阅读说明：本技术 一种pH/低氧双响应释药协同光动力治疗的纳米复合物及其制备方法 (Nano compound for pH/hypoxia dual-response drug release synergistic photodynamic therapy and preparation method thereof ) 是由 高瑜 李旭东 陈海军 王俊 于 2019-12-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种pH/低氧双响应释药协同光动力治疗的纳米复合物及其制备方法。所述纳米材料是通过在壳聚糖表面修饰低氧响应基团2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酸(NA)形成的Cs-NA纳米材料,并与光敏剂相结合,形成纳米复合物。该纳米复合物可在肿瘤酸性和低氧环境下响应释药,并兼具分子靶向作用和光动力疗效,实现光动力治疗和分子靶向治疗的结合,提高光敏剂在肿瘤部位的积聚并降低光毒性。(The invention discloses a pH/hypoxia dual-response drug release and photodynamic therapy nanocomposite and a preparation method thereof. The nano material is a Cs-NA nano material formed by modifying a hypoxia response group 2- (2-nitro-1H-imidazole-1-yl) acetic acid (NA) on the surface of chitosan, and is combined with a photosensitizer to form a nano compound. The nano-composite can respond to drug release in acidic and low-oxygen environments of tumors, has both molecular targeting effect and photodynamic curative effect, realizes the combination of photodynamic treatment and molecular targeting treatment, improves the accumulation of photosensitizer at tumor positions and reduces phototoxicity.)

一种pH/低氧双响应释药协同光动力治疗的纳米复合物及其 制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于光动力治疗的壳聚糖纳米材料及其制备方法。

背景技术

光动力治疗（PDT）作为一种新型微创治疗手段，已经应用于多种癌症的治疗。在特定波长的激发光激发下，光敏剂（PSs）被激发，将能量转移到周围的氧气中，产生高毒性的活性氧（ROS），从而杀死肿瘤细胞（Robertson C A , Evans D H , Abrahamse H .Photodynamic therapy (PDT): A short review on cellular mechanisms and cancerresearch applications for PDT[J]. Journal of Photochemistry and PhotobiologyB: Biology, 2009, 96(1):1-8.）。相较于传统的手术、化疗、放疗，光动力治疗创伤小、特异性更高、对周围组织伤害小，需要特定激光激发，减少对正常组织的毒副作用。然而，光动力治疗本身也存在缺点，接受光动力治疗的病人，为避免光毒性，需要长时间躲在暗处，病人顺应性低。

缺氧是实体瘤中异常的血管生成，血管受损和淋巴引流失调引起的肿瘤微环境的标志性特征。低氧肿瘤组织中的氧气浓度约（5 mm Hg），这明显低于正常组织中的低氧水平（70 mm Hg）。

本发明开发了一种新型壳聚糖纳米材料，用于肺癌的高效治疗。通过EDCI/NHS催化的酰胺化反应将乙酸硝基咪唑偶联在壳聚糖链上，得到低氧和酸性pH响应释放和光动力治疗功能的纳米复合物。

本发明旨在提供一种可控释放的，低光毒性的纳米复合药物的制备方法。利用硝基咪唑基团低氧响应和壳聚糖的酸性pH响应的作用，主动靶向到肿瘤部位释放，增加药物在肿瘤部位的积累，同时降低传统光敏剂光毒性高的问题，提高光动力治疗的疗效。

为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一种pH/低氧双响应释药协同光动力治疗的纳米复合物，所述纳米复合物是以乙酸硝基咪唑修饰的壳聚糖Cs-NA为载体，包载带负电的光敏剂得到的，其中乙酸硝基咪唑修饰的壳聚糖Cs-NA是将壳聚糖Cs糖链的氨基修饰上2-(2-硝基咪唑-1-基)乙酸NA得到的，2-(2-硝基咪唑-1-基)乙酸的接枝率在10%~30%。

纳米复合物的粒径在70-150nm之间。

所用壳聚糖的分子量在6-1000kDa。

带负电的光敏剂包括玫瑰红（RB）、玫瑰红衍生物（RBD）、吲哚靛绿（ICG）、血卟啉（HP）中的一种。其中玫瑰红衍生物RBD为侧链含有羧基的玫瑰红衍生物（RBD），侧链碳原子数8个碳。

所述的纳米复合物的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）：将壳聚糖Cs溶于0.1wt%乙酸溶液中，再依次加入NA，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDCI和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温搅拌12小时后，反应液装入透析袋中透析，冻干，得到白色絮状Cs-NA载体；其反应步骤为：

步骤（2）：将Cs-NA载体溶于0.1wt%乙酸溶液中，放入圆底烧瓶中，逐滴加入含带负电的光敏剂的DMSO溶液，滴加速度为1-2滴每秒，室温避光搅拌反应12h，反应液装入透析袋中透析，冻干，得到所述的纳米复合物。

步骤（1）中，Cs ：NA ：EDCI ：NHS的摩尔比为1 ：1-3 ：4 ：4。

纳米复合物中，Cs-NA与带负电的光敏剂的质量比在1 ：1~1.5 ：1。

所述步骤（1）和（2）中的透析袋截留分子量为8000-14000 Da。

本发明的纳米复合物用于肿瘤细胞的靶向治疗和光动力治疗。

本发明中Cs-NA、RBD 和RB的结构式如下。RBD的制备方法参照已报道的方法（Sugita N , Kawabata K I , Sasaki K , et al. Synthesis of AmphiphilicDerivatives of Rose Bengal and Their Tumor Accumulation[J]. BioconjugateChemistry, 2007, 18(3):866-873.）。

第一，本发明的原理：壳聚糖骨架上的-NH³⁺带有强正电荷，能与带负电的光敏剂形成稳定的复合物，达到转运光敏剂的目的，并实现药物的控释，同时它具有较好的生物相容性，临床应用潜力大。

第二，肿瘤细胞低氧的特殊病理环境使得还原应性激增加，导致硝基咪唑酶，偶氮还原酶和醌还原酶的过表达，利用硝基咪唑基团可以被肿瘤组织中的硝基还原酶还原，以达到响应释放的目的。

第三，利用肿瘤组织中酸性pH，促使壳聚糖结构的解离，促进药物释放。

第四，光敏剂RB、RBD、ICG和HP，可以在一定波长激发光照射下，产生高毒性的活性氧ROS，并有效的杀死肿瘤细胞。

第五，本发明改善了光敏剂RB、RBD、ICG和HP的水溶性，同时降低了它的光毒性。

本发明的有益效果是：

第一，本发明以壳聚糖作为输送载体，通过控制纳米复合物的粒径实现被动靶向，将药物输送到肿瘤部位；

第二、硝基咪唑作为低氧响应基团，能够在低氧肿瘤环境中被还原，促进包载药物的释放，达到光敏剂在肿瘤部位的积聚和降低光毒性的作用。

附图说明

图1为实施例2 制备的Cs-NA载体和原料Cs的¹H-NMR 谱图；

图2为实施例2制备的Cs-NA载体和原料Cs的红外图谱；

图3为实施例5、6制备的CBNs和CBDNs的粒径峰图；

图4为实施例8制备的CBDNs的紫外图谱；

图5为实施例9中CBDNs的释放特性图；

图6为实施例10中几种纳米粒对PC-9细胞的体外毒性实验。

具体实施方法：

下面结合

具体实施方式

，对本发明进行进一步说明，有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

将玫瑰红（1g）溶解于DMF（10ml）中，并加入8-溴辛酸（0.68g）。反应液80℃加热搅拌7h。反应完成后，旋蒸除去DMF，并将残余物与***搅拌过夜。将残余物过滤并用***彻底洗涤后将其水搅拌过夜。为了除去过量的玫瑰红和杂质，过滤后，用乙醇重结晶得到***粉末RBD，其结构式如下：

氢谱数据如下

¹H NMR (DMSO-d ₆) δ (ppm):  0.89 (m, CH₂, 2H, J = 7.3 Hz), 1.03 (m, CH₂,2H, J = 7.7 Hz), 1.09 (m, CH₂, 4H, J = 6.8 Hz), 1.43 (m, CH₂, 2H, J = 7.5 Hz),2.18 (t, CH₂COOH, 2H, J = 7.8 Hz), 3.93 (t, OCH₂, 2H, J = 6.3 Hz), 7.48 (s,ArH, 2H), 8.17 (br.s, ArOH), 11.9 (br.s, COOH).

实施例2

称取Cs（20.00mg）溶解于2 mL的 0.1wt%乙酸溶液， 再依次加入NHS（35.57 mg）、EDCI（90.10mg）、2-(2-硝基咪唑-1-基)乙酸（18.58mg），室温搅拌反应 12 h后，待反应结束后，将反应液转移至截留分子量为8000-14000 Da 的透析袋中，在二次水中透析3天。最后经冷冻干燥得到白色粉末状产物（Cs-NA），储存于-20℃。用氘代乙酸作为¹H-NMR谱的测试溶剂，从图1可知，6.5-8之间出现的三个芳香环的吸收峰，证明了咪唑基团的存在。对Cs-NA和Cs进行红外图谱分析，如图2所示，Cs-NA在3000 cm^-1~3500 cm^-1吸收峰明显增强，说明耦合上了强的芳香环，证明了咪唑基团的存在，在1440 cm^-1处吸收峰增强，表明了酰胺的形成，进一步证明了乙酸硝基咪唑与壳聚糖的结合。由此可知，乙酸硝基咪唑已成功偶联到壳聚糖上。通过紫外可见光谱测得，乙酸硝基咪唑接枝率为13.4%。

实施例3

称取Cs（20.00mg）溶解于2 mL的 0.1wt%乙酸溶液， 再依次加入NHS（35.57 mg）、EDCI（90.10mg）、2-(2-硝基咪唑-1-基)乙酸（55.74mg），室温搅拌反应 12 h后，待反应结束后，将反应液转移至截留分子量为8000-14000 Da 的透析袋中，在二次水中透析3天。最后经冷冻干燥得到白色粉末状产物（Cs-NA），储存于-20℃。通过紫外可见光谱测得，乙酸硝基咪唑接枝率为29.6%。

实施例4

将1mg Cs-NA载体溶于0.1wt%乙酸溶液中，放入圆底烧瓶中，逐滴加入含1mg 吲哚靛绿（ICG）的DMSO溶液1ml，室温避光搅拌反应12h，反应液装入透析袋中透析，冻干，得到Cs-NA/ICG纳米药物（CINs）。纳米粒（CINs）粒径89.6 ± 2.4nm。

实施例5

将1mg Cs-NA载体溶于0.1wt%乙酸溶液中，放入圆底烧瓶中，逐滴加入含1mg 玫瑰红含8个碳的羧基侧链衍生物（RBD）的DMSO溶液1ml，室温避光搅拌反应12h，反应液装入透析袋中透析，冻干，得到Cs-NA /玫瑰红衍生物纳米药物。如图3所示，纳米粒（CBDNs）粒径115.4± 1.9 nm。

实施例6

将1mg Cs-NA载体溶于0.1wt%乙酸溶液中，放入圆底烧瓶中，逐滴加入含1mg 玫瑰红的（RB）的DMSO溶液1ml，室温避光搅拌反应12h，反应液装入透析袋中透析，冻干，得到Cs-NA /玫瑰红纳米药物；如图3所示，Cs-NA/RB纳米粒（CBNs）粒径86.89±1.63 nm。

实施例7

将1mg Cs载体溶于0.1wt%乙酸溶液中，放入圆底烧瓶中，逐滴加入含1mg 玫瑰红含8个碳的羧基侧链衍生物（RBD）的DMSO溶液1ml，室温避光搅拌反应12h，反应液装入透析袋中透析，冻干，得到Cs /玫瑰红衍生物纳米药物；Cs/RBD纳米粒（CsDNs）粒径128.7±3.6 nm。

实施例8

称取10mg Cs-NA溶于2mL 0.1wt%乙酸溶液中，将RBD(玫瑰红含8个碳的羧基侧链衍生物)（10mg，2mL DMSO）逐滴加入到 Cs-NA 溶液中，常温避光搅拌12h。反应液在二次水中透析3天，冷冻干燥得CBDNs。如图4所示，CBDNs的荧光强度几乎为0，证明了RBD在Cs-NA中的包封率接近100%。CBDNs的包封率和装载率分别为100%和26.4%±0.03%。

实施例9

吸取2 mL的CBDNs(玫瑰红含8个碳的羧基侧链衍生物)溶液放入截留分子量为8000～14000 Da的透析袋中，再将透析袋放入20 mL的PBS中。37℃搅拌条件下，在设定的时间取1mL用于检测，同时补加1 mL的上述缓冲液。CBDNs的释放特性曲线如图5所示，pH值为5.5时，24 h 内RBD的最大释放量为52%，pH 5.5+Na₂S₂O₄组中RBD的累积释放量达到58%。是由于硝基咪唑中的硝基，在还原条件易被还原成氨基，促进纳米结构的解离。此外酸性pH使壳聚糖分子内氢键被破坏，从而促进了壳聚糖的离解。CBDNs的累积释放在8h后呈下降趋势，是由于在释放介质中RBD的结构易被破坏，导致荧光强度呈现先增后降的现象。而在pH=7.4、无Na₂S₂O₄组中，累积释放量较少，24h累积释放量只有31%。

实施例10

以人肺癌细胞系PC-9细胞为测试细胞系（细胞购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心）。

细胞培养方法：从液氮罐中取出冻存的细胞，迅速置于37℃水浴中，不断摇动，使之迅速融化，室温1000转/min离心；弃去冻存液，用1ml培养液吹打，使之成为细胞悬液，将细胞悬液移入培养瓶中，补充3ml培养液至将培养瓶置于37℃，5% CO₂培养箱中培养24小时后，弃去旧培养液，更换新培养液，继续培养。

细胞毒性实验：选取对数期生长且状态良好的PC-9细胞，经胰蛋白酶消化后，配制成细胞悬液（0.5-1×10⁵个/mL）。按每孔100 µL细胞悬液的量接种到96孔板，置于含5% CO₂，37℃培养箱中孵育24 h后，加入不同浓度梯度的CBNs、CBDNs、CsDNs。孵育4h后，照射组给予激光（2.0 W/cm²，10 min）。药物作用24h后，用PBS洗两遍，每孔加入100ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h后终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入100ul DMSO,置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570 nm 处测量各孔的吸光值。并按下式计算细胞的存活率。存活率（%）=（实验组吸收值-溶剂对照组吸收值）/（空白组吸收值-溶剂对照组吸收值）。

细胞毒性结果如图6 所示。从图6中可以看出，在常氧环境下，CBNs、CsDNs和CBDNs几乎都没有显示出明显的毒性，而在光照后CBDNs表现出了一定程度的细胞毒性。如图6所示，在低氧环境下，CBNs、CBDNs细胞毒性明显增强，在光照作用后，细胞毒性进一步增强。而CsDNs在常氧、低氧条件下的毒性没有明显变化，说明了纳米复合物在低氧条件下的作用，以及适当的降低了光毒性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。