养30d的小白子午莲。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例一：埃及蓝睡莲无菌材料制备

下面以埃及蓝睡莲为例阐述获取无菌材料的制备方法。

1.种子预处理

通过前期预实验发现，由于睡莲种子从淤泥中长出，且种子表明连带许多假种皮(图1)，灭菌困难，接入诱导培养基后污染率高达80％；且种子在培养基上难以萌发。本实验先将埃及蓝睡莲种子进行预处理，再进行表面消毒，接入诱导培养基。预处理主要为两阶段：(1)清洗去表面假种皮且进行初步表面消毒；(2)种子浸泡处理液进行种子催芽。

(1)清洗

将睡莲种子放入干净的纱布中，在流水下搓洗，去除种子表面杂质后用纱布包裹好种子并用皮筋扎好，放入加有洗洁精和吐温溶液(1L水加入洗洁精约1-2ml，吐温1-2滴)的烧杯中，顶端用夹子固定在杯沿，用搅拌器中速(300～600转/分)搅拌烧杯中液体10-30min后取出睡莲种子。将取出的睡莲种子置于2ml EP管中，每个EP管中种子量不超过EP管容量的1/3。配置0.5％的高锰酸钾溶液加入EP管中，涡旋2min后用清水洗净，重复3次。

(2)浸泡催芽

将清洗后的埃及蓝睡莲种子置于附含1mg/L GA₃和0.1mg/L BA的溶液中浸泡2d。

2.消毒

将浸泡2d后的埃及蓝睡莲种子吸干表面水珠，置于2ml EP管中，在超净工作台上用70％的乙醇消毒(0、1、2、3min)；10％的次氯酸钠涡旋(8、12、15、20min)，无菌水冲洗5-10次，无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，接种于附含0.5mg/L GA₃的SL培养基预培养，3d后统计无菌率。

无菌率％＝无菌种子数/接种的总外植体数×100

实验结果：

由表1可知，经由预处理的埃及蓝睡莲种子无菌率显著高于未经预处理的睡莲种子。经由预处理的睡莲种子结合70％乙醇和10％次氯酸钠消毒无菌率可达100％(A5、A9号处理)，优选为A9号处理：70％乙醇1min+10％次氯酸钠涡旋12min，10％次氯酸钠消毒时间更短，对外植体损伤更小，利于后期萌发。

表1不同消毒方案对睡莲无菌率的影响

3.基本培养基筛选

为筛选最佳基本培养基，本试验以MS、WPM、DCR、WPM1、SL等5种基本培养基进行试验，各培养基中均添加BA1.0mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5.6g/L，pH值5.8。每个处理50粒种子，观察记录种子开始萌动时间及接种30d后的萌发率。

萌发率％＝萌发种子数/接种的总外植体数×100，下同。

实验结果:

本实验先以MS、WPM、DCR三种基本先进行预实验，实验结果表明1/2MS和WPM培养基培养的种子萌发效果较佳，DCR培养基效果最差。MS无机盐和离子浓度较高，而WPM培养基为低盐培养基，根据预实验效果调整基本培养基配方：WPM1配方为在WPM的基础上NH₄NO₃含量由400mg/L增加到600mg/L；培养基SL配方为在WPM的基础上NH₄NO₃含量由400mg/L增加到600mg/L，增加谷氨酸(谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一)含量100mg/L。由表2可知，培养基SL诱导的睡莲种子萌动时间最短，萌发率最高。

表2不同基本培养基对睡莲种子萌发的影响

3.预培养

由于睡莲种子萌动周期较长，本实验增加了预培养处理，将消毒后的埃及蓝睡莲种子接种于附含0.5mg/L GA₃、蔗糖30g/L和琼脂5.6g/L、pH值5.8的SL培养基的培养皿中培养3-7d(图2)。培养条件：光照(60μmol.m^-2.s^-1)16h/d培养，培养温度为25±2℃。

4.培养

对经由预培养的睡莲种子进行激素配比对种子萌发的影响实验。

将经由预培养的种子接种于附含BA(包括三个浓度梯度1、3、5mg/l)的、NAA(包括两个浓度梯度0.1、1mg/l)、GA₃(包括三个浓度梯度0.1、0.3、0.5mg/l)、蔗糖30g/L和琼脂5.6g/L，pH值5.8的SL培养基中培养，每个处理50粒种子，观察记录种子开始萌动时间及接种30d后的萌发率、生长状况。

实验结果：

由表3可知，埃及蓝睡莲种子诱导萌发的最佳激素配比为处理C4、C6，5-6d种子开始萌发(图3)；培养10d左右，萌发率可达100％，且长势一致(图4)；培养20-30d得到生长健壮的睡莲无菌材料(图5)。

表3不同激素配比对睡莲种子萌发的影响

由表3可知，埃及蓝睡莲种子诱导萌发的最佳激素配比为处理C4、C6，5-6d种子开始萌发(图3)；培养10d左右，萌发率可达100％，且长势一致(图4)；培养20-30d得到生长健壮的睡莲无菌材料(图5)。

实施例二：小白午莲无菌材料的制备

根据实施例一筛选的最佳条件和参数，采用小白午莲种子获取其无菌材料。

其中，采用睡莲培养基(SL)的制备：按照下表配制基本培养基，蔗糖30g/L和琼脂5.6g/L，pH5.8，121℃灭菌15-25分钟。种子第一阶段预培养和第二阶段培养均使用该培养基作为基础培养基，第一阶段预培养的培养基中激素GA₃的含量为是0.3mg/l，第二阶段培养的培养基中激素为3mg/l BA、1mg/l NAA、0.3mg/L GA₃。

表4睡莲培养基(SL)的组成成分一览表

(此培养基是在wpm基本培养基上改良的，即NH₄NO₃含量由400调高到600mg/l；此外，增加了谷氨酸100mg/l)

实验结果表明，小白午莲种子培养10d即可萌发，萌发率100％，培养10d的小白子午莲如图6所示。培养30d的小白子午莲如图7所示。因此，实验表明本方法同样适用于小白午莲。