阅读说明：本技术 一种采用酶交联和茶多酚组合联用处理生物瓣膜的方法 (Method for treating biological valve by combining enzyme crosslinking and tea polyphenol ) 是由 王云兵 雷洋 訾振军 于 2018-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种采用酶交联和茶多酚组合联用处理生物瓣膜的方法,所述方法包括用羟基苯丙酸修饰猪或牛的心包膜,然后浸泡茶多酚,然后在辣根过氧化物酶和过氧化氢的条件下引发酶交联；羟基苯丙酸将在心包膜上引入酚羟基,外源茶多酚提供额外的酚羟基；辣根过氧化物酶和过氧化氢将实现酚羟基的化学交联；本发明提供的方法能够提升生物材料的结构稳定性及抗钙化性能,潜在地延长其使用寿命。(The invention discloses a method for treating a biological valve by combining enzyme crosslinking and tea polyphenol, which comprises the steps of modifying a porcine or bovine pericardium by hydroxy phenylpropionic acid, then soaking tea polyphenol, and then initiating enzyme crosslinking under the conditions of horseradish peroxidase and hydrogen peroxide; the hydroxyl phenylpropionic acid introduces phenolic hydroxyl on the pericardium, and the exogenous tea polyphenol provides additional phenolic hydroxyl; horseradish peroxidase and hydrogen peroxide will realize the chemical crosslinking of phenolic hydroxyl; the method provided by the invention can improve the structural stability and the anti-calcification performance of the biological material and potentially prolong the service life of the biological material.)

一种采用酶交联和茶多酚组合联用处理生物瓣膜的方法

技术领域

本发明涉及一种生物医学材料以及医疗器械技术领域，特别是一种采用酶交联和茶多酚组合联用处理生物瓣膜的方法及其生物材料。

背景技术

心脏瓣膜疾病是一种常见的瓣膜衰退疾病。在解剖学上表现为血液通路变窄或瓣膜关闭不全。

心脏瓣膜疾病的治疗包括开胸瓣膜置换手术以及经皮心脏瓣膜置换手术。开胸手术对病人创伤大、风险高、恢复慢、需体外循环支持，很多患者无法接受。经皮心脏瓣膜置换手术因为对病人创伤小、风险低，成为未来瓣膜手术的主要趋势。

生物心脏瓣膜是指一类用于替换人体病变心脏瓣膜的生物医学材料。生物心脏瓣膜一般由猪心包膜、牛心包膜等通过戊二醛交联制备而成。

戊二醛交联处理具有操作简单，成本低以及胶原蛋白交联程度高的特点，是目前生物心脏瓣膜化学交联的行业首选。然而，戊二醛交联的生物心脏瓣膜存在容易降解以及钙化的问题，导致生物心脏瓣膜只有10年左右的有效使用年限。戊二醛可以实现胶原蛋白的稳定交联，但是不能交联弹性蛋白，导致其有一定技术局限性。

因此，通过优化生物心脏瓣膜的化学交联方法，特别是开发能够提高弹性蛋白结构稳定性的新型材料处理方法，将提升生物心脏瓣膜的整体结构稳定性以及抗钙化性能，对于科学研究以及相关产业领域的发展具有重大意义，而目前并没有很好的方法，因此需要改进。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种采用酶交联和茶多酚组合联用处理生物瓣膜的方法，能有效提升生物心脏瓣膜等生物材料的结构稳定性以及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

一种采用酶交联和茶多酚组合联用处理生物瓣膜的方法，具体包括以下步骤：

S1、获取生物材料；

S2、用蒸馏水浸泡清洗；

S3、然后将步骤S2清洗后的生物材料进行羟基苯丙酸修饰，使用的羟基苯丙酸摩尔浓度为1mM-1M的水溶液，使用的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔溶度为0.01-1M；

S4、将步骤S3处理后的生物材料浸泡茶多酚，使用的茶多酚质量浓度为0.1％-10％；

S5、将步骤S4处理后的生物材料进行辣根过氧化物酶/过氧化氢引发的酶交联，使用的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1％-10％，使用的过氧化氢质量浓度为0.1％-10％；

S6、最后用蒸馏水浸泡清洗。

进一步的，在步骤S1中：采集新鲜的生物材料，如猪或牛的心包组织，并于4摄氏度低温湿润状态下保存。

进一步的，在步骤S2中，采用柔和摩擦和流体压力在振荡条件之下用蒸馏水清洗心包组织，去除粘附的非心包和非胶原组织，所述清洗通过渗压休克实现对心包组织有效脱细胞，且优选地，清洗持续到没有可见的粘附的非心包或非胶原组织，优选地，是于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。

进一步的，在步骤S3中，清洗后的生物材料进行羟基苯丙酸修饰，使用的羟基苯丙酸摩尔浓度为1mM-1M的水溶液，这个步骤需要确保羟基苯丙酸达到接近饱和的物理渗透，从而尽可能多地引入羟基苯丙酸。

进一步的，在步骤S4中，处理后的生物材料浸泡茶多酚，使用的茶多酚质量浓度为0.1％-10％，茶多酚通过氢键作用吸附于弹性蛋白纤维的疏水段，从而提高弹性蛋白的结构稳定性能。

进一步的，在步骤S5中，处理后的生物材料进行辣根过氧化物酶/过氧化氢引发的酶交联，使用的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1％-10％，使用的过氧化氢质量浓度为0.1％-10％，过氧化氢是一种氧化剂，辣根过氧化物酶在氧化剂的作用下，能够催化酚羟基实现化学交联。

进一步的，在步骤S6中，进行蒸馏水清洗，这个清洗步骤将清除没有反应的茶多酚、辣根过氧化物酶以及过氧化氢。

本发明的有益效果是：本发明提供的方法能够提升生物材料的结构稳定性及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命。

附图说明

为了进一步澄清一个或多个本发明的上述以及其他的优点和特性，通过参照附图中示出的特定实施方案，呈现一个或多个本发明更具体的描述。

图1是制备的生物心脏瓣膜的具体流程图；

图2是对羟基苯丙酸修饰心包膜和辣根过氧化物酶(HRP)/过氧化氢(H2O2)酶交联化学原理示意图。

图3是采用实施例1所得到的酶降解重量损失百分比。

图4是采用实施例1所得到的不可溶弹性蛋白定量检测结果。

图5是采用实施例1所得到的大鼠皮下植入挂钙量检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种采用酶交联和茶多酚组合联用处理生物瓣膜的方法，如图1所示，具体包括以下步骤：

S1、获取生物材料；

S2、用蒸馏水浸泡清洗；

S3、然后将步骤S2清洗后的生物材料进行羟基苯丙酸修饰，使用的羟基苯丙酸摩尔浓度为1mM-1M的水溶液，使用的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔溶度为0.01-1M；

S4、将步骤S3处理后的生物材料浸泡茶多酚，使用的茶多酚质量浓度为0.1％-10％；

S5、将步骤S4处理后的生物材料进行辣根过氧化物酶/过氧化氢引发的酶交联，使用的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1％-10％，使用的过氧化氢质量浓度为0.1％-10％；

S6、最后用蒸馏水浸泡清洗。

在步骤S1中：采集新鲜的生物材料，如猪或牛的心包组织，并于4摄氏度低温湿润状态下保存。

在步骤S2中，采用柔和摩擦和流体压力在振荡条件之下用蒸馏水清洗心包组织，去除粘附的非心包和非胶原组织，所述清洗通过渗压休克实现对心包组织有效脱细胞，且优选地，清洗持续到没有可见的粘附的非心包或非胶原组织，优选地，是于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。

在步骤S3中，清洗后的生物材料进行羟基苯丙酸修饰，使用的羟基苯丙酸摩尔浓度为1mM-1M的水溶液，这个步骤需要确保羟基苯丙酸达到接近饱和的物理渗透，从而尽可能多地引入羟基苯丙酸。

在步骤S4中，处理后的生物材料浸泡茶多酚，使用的茶多酚质量浓度为0.1％-10％，茶多酚通过氢键作用吸附于弹性蛋白纤维的疏水段，从而提高弹性蛋白的结构稳定性能。

在步骤S5中，处理后的生物材料进行辣根过氧化物酶/过氧化氢引发的酶交联，使用的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1％-10％，使用的过氧化氢质量浓度为0.1％-10％，过氧化氢是一种氧化剂，辣根过氧化物酶在氧化剂的作用下，能够催化酚羟基实现化学交联。

在步骤S6中，进行蒸馏水清洗，这个清洗步骤将清除没有反应的茶多酚、辣根过氧化物酶以及过氧化氢。

在本实施例中，图2为羟基苯丙酸修饰心包膜和辣根过氧化物酶(HRP)/过氧化氢(H2O2)酶交联化学原理示意图。

在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。然后浸泡在50mM羟基苯丙酸水溶液在室温当中4小时。然后采用10mM碳二亚胺和10mMN-羟基琥珀酰亚胺在室温浸泡24小时。然后采用1％表没食子儿茶素没食子酸酯浸泡24小时。然后采用1％辣根过氧化物酶和1％过氧化氢于37摄氏度150RPM转速振荡条件之下浸泡24小时。

实施例2

一种采用酶交联和茶多酚组合联用处理生物瓣膜的方法，如图1所示，具体包括以下步骤：

S1、获取生物材料；

S2、用蒸馏水浸泡清洗；

S3、然后将步骤S2清洗后的生物材料进行羟基苯丙酸修饰，使用的羟基苯丙酸摩尔浓度为1mM-1M的水溶液，使用的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔溶度为0.01-1M；

S4、将步骤S3处理后的生物材料浸泡茶多酚，使用的茶多酚质量浓度为0.1％-10％；

S5、将步骤S4处理后的生物材料进行辣根过氧化物酶/过氧化氢引发的酶交联，使用的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1％-10％，使用的过氧化氢质量浓度为0.1％-10％；

S6、最后用蒸馏水浸泡清洗。

在步骤S1中：采集新鲜的生物材料，如猪或牛的心包组织，并于4摄氏度低温湿润状态下保存。

在步骤S2中，采用柔和摩擦和流体压力在振荡条件之下用蒸馏水清洗心包组织，去除粘附的非心包和非胶原组织，所述清洗通过渗压休克实现对心包组织有效脱细胞，且优选地，清洗持续到没有可见的粘附的非心包或非胶原组织，优选地，是于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。

在步骤S3中，清洗后的生物材料进行羟基苯丙酸修饰，使用的羟基苯丙酸摩尔浓度为1mM-1M的水溶液，这个步骤需要确保羟基苯丙酸达到接近饱和的物理渗透，从而尽可能多地引入羟基苯丙酸。

在步骤S4中，处理后的生物材料浸泡茶多酚，使用的茶多酚质量浓度为0.1％-10％，茶多酚通过氢键作用吸附于弹性蛋白纤维的疏水段，从而提高弹性蛋白的结构稳定性能。

在步骤S5中，处理后的生物材料进行辣根过氧化物酶/过氧化氢引发的酶交联，使用的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1％-10％，使用的过氧化氢质量浓度为0.1％-10％，过氧化氢是一种氧化剂，辣根过氧化物酶在氧化剂的作用下，能够催化酚羟基实现化学交联。

在步骤S6中，进行蒸馏水清洗，这个清洗步骤将清除没有反应的茶多酚、辣根过氧化物酶以及过氧化氢。

在本实施例中，图2为羟基苯丙酸修饰心包膜和辣根过氧化物酶(HRP)/过氧化氢(H2O2)酶交联化学原理示意图。

在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。然后浸泡在100mM羟基苯丙酸水溶液在室温当中4小时。然后采用10mM碳二亚胺和10mMN-羟基琥珀酰亚胺在室温浸泡24小时。然后采用1％表没食子儿茶素没食子酸酯浸泡24小时。然后采用1％辣根过氧化物酶和1％过氧化氢于37摄氏度150RPM转速振荡条件之下浸泡24小时。

实施例3

一种采用酶交联和茶多酚组合联用处理生物瓣膜的方法，如图1所示，具体包括以下步骤：

S1、获取生物材料；

S2、用蒸馏水浸泡清洗；

S3、然后将步骤S2清洗后的生物材料进行羟基苯丙酸修饰，使用的羟基苯丙酸摩尔浓度为1mM-1M的水溶液，使用的碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔溶度为0.01-1M；

S4、将步骤S3处理后的生物材料浸泡茶多酚，使用的茶多酚质量浓度为0.1％-10％；

S5、将步骤S4处理后的生物材料进行辣根过氧化物酶/过氧化氢引发的酶交联，使用的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1％-10％，使用的过氧化氢质量浓度为0.1％-10％；

S6、最后用蒸馏水浸泡清洗。

在步骤S1中：采集新鲜的生物材料，如猪或牛的心包组织，并于4摄氏度低温湿润状态下保存。

在步骤S2中，采用柔和摩擦和流体压力在振荡条件之下用蒸馏水清洗心包组织，去除粘附的非心包和非胶原组织，所述清洗通过渗压休克实现对心包组织有效脱细胞，且优选地，清洗持续到没有可见的粘附的非心包或非胶原组织，优选地，是于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。

在步骤S3中，清洗后的生物材料进行羟基苯丙酸修饰，使用的羟基苯丙酸摩尔浓度为1mM-1M的水溶液，这个步骤需要确保羟基苯丙酸达到接近饱和的物理渗透，从而尽可能多地引入羟基苯丙酸。

在步骤S4中，处理后的生物材料浸泡茶多酚，使用的茶多酚质量浓度为0.1％-10％，茶多酚通过氢键作用吸附于弹性蛋白纤维的疏水段，从而提高弹性蛋白的结构稳定性能。

在步骤S5中，处理后的生物材料进行辣根过氧化物酶/过氧化氢引发的酶交联，使用的辣根过氧化物酶质量浓度为0.1％-10％，使用的过氧化氢质量浓度为0.1％-10％，过氧化氢是一种氧化剂，辣根过氧化物酶在氧化剂的作用下，能够催化酚羟基实现化学交联。

在步骤S6中，进行蒸馏水清洗，这个清洗步骤将清除没有反应的茶多酚、辣根过氧化物酶以及过氧化氢。

在本实施例中，图2为羟基苯丙酸修饰心包膜和辣根过氧化物酶(HRP)/过氧化氢(H2O2)酶交联化学原理示意图。

在本实施中，新鲜采集的猪心包于4摄氏度100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时。然后浸泡在100mM羟基苯丙酸水溶液在室温当中4小时。然后采用10mM碳二亚胺和10mMN-羟基琥珀酰亚胺在室温浸泡24小时。然后采用1％表没食子儿茶素没食子酸酯浸泡24小时。然后采用5％辣根过氧化物酶和5％过氧化氢于37摄氏度150RPM转速振荡条件之下浸泡24小时。

实验例：

处理过程当中，设置了三个对照组：(1)新鲜心包膜(FP)组。(2)戊二醛(GLUT)处理组。(3)碳二亚胺(EDC)处理组。戊二醛(GLUT)处理组即将心包膜浸泡于0.25％的戊二醛当中24小时。碳二亚胺(EDC)处理组即将心包膜浸泡于10mM碳二亚胺和10mM N-羟基琥珀酰亚胺当中24小时。

如图3所示，评估时检测的实验组(HPA/EDC/EGCG)组胶原蛋白酶、弹性蛋白酶降解的重量损失百分比较小，如图4所示，不可溶弹性蛋白含量提高，如图5所示，大鼠皮下植入30天的挂钙量减少。

本发明的有益效果是：本发明提供的方法能够提升生物材料的结构稳定性及抗钙化性能，潜在地延长其使用寿命。

当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。