阅读说明：本技术 一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法 (Preparation method of acellular corneal stroma for clinical use ) 是由 王海利 张晋南 宇咏梅 唐小琪 马百双 甘良波 于 2019-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法,该方法包括去除角膜上皮层之后削切得到预定厚度的板层角膜,还包括将削切后的板层角膜密封后置于液氮中冷冻、将冷冻后的板层角膜置于水浴中解冻、将解冻后的板层角膜放入脱细胞试剂中进行振荡处理、将振荡处理后的板层角膜置于等渗液中进行超声处理、将脱细胞后的板层角膜放入软化液中静置,冷冻、解冻以及在脱细胞试剂中振荡处理有利于脱除细胞,在软化液中静置有利于角膜胶原微观结构的恢复,再放入水中振荡处理,得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。(The invention discloses a preparation method of acellular corneal stroma for clinical use, which comprises the steps of removing corneal epithelium layer, cutting to obtain lamellar cornea with preset thickness, sealing the cut lamellar cornea, freezing in liquid nitrogen, unfreezing the frozen lamellar cornea in water bath, placing the unfrozen lamellar cornea into an acellular reagent for oscillation treatment, placing the lamellar cornea after oscillation treatment in isotonic solution for ultrasonic treatment, placing the lamellar cornea after acellular treatment in a softening solution for standing, freezing, unfreezing and oscillating in the acellular reagent to facilitate the acellular treatment, the obtained acellular corneal stroma is good in transparency, the microcosmic collagen structure is close to the cornea of a human body, and the acellular corneal stroma can be directly used clinically without other treatment.)

一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种供人类临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法。

背景技术

引起角膜盲的第二大原因是角膜病，角膜病中80％的患者可通过角膜移植来避免致盲。但是受我国角膜捐献较少，导致同种异体角膜供体匮乏，人工角膜的出现给角膜病患者带来了希望。随着组织工程学的兴起，人们将焦点集中在天然的动物角膜材料。利用脱细胞的方法去除异种角膜的外源细胞及抗原物质，从而获得异种无细胞的角膜细胞外基质材料。组织工程角膜材料在临床应用须要满足三个最基本的要求，一是异种角膜细胞被脱除的彻底性，二是角膜的透明度，三是角膜的生理弧度。组织工程角膜材料移植到患者身上时，如果异种细胞脱除不彻底，将产生免疫排斥反应，导致移植效果不佳；如果脱细胞过程中对角膜微观结构破坏较大，移植后透明度恢复不好，依然影响患者视力，患者的生活并未得到改善；因此，影响角膜术后透明度的主要因素有：异种细胞脱除是否彻底，角膜是否具有其原有的胶原微观结构，以及角膜是否具有其原有的生理弧度，这些因素将决定角膜材料能否在临床上成功应用。

目前常用的脱细胞方法包括化学法、物理法和生物酶法。常规单一的化学法或者物理法脱细胞需要长时间的作用才能达到脱细胞效果，且长时间的作用又会造成角膜胶原蛋白的微观结构破坏。专利文献201510074946.7(专利名称：一种人工角膜的制备方法)利用板层刀制备板层角膜，钻取指定大小的角膜片，通过冻融、超声联合核酸内切酶降解法进行脱细胞。该方法中利用板层刀获取板层角膜，无法保证切面的平整性，从而影响移植后与植床的贴合性，导致术后透明度的恢复。专利文献201410230365.3(专利名称：一种板层角膜基质支架及其制备方法)将动物角膜依次进行低渗溶胀、反复冻融、利用DNA酶和RNA酶的缓冲体系进行酶消化处理。专利文献201610080864.8(专利名称：利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方法)将牛角膜浸泡在低渗溶液中，取出角膜上皮细胞得到包含前弹力层和比分基质层的牛角膜基质，反复冻融后再用缓冲液漂洗，放入脱细胞试剂中浸泡脱细胞，再用超纯水对牛角膜基质进行冲洗，最后放入脱水剂中浸泡、灭菌，制得牛角膜基质。以上两件专利技术均使用了低渗溶液，这种溶液致使角膜易溶胀，对角膜基质结构破坏性较大，且未对脱细胞后的角膜进行孵育软化。

发明内容

针对现有技术的缺点和局限，本发明提供一种采用物理方法和低毒性试剂，制备得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且能供临床使用的脱细胞角膜基质的方法。该方法包括：去除角膜上皮层之后削切得到预定厚度的板层角膜，还包括：

a)将削切后的角膜密封后置于液氮中冷冻；

b)将冷冻后的角膜置于水浴中解冻；

c)将解冻后的角膜放入脱细胞试剂中进行振荡处理；

d)将振荡处理后的角膜置于等渗液中进行超声处理，以脱除细胞；

e)将脱细胞后的角膜放入软化液中静置，再放入水中振荡处理；所述软化液具有促进角膜胶原微观结构恢复的作用。

在本发明非限制性的实施方式中，所述预定厚度为200-500μm，本领域技术人员也可根据后续处理要求及临床使用需求确定板层角膜的厚度。申请人经过大量试验总结认为，当厚度为200-500μm时，既便于后续处理，又使制成的角膜能够满足临床使用需求。

在本发明非限制性的实施方式中，所述密封是指将角膜置于密闭容器中加以密封，防止在冷冻过程中染菌污染。

在本发明非限制性的实施方式中，步骤a)所述冷冻是指将角膜密封后置于液氮中5-60min；本领域技术人员可以根据角膜的具体数量选择冷冻所需的具体时长，冷冻时间过短可能起不到细胞冰冻结晶，进而使细胞破碎的目的，导致细胞破碎不彻底，冷冻时间过长可能导致角膜胶原纤维损伤，进而导致角膜基本结构难以恢复，并且生产成本增加。

在本发明非限制性的实施方式中，步骤b)所述解冻是指使被冷冻的角膜解冻变为类似冷冻前状态的过程，本领域技术人员可以利用本领域常用的解冻办法对冷冻后的角膜进行解冻，例如将角膜放置常温空气中解冻。在本发明非限制性的实施方式中，优选将角膜置于水浴中进行解冻。

在本发明非限制性的实施方式中，水浴的优选温度是20-37℃，温度过高将使角膜变性，温度过低则达不到使角膜细胞有效破碎的目的。

在本发明非限制性的实施方式中，除了水浴的温度，将冷冻后的角膜置于水浴中的持续时长也将影响角膜细胞的破碎，进而影响角膜细胞的脱除，置于水浴中时间过短起不到解冻的效果，置于水浴中时间过长则会使角膜泡发，使角膜基本结构难以复原，优选将冷冻后的角膜板层置于水浴中的持续时长为10-30min。

在本发明非限制性的实施方式中，通过步骤a)使细胞被冷冻，通过步骤b)使细胞解冻，冷冻和解冻促使细胞破碎，进而有利于去除细胞。反复交替重复步骤a)和步骤b)更有利于细胞破碎和去除，但重复次数过多将使角膜基本结构受到破坏。优选交替重复步骤a)和步骤b)1-5次。

在本发明非限制性的实施方式中，先将步骤c)处理之后的角膜放入脱细胞试剂中进行振荡处理，再将角膜置于等渗液中进行超声处理。所述脱细胞试剂可以选用本领域现有技术中常用的脱细胞试剂，比如专利文献CN104001217A中公开的脱细胞试剂。所述等渗液为具有不会使角膜结构改变的渗透压参数的溶液。

在本发明非限制性的优选实施方式中，步骤c)所述脱细胞试剂优选包含0.2-1.0％(w/v)中性蛋白酶和0.01-0.20％(w/v)EDTA或其钠盐。其中，中性蛋白酶的作用是破坏细胞结构，加速细胞的裂解，EDTA的作用是结合金属离子，破坏细胞对ECM的粘附，二者一起使用时，EDTA能够促进中性蛋白酶的脱细胞效果，并且有利于保持角膜胶原纤维基本结构不被破坏。

在本发明非限制性的上述实施方式中，通过步骤c)将角膜先在脱细胞试剂中振荡处理，再通过步骤d)在等渗液中超声处理，在温和的环境中脱除细胞，能够使角膜基本结构得以保持。重复步骤c)和步骤d)更有利于细胞彻底脱除，但重复次数过多将使角膜基本结构受到破坏。优选重复步骤c)和步骤d)1-8次。

在本发明非限制性的优选实施方式中，步骤c)所述振荡处理优选为：在4-45℃的脱细胞试剂中振荡10-120min。本领域的技术人员熟知，角膜与酶的接触时间越短，越有利于其基本结构的保持，申请人经过多次试验总结认为，使角膜浸没在脱细胞液中同时进行振荡处理之后，再在等渗液中进行超声，可以有效缩短角膜与酶的接触时间，并且在达到脱掉细胞目的的同时，能够使角膜胶原纤维基本结构得以保持。

在本发明非限制性的优选实施方式中，所述等渗液为具有不会使角膜结构改变的渗透压参数的溶液。在本发明非限制性的优选实施方式中，所述等渗液优选为生理盐水或/和PBS缓冲液。

在本发明非限制性的上述实施方式中，步骤d)所述超声的频率和持续时长参数与水浴的参数具有类似的道理，超声频率过高或过低、持续时长过短或过长都会影响角膜细胞的脱除效果，所述超声的优选频率为10-100kHz，超声持续时长优选为8-15min。

在本发明非限制性的上述实施方式中，步骤e)所述软化液能够保护板层角膜在软化液中不被溶胀，促进角膜胶原结构的恢复，使角膜更加透明，提高临床应用效果。

在本发明非限制性的上述实施方式中，步骤e)所述软化液含有聚乙烯比咯烷酮。含有聚乙烯比咯烷酮的软化液能够保护板层角膜在软化液中不被溶胀，促进角膜胶原结构的恢复，使角膜更加透明，提高临床应用效果。

在本发明非限制性的优选实施方式中，所述软化液含有0.1-5％聚乙烯比咯烷酮。

在本发明非限制性的上述实施方式中，所述软化液含有聚乙烯比咯烷酮，优选还含有透明质酸、L-天冬氨酸中的一种或两种。

在本发明非限制性的优选实施方式中，所述软化液的成分优选为：含有0.1-5％聚乙烯比咯烷酮、0.1-3％透明质酸、0.1％-4％L-天冬氨酸，其余为水。含有聚乙烯比咯烷酮、透明质酸、天冬氨酸的软化液能够保护板层角膜在软化液中不被溶胀，更好的促进角膜胶原结构的恢复，使角膜更加透明，提高临床应用效果。

在本发明非限制性的优选实施方式中，步骤e)所述软化液的温度优选为2-37℃，所述静置的持续时长优选为10-60min；步骤e)所述振荡处理的持续时长优选为1-10min。在本发明非限制性的优选实施方式中，振荡处理可以重复1-5次。

在本发明非限制性的实施方式中，步骤a)所述角膜为猪角膜。但本领域技术人员熟知，本发明提供的技术方案是针对哺乳动物角膜细胞进行的处理，与哺乳动物的细胞种类并无关系，只要是哺乳动物角膜细胞即可适用于此方法进行处理，进而得到不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

与现有技术相比，本发明使用温和的中性蛋白酶和EDTA作为脱细胞试剂，有利于保持角膜的微观结构；本发明将角膜浸于脱细胞液中振荡处理之后，再在等渗液中进行超声处理，有效缩短角膜与酶的接触时间，在达到脱掉细胞目的的同时，能够使角膜胶原纤维基本结构得以保持；本发明将脱细胞后的角膜放入软化液中静置，能够有效促进角膜胶原微观结构的恢复；进而得到不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

附图说明

附图1本发明提供的能供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法流程图

附图2本发明实施例8制备得到的脱细胞角膜置于已打印黑色字母A的白纸上的照片

附图3本发明实施例10制备得到的脱细胞角膜给人体移植的术后照片

具体实施方式

下面结合附图对本发明非限制性的实施方式进一步说明。需要说明的是，下述具体实施方式仅为举例说明，不应理解为对本发明技术方案的限定。

本发明所述板层角膜是指去除角膜上皮层而获取的包括前弹力层和基质层且能够用于临床移植的角膜，如未特殊标注，本发明具体实施方式所述角膜与板层角膜含义相同；如未特殊标注，本发明具体实施方式的试验环境为满足三类医疗器械洁净度的环境；本发明具体实施方式所使用的水为注射用水；本发明具体实施方式所述脱细胞试剂成分以及软化液成分的百分比％含量单位均为质量体积比。

实施例1

本实施例示例了供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，包括去除猪角膜上皮层之后削切得到预定厚度的板层角膜，还包括：a)将削切后的角膜密封后置于液氮中冷冻；b)将冷冻后的角膜置于水浴中解冻；c)将解冻后的角膜放入脱细胞试剂中进行振荡处理；d)将振荡处理后角膜置于等渗液中进行超声处理；e)将脱细胞后的角膜放入软化液中静置，再放入水中振荡处理；得到能够直接供临床使用的脱细胞角膜基质。

本实施例未记载的试验条件及参数，本领域的技术人员均可选择本领域通常选用的参数进行实施，进而得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质，所述软化液具有促进角膜胶原微观结构恢复的作用。

本实施例使用温和的中性蛋白酶和EDTA作为脱细胞试剂，有利于保持角膜的微观结构；本发明将角膜浸于脱细胞液中振荡处理之后，再在等渗液中进行超声处理，有效缩短角膜与酶的接触时间，在达到脱掉细胞目的的同时，能够使角膜胶原纤维基本结构得以保持；本发明将脱细胞后的角膜放入软化液中静置，能够有效促进角膜胶原微观结构的恢复；进而得到不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

实施例2

本实施例示例了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，在实施1的基础上，使经过削切后获得的板层角膜的厚度为500μm。将角膜密封后置于液氮中60min；取出后先放入20℃水浴中30min，再放入4℃的含有1.0％中性蛋白酶和0.01％EDTA的水溶液中振荡120min，随后置于生理盐水中超声处理8min，超声频率为10kHz；最后先将脱细胞后的角膜放入含有5％聚乙烯比咯烷酮的2℃的软化液中静置60min，再放入水中振荡处理10min；得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

实施例3

本实施例示例了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，在实施1的基础上，使经过削切后获得的板层角膜的厚度为200μm。将角膜密封后置于液氮中5min；取出后先放入37℃水浴中10min，再放入45℃的含有0.2％中性蛋白酶和0.20％EDTA的水溶液中振荡10min，随后置于PBS缓冲液中超声处理15min，超声频率为100kHz；最后先将脱细胞后的角膜放入含有0.1％聚乙烯比咯烷酮的37℃的软化液中静置10min，再放入水中振荡处理1min；得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

实施例4

本实施例示例了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，在实施1的基础上，使经过削切后获得的板层角膜的厚度为400μm。将角膜密封后置于液氮中45min；取出后先放入26℃水浴中19min，再放入25℃的含有0.6％中性蛋白酶和0.10％EDTA的水溶液中振荡100min，随后置于任意比例的生理盐水和PBS缓冲液中超声处理11min，超声频率为60kHz；最后先将脱细胞后的角膜放入含有2.5％聚乙烯比咯烷酮的20℃的软化液中静置30min，再放入水中振荡处理5min；得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

实施例5

本实施例示例了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，在实施1的基础上，使经过削切后获得的板层角膜的厚度为250μm。将角膜密封后置于液氮中15min；取出后先放入23℃水浴中15min，交替重复冷冻和解冻5次。再放入14℃的含有0.3％中性蛋白酶和0.12％EDTA的水溶液中振荡110min，随后置于生理盐水中超声处理9min，超声频率为60kHz；交替重复振荡和超声2次；最后先将脱细胞后的角膜放入含有2％聚乙烯比咯烷酮、0.1％透明质酸、3％L-天冬氨酸的17℃的软化液中静置50min，再放入水中振荡处理3min；得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

实施例6

本实施例示例了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，在实施1的基础上，使经过削切后获得的板层角膜的厚度为450μm。将角膜密封后置于液氮中50min；取出后先放入30℃水浴中19min，交替重复冷冻和解冻2次。再放入25℃的含有0.9％中性蛋白酶和0.02％EDTA的水溶液中振荡60min，随后置于PBS缓冲液中超声处理15min，超声频率为90kHz；交替重复振荡和超声1次；最后先将脱细胞后的角膜放入含有0.5％聚乙烯比咯烷酮、3％透明质酸、0.2％L-天冬氨酸的22℃的软化液中静置30min，再放入水中振荡处理5min；重复振荡5次；得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

实施例7

本实施例示例了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，在实施1的基础上，使经过削切后获得的板层角膜的厚度为300μm。将角膜密封后置于液氮中10min；取出后先放入27℃水浴中30min，交替重复冷冻和解冻1次。再放入24℃的含有0.2％中性蛋白酶和0.01％EDTA的水溶液中振荡10min，随后置于任意比例的生理盐水和PBS缓冲液中超声处理8min，超声频率为12kHz；交替重复振荡和超声8次；最后先将脱细胞后的角膜放入含有3.5％聚乙烯比咯烷酮、1％透明质酸、4％L-天冬氨酸的15℃的软化液中静置40min，再放入水中振荡处理2min；重复振荡1次；得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

实施例8

本实施例示例了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，在实施1的基础上，使经过削切后获得的板层角膜的厚度为300μm。将角膜密封后置于液氮中5min，取出后先放入20℃水浴中30min。再放入20℃的含有0.4％中性蛋白酶和0.01％EDTA的水溶液中振荡10min，随后置于任意比例的生理盐水和PBS缓冲液中超声处理15min，超声频率为10kHz；交替重复振荡和超声7次。最后先将脱细胞后的角膜放入含有2％聚乙烯比咯烷酮、1.2％透明质酸、3％L-天冬氨酸的2℃的软化液中静置，再放入水中振荡处理5min；重复振荡1次；得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

取实施例8制备的脱细胞角膜基质置于已打印黑色字母A的白纸上进行拍照，如附图2。

实施例9

本实施例示例了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，在实施1的基础上，使经过削切后获得的板层角膜的厚度为400μm。将角膜密封后置于液氮中10min，取出后先放入24℃水浴中20min，此处交替重复冷冻和解冻5次。再放入24℃的含有0.4％中性蛋白酶和0.3％EDTA的水溶液中振荡30min，随后置于任意比例的生理盐水和PBS缓冲液中超声处理6min，超声频率为40kHz；重复脱除1次。最后先将脱细胞后的角膜放入含有0.9％聚乙烯比咯烷酮、2.8％透明质酸、3.9％L-天冬氨酸的27℃的软化液中静置，再放入水中振荡处理10min。得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

实施例10

本实施例示例了一种供临床使用的脱细胞角膜基质的制备方法，在实施1的基础上，使经过削切后获得的板层角膜的厚度为450μm。将角膜密封后置于液氮中45min，取出后先放入37℃水浴中10min，此处交替重复冷冻和解冻1次。再放入24℃的含有1.0％中性蛋白酶和0.2％EDTA的水溶液中振荡20min，随后置于任意比例的生理盐水和PBS缓冲液中超声处理15min，超声频率为12kHz。最后先将脱细胞后的角膜放入含有3.5％聚乙烯比咯烷酮、1.9％透明质酸、1％L-天冬氨酸的37℃的软化液中静置，再放入水中振荡处理1min；重复振荡3次。得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

取实施例10制备的脱细胞角膜给人体(患者)进行角膜移植作为试验组。结果试验组1个月内植片全部达到透明，在6个月的随访期内未见角膜植片溶解，且患者视力的恢复较术前有明显改善。患者术后6个月照片见附图3。

临床试验结果显示：试验组角膜基质能够直接应用于临床病患，并且在透明度、上皮化、视力恢复方面效果显著。

上述实施例1-10未记载的试验条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择本领域通常选用的参数进行试验，得到透明性好,微观胶原结构接近于人体角膜并且不需经过其他处理而直接能供临床使用的脱细胞角膜基质。

实施例11

本实施例对实施例1-10制备所得脱细胞角膜基质的在透明度、弧度状态、显微结构保持度、体外透光率进行了检测，结果件表1，其中体外透光率检测的方法采用以下方法：

取脱细胞角膜固定于紫外-可见光分光光度计的样品仓中，表面滴加1滴人工泪液，立即在560nm波长检测透光率。本领域技术人员也可根据本领域检测透光率的常规方法检测并计算出透光率。

表1在本发明非限制性的上述实施例制备所得脱细胞角膜的检测结果

实施例	透明度	弧度状态	显微结构保持度	体外透光率/％
					实施例1	与天然角膜相似	置于平面可观察到弧度	与天然角膜结构相似	71.9
实施例2	与天然角膜相似	置于平面可观察到弧度	与天然角膜结构相似	72.6
					实施例3	与天然角膜相似	置于平面可观察到弧度	与天然角膜结构相似	73.3
实施例4	与天然角膜相似	置于平面可观察到弧度	与天然角膜结构相似	74.7
					实施例5	与天然角膜相似	置于平面可观察到弧度	与天然角膜结构相似	75.4
实施例6	与天然角膜相似	置于平面可观察到弧度	与天然角膜结构相似	76.0
					实施例7	与天然角膜相似	置于平面可观察到弧度	与天然角膜结构相似	75.1
实施例8	与天然角膜相似	置于平面可观察到弧度	与天然角膜结构相似	74.9
					实施例9	与天然角膜相似	置于平面可观察到弧度	与天然角膜结构相似	73.0
实施例10	与天然角膜相似	置于平面可观察到弧度	与天然角膜结构相似	76.2

以上所述仅为本发明具体实施方式中较佳实施例，并非对本发明保护的技术方案的限定，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术方案范围内，对本发明的技术方案的发明构思进行等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。