阅读说明：本技术 一种新颖倍半萜化合物及其在制备神经保护药物中的应用 (Novel sesquiterpene compound and application thereof in preparation of neuroprotective drugs ) 是由 熊亮 周勤梅 彭成 马川 缪璐琳 于 2019-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了式(Ⅰ)所示的化合物、或其晶型、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物。本发明还提供了该化合物的制备方法及其在制备神经保护药物中的用途。试验结果表明,本发明化合物具有良好的神经保护作用,其对神经细胞的保护效果优于阳性对照药维生素E,为神经保护药物的临床筛选和/或制备提供了一种新的思路和选择。<Image he="502" wi="700" file="DDA0002311802190000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses a compound shown as a formula (I), or a crystal form, a stereoisomer, a salt, a solvate, a prodrug and a metabolite thereof. The invention also provides a preparation method of the compound and application of the compound in preparing neuroprotective drugs. The test result shows that the compound of the invention has good nerveThe protective effect on nerve cells is better than that of a positive control medicament, namely vitamin E, and a new thought and selection are provided for clinical screening and/or preparation of the neuroprotective medicament.)

一种新颖倍半萜化合物及其在制备神经保护药物中的应用

技术领域

本发明属于药物制备领域，具体涉及一种新颖倍半萜化合物及其在制备神经保护药物中的应用。

背景技术

广藿香(Pogostemon cablin)是我国传统中药，也是“十大南药”之一。广藿香以地上干燥部分入药，具有芳香化湿，和中止呕，发表解暑之功，不仅常用作为传统中药的处方药物，还是许多中成药的组成药物，如香砂养胃丸、藿香正气液、抗病毒口服液等。现代药理研究发现广藿香在调节胃肠运动、抗病原微生物、解热、抗炎等方面具有明显作用，有广泛的药理活性。

神经退行性疾病(neurodegenerative disease,NDD)包括阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)、帕金森病(Parkinson's disease,PD)、亨廷顿舞蹈症(Huntington's disease,HD)、肌肉萎缩性侧索硬化症等，是一类以神经元缺失为主要特征的退行性疾病，具有不可逆性和进行性加重两大特征，严重威胁老年人健康。针对此类疾病的药物亟需开发，从中药中寻找不良反应少、具有显著中枢抗炎作用及神经保护作用的药物是此类疾病治疗的研究热点。因此，从广藿香药材中分离提取出神经保护作用的新化合物并且以此为基础进行衍生，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新颖倍半萜化合物及其在制备神经保护药物中的应用。

本发明提供了式(Ⅰ)所示的化合物、或其晶型、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物：

其中，R₁～R₁₆分别独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C₁～C₆的烷基或C₁～C₆的烷氧基。

进一步地，R₁₅选自羟基或C₁～C₆的烷氧基。

进一步地，R₂～R₈均为氢。

进一步地，所述化合物如式(Ⅱ)所示：

其中，R₁、R₉、R₁₀、R₁₆分别独立地选自C₁～C₄的烷基。

进一步地，所述化合物如式Ⅲ所示：

进一步地，所述化合物的晶型属于正交晶系，空间群为P2₁2₁2₁，所述晶型的晶胞参数为：

α＝90°,β＝90°,γ＝90°。

本发明还提供了一种制备上述化合物、或其晶型、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物的方法，所述方法包括以下步骤：

a、取广藿香药材，水蒸气蒸馏提取，冷凝除水后得到挥发油；

b、取步骤a所得挥发油，经正相硅胶柱色谱，以石油醚:乙酸乙酯＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、3:1、0:100为洗脱剂进行梯度洗脱，取石油醚:乙酸乙酯＝10:1洗脱所得组分F₂₈；

c、取步骤b所得组分F₂₈上反相中压柱色谱，以甲醇:水＝50:50、65:35、80:20、90:10、100:0为洗脱剂进行梯度洗脱，取甲醇:水＝80:20洗脱所得组分F_28-3；

d、取步骤c所得组分F_28-3通过LH-20凝胶柱色谱，以石油醚:三氯甲烷:甲醇＝5:5:1为洗脱剂进行洗脱，取洗脱出液体的第47％～66％体积的部分，命名为组分F_28-3-2；

e、取步骤d所得组分F_28-3-2通过LH-20凝胶柱色谱，以甲醇:水＝80:20为洗脱剂进行纯化后，依次经制备薄层色谱纯化，正相液相制备色谱纯化后，即得上述式III所示化合物。

进一步地，步骤a中，所述水蒸气蒸馏提取的时间为16～20h，所述除水的方式为用无水硫酸钠干燥；

步骤b中，所述梯度洗脱的条件如下：

步骤c中，所述梯度洗脱的条件如下：

步骤d中，所述组分F_28-3与洗脱剂的质量体积比为2.6：950g/mL；

步骤e中，所述制备薄层色谱的展开剂为正己烷：乙酸乙酯＝5:1，所述正相液相制备色谱的洗脱剂为正己烷：异丙醇＝250:1。

本发明还提供了上述的化合物、或其晶型、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备神经保护药物中的用途。

进一步地，所述神经保护药物为预防和/或治疗神经退行性疾病的药物，所述神经退行性疾病优选为阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、肌肉萎缩性侧索硬化症。

本发明还提供了一种神经保护药物，它是以上述的化合物、或其晶型、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明中：

所述C₁～C₄的烷基是指C₁、C₂、C₃、C₄的烷基，即具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基等等。

同理，所述C₁～C₆的烷基是指C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆的烷基，即具有1～6个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基等等。

本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试剂结合使用。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。

试验结果表明，本发明提供了一种结构新颖的化合物及其晶型。本发明提供的化合物具有良好的神经保护作用，其对神经细胞的保护效果优于阳性对照药维生素E，其在制备神经保护药物中具有很好的应用前景。本发明为临床上筛选和/或制备神经保护药物提供了一种新选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明目标化合物的HRESIMS图。

图2为本发明目标化合物的¹H-NMR图。

图3为本发明目标化合物的¹³C-NMR图。

图4为本发明目标化合物的晶体结构。

图5为化合物对SH-SY5Y神经细胞的保护作用图：其中，Control指空白对照组，Model指模型组，Vitamin E指维生素E组，1指本发明目标化合物组；##表示与空白对照组相比P<0.05，**表示与模型组相比P<0.05。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。实施例1本发明化合物的制备

(1)实验材料：

①药材

广藿香于2012年11月自采于广东阳春，经成都中医药大学龙飞教授鉴定为唇形科植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的全草。

②填料

制备薄层色谱中填料为GF₂₅₄硅胶制备薄层板(烟台江友硅胶开发有限公司)，

Sephadex LH-20凝胶柱色谱中填料为Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(瑞典AmershamPharmacia公司)，

正相硅胶柱色谱中填料为柱层析硅胶，200–300目，试剂级(青岛海洋硅胶干燥剂厂)，

正相液相制备色谱采用的是Kromasil(250×10mm²)制备柱，以硅胶(5μm)填装(瑞典Akzo Nobel公司)，

反相中压液相色谱中的填料为Rp C₁₈，40～60μm，Welch公司生产。

(2)成分的分离纯化：

①、干燥广藿香的干燥地上部分40kg，粉碎，用Clevenger水蒸气蒸馏装置提取16～20h，用无水硫酸钠除水后，得到广藿香挥发油(215g)。

②、将广藿香挥发油经正相硅胶柱色谱，石油醚:乙酸乙酯(100:0-0:100)梯度洗脱(洗脱条件见表1)，根据薄层色谱检视，合并相似组分得到F₁–F₃₁。取其中F₂₈组分(石油醚:乙酸乙酯＝10:1洗脱所得)经反相中压液相色谱，以甲醇:水50:50、65:35、80:20、90:10、100:0为洗脱剂进行梯度洗脱(洗脱条件见表2)，根据薄层色谱法合并相似组分，回收溶剂，得到6个亚组分F_28-1–F_28-6。取组分F_28-3(甲醇:水＝80:20洗脱所得，2.6g)上Sephadex LH-20凝胶柱色谱，经混合液体(石油醚：三氯甲烷：甲醇＝5:5:1)洗脱分离，洗脱剂体积为950ml，根据薄层色谱法合并相似组分，回收溶剂后得到四个组分F_28-3-1－F_28-3-4，取组分F_28-3-2(其为洗脱出液体的第450-630ml部分)，组分F_28-3-2在薄层色谱(展开剂比例为石油醚:乙酸乙酯＝5:1)展开中，以10％硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃加热显淡黄色的点。

③、取组分F_28-3-2，通过Sephadex LH-20凝胶柱色谱，以甲醇:水＝80:20洗脱纯化，经制备薄层色谱(GF₂₅₄硅胶制备薄层，展开剂为正己烷：乙酸乙酯＝5:1)后，再通过正相液相制备色谱(Kromasil色谱柱，洗脱剂为正己烷：异丙醇＝250:1，保留时间t_R＝56min)分离，纯化，即得目标化合物。

表1硅胶柱色谱的洗脱条件

表2中压色谱的洗脱条件

(3)目标化合物的鉴定：

目标化合物为无色针状晶体(甲醇)；无暗斑，碘显黄色，喷10％硫酸乙醇溶液在105℃下显黄绿色；由HRESIMS m/z 291.1565[M+Na]⁺可确定分子式为C₁₅H₂₄O₄(HRESIMS结果见图1)。

红外光谱中可以看出具有明显的羟基信号(3334cm^-1)和羰基信号(1718cm^-1)。

核磁共振氢谱(¹H-NMR)：Varian-DD2-500spectrometer核磁共振仪(美国瓦里安医疗系统公司)，数据见图2、表3。

核磁共振碳谱(¹³C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见图3、表3。

目标化合物为无色晶体；旋光：[α]²⁵ _D-218.7(c 0.20,MeOH)；HRESIMS给出准分子离子峰m/z 291.1565[M+Na]⁺，(图1)，提示其分子组成为C₁₅H₂₄O₄(calcd for C₁₅H₂₄O₄Na,291.1572)，具有4个不饱和度。化合物的¹H NMR谱(图2)显示有4个单峰甲基(δ_H 1.34s,δ_H1.16s,δ_H 1.05s,δ_H 0.91s)，¹³C NMR和DEPT谱显示有15个碳信号，包括4个甲基、5个亚甲基、1个次甲基和5个季碳(含1个酮羰基δ_C 207.9，2个连氧季碳δ_C 101.2,δ_C 90.7)(表3)，结合以上信息和不饱和度可以确定该化合物为三环倍半萜，且含有一个酮羰基和半缩酮/缩酮部分。

目标化合物的¹H-¹H COSY谱显示H-9/H-10、H₂-4/H-5/H₂-6/H₂-7的相关信号，揭示出连续的质子偶合片段。HMBC谱中，H₃-14和H₃-15与C-1、C-5,C-8一个C-1–C-8–C-5桥，表明C-8位连有两个甲基基团，H₃-13与C-1,C-2(δ_C 90.7),C-7,和C-8相关，H₂-4与C-2,C-3(δ_C207.9),C-5,C-6相关，证实了双环[3.2.1]辛烷环系统。进一步通过2D NMR数据分析，确定取代基的位置。

在NOESY谱中，H₃-14与H-4a，H-5，H₂-9和H₃-13的相关；H₃-13与H₂-9和OH-11相关；H₃-12与H-4b相关，明确了化合物的相对立体化学。最后，采用X-射线单晶衍射分析(Cu Kα辐射)确定化合物的绝对结构为1R,2S,5R,11R[Flack参数＝0.02(12)]，如式(III)所示，并命名为百秋李过氧A。

表3化合物的¹H-(500MHz)和¹³C-(150MHz)NMR数据

(测定溶剂：Me₂CO-d₆；δ：ppm；J：Hz)

(4)X-射线单晶衍射分析：采用Bruker APEX DUO单晶衍射仪测定，经X-射线单晶衍射测定的晶体结构如图4所示，具体数据如下：

分子式：C₁₅H₂₄O₄,M＝536.68,orthorhombic,P2₁2₁2₁,

α＝90°,β＝90°,γ＝90°,

T＝292(2)K,Z＝4,μ(Cu Kα)＝0.724mm^-1,15752reflections measured,5549independent reflections(R_int＝0.0443).The final R₁values were 0.0514(I>2σ(I)).The final wR(F²)valueswere 0.1362(I>2σ(I)).The final R₁values were 0.0530(all data).The final wR(F²)values were 0.1396(all data).The goodness of fit on F²was 1.041.Flackparameter＝0.02(12).CCDC number:1517093.

为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。

试验例1神经保护细胞试验

(1)实验材料：

①药物

受试化合物(本发明实施例1制得的目标化合物)用DMSO配置成50μmol/mL的贮备液，-10℃保存；阳性药物(维生素E)用细胞培养液配置；神经细胞损伤造模药物：Aβ_1-42冻干粉。

②细胞

SH-SY5Y细胞株购自江苏凯基生物细胞库。

③试剂

维生素E(华中海威(北京)基因科技有限公司)

DMEM高糖培养基(Gibco公司,批号1812193)

胎牛血清(四季青公司,20150511)

(2)实验方法：

a.造模药物的前处理：取冻存于-20℃、规格为1mg的Aβ_1-42冻干粉及六氟异丙醇(HFIP)置于冰上预冷，向Aβ_1-42冻干粉试剂瓶中注入222μL的六氟异丙醇，密封，涡旋混匀后，室温下静止60min，直到液体澄清，得到Aβ-HFIP溶液(1mM)。取4支无菌的1.5mL的EP管，每支分装55μL Aβ-HFIP溶液。使用真空冷冻干燥仪挥干HFIP，得到无色透明的Aβ_1-42肽膜，置于-20℃冰箱保存。临用前，取一支分装管，向肽膜内加入11μL的DMSO，水浴超声(功率300W，频率35Hz)处理10min，得到Aβ-DMSO溶液(5mM)。向Aβ-DMSO溶液中加入预冷的539μL的PBS溶液(100μM)，涡旋混匀。将上述得到的溶液置于4℃冰箱内孵育1d，使用高速冷冻离心机于4℃、13000rpm离心10分钟，去除Aβ纤维和杂质。为了进一步促使寡聚体的形成，将上述溶液置于4℃，孵育1周，得到浓度为100μM造模药母液。

b.模型组造模方法：将SH-SY5Y细胞接种于DMEM培养液中，37℃、5％CO₂培养至对数生长期，取出离心。接种SH-SY5Y细胞于96孔板中，其中每孔1×10 ⁵个细胞，DMEM含有10％胎牛血清(v/v)(100μL)，取造模药母液，用不含血清的DMEM培养基稀释到25μM，处理细胞4小时。

c.实验组实验方法：通过MTT方法在SH-SY5Y细胞上测定受试化合物的神经保护作用。具体步骤如下：SH-SY5Y细胞接种于DMEM培养液中，37℃、5％CO₂培养至对数生长期，取出离心。接种SH-SY5Y细胞于96孔板中，其中每孔1×10 ⁵个细胞，DMEM含有10％胎牛血清(v/v)(100μL)。将SH-SY5Y细胞与受试化合物一起预孵育，最终浓度为3.125,6.25,12.5,25和50μM，共24小时，然后分别用25μM造模药母液处理4小时。培养期后，向各孔中加入20μLMTT(5mg/mL)，培养4小时。以维生素E用作阳性对照。

d.数据处理：使用酶标仪在490nm处测量吸光度。每个测定重复四次。细胞活力(％)计算为OD(样品)/OD(正常)×100％。

(3)实验结果和评价：

结果如图5所示。可以看出，模型组用25μM造模药母液造模时细胞的存活率为62.62±1.59％，与空白组相比显著降低，说明造模成功。

而本发明目标化合物共培养后SH-SY5Y细胞的存活率显著高于模型组，说明本发明目标化合物对SH-SY5Y细胞具有显著的保护作用，且保护作用随着化合物浓度的增加而加强。进一步计算在不同浓度化合物共培养下SH-SY5Y细胞的存活率，发现本发明目标化合物在25μM和50μM时，SH-SY5Y细胞的存活率分别为85.13±5.48％(25μM)和89.92±4.19％(50μM)，而相同浓度阳性药物(维生素E)作用下，SH-SY5Y细胞的存活率分别为73.47±2.00％(25μM)和76.75±2.43％(50μM)，计算发现本发明目标化合物给药组与阳性对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，说明本发明目标化合物对SH-SY5Y细胞的保护作用显著优于阳性药物。

综上，本发明公开了式(Ⅰ)所示的化合物、或其晶型、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物。本发明还提供了该化合物的制备方法及其在制备神经保护药物中的用途。试验结果表明，本发明提供的化合物具有良好的神经保护作用，其对神经细胞的保护效果优于阳性对照药维生素E，为临床上筛选和/或制备神经保护药物提供了一种新的选择。