阅读说明：本技术 一种3′,5′-环化腺苷酸盐的制备方法 (Preparation method of 3',5' -cyclic adenylate ) 是由 张国全 许怡学 赵琛 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：一种3’,5’-环化腺苷酸盐的制备方法,包括以下步骤：3’,5’-环化腺苷酸与水配成3’,5’-环化腺苷酸混悬液,在搅拌的条件下加入强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物,调节pH值；过滤,取清液,加入活性炭,搅拌；脱碳,除菌过滤,除去不溶物,得反应液；从反应液中析晶,收集析出的湿晶,干燥,粉碎,过筛,混合,即成。本发明方法操作简单,所得3’,5’-环化腺苷酸盐产品,尤其是3’,5’-环化腺苷酸钙、3’,5’-环化腺苷酸钠,其金属离子含量适中,纯度高、收率高。(A method of preparing a 3',5' -cyclic adenylate salt comprising the steps of: preparing 3',5' -cyclic adenylic acid and water into 3',5' -cyclic adenylic acid suspension, adding strong base or strong base weak acid salt or metal oxide under stirring, and adjusting pH value; filtering, collecting clear liquid, adding active carbon, and stirring; decarbonizing, sterilizing and filtering, and removing insoluble substances to obtain reaction liquid; crystallizing from the reaction solution, collecting the wet crystal, drying, pulverizing, sieving, and mixing. The method is simple to operate, and the obtained 3',5' -cyclic adenylate products, particularly 3',5' -cyclic calcium adenylate and 3',5' -cyclic sodium adenylate, have moderate metal ion content, high purity and high yield.)

一种3′,5′-环化腺苷酸盐的制备方法

技术领域

本发明涉及一种化学药品生产方法，具体涉及一种化学药品环化腺苷酸盐的制备方法。

背景技术

3’,5’-环化腺苷酸钙、3’,5’-环化腺苷酸钠是两种重要的3’,5’-环化腺苷酸金属盐，其不仅含有3’,5’-环化腺苷酸，还含有二种重要的碱金属：钙、钠，具有多种生理功能，详细信息如下：

中文名称：3′,5′-环化腺苷酸钙

分子量：348.21

分子式：C₁₀H₁₁N₅O₆P·1/2Ca

结构式：

表1. 3’,5’-环化腺苷酸钙中钙元素含量的理论值

元素名称	数量	分子量	各元素的总量	比例(％)
					C	10	12	120	34.48
H	11	1	11	3.16
					N	5	14	70	20.11
Ca	0.5	40	20	5.75
					O	6	16	96	27.59
P	1	31	31	8.91
					合计	-	-	348	-

中文名称：3′,5′-环化腺苷酸钠

分子量：351.21

分子式：C₁₀H₁₁N₅O₆P·Na

结构式：

表2. 3’,5’-环化腺苷酸钠中钠元素含量的理论值

元素名称	数量	分子量	各元素的总量	比例(％)
					C	10	12	120	34.19
H	11	1	11	3.13
					N	5	14	70	19.94
Na	1	23	23	6.55
					O	6	16	96	27.35
P	1	31	31	8.83
					合计	-	-	351	-

心脏的电生理和机械活动均受细胞内3’,5’-环化腺苷酸水平的影响，这一作用主要是通过改变细胞内钙离子浓度来实现的。当细胞内Ca²⁺浓度升高到微克分子水平以上时，反馈抑制腺苷环化酶，并活化环核苷酸磷酸二酯酶，开始分解3’,5’-环化腺苷酸。与此同时，通过Na⁺/Ca²⁺交换机制，及肌浆网膜活化的钙泵，使胞浆中Ca²⁺浓度下降。因此，3’,5’-环化腺苷酸的代谢过程，实质上也就是信号消长的动态过程。因此，3’,5’--环化腺苷酸钙不仅本身做为细胞第二信使，直接发挥药理作用，而且还通过另一种更为广泛的胞内信使Ca^{2 +}，活化并调节细胞内众多的生理功能。故在临床上应当重视3’,5’-环化腺苷酸钙中钙离子的含量。

宋培英在2011年4月的《内蒙古中医药》的文章《浅谈合理补钙》中提到，钙过量还会引起机体一系列的不良反应，如：肾脏钙盐沉着还出现尿频，血尿，尿结石以及***反复感染，甚至出现肾衰。

刘为义等人在2006年第18卷第4期《海峡药学》的《氯化钠注射液不良反应的监查分析》一文中报道了儿童、老年与特异体质患者可因过量过速输入发生一过性钠离子过量导致的不良反应，而且作者还认为可能与配伍用的抗生素钠盐、培他啶氯化钠等药物钠盐累加更易发生上述反应。

由于3’,5’-环化腺苷酸(英文简称cAMP)的成本较高，为使3’,5’-环化腺苷酸充分成盐，通常较为经济的作法是使强碱或强碱弱酸盐用量稍稍过量。但若过量部分的金属离子无法通过过滤的方式或加有机溶剂萃取或通过加酸回调反应液的pH值后，再加入有机溶剂萃取的方式除去，则金属离子的杂质盐与3’,5’-环化腺苷酸金属盐极有可能共沉淀。

目前，虽然3’,5’-环化腺苷酸钙、3’,5’-环化腺苷酸钠的制备方法已有报道，但迄今为止，关于3’,5’-环化腺苷酸钙、3’,5’-环化腺苷酸钠中所含的钙、钠离子的含量限度问题，以及在制备过程中，如何进行有效的控制，尚无公开报道。

霍婷等人在2015年第2期总第35卷《中国生化药物杂志》的《二丁酰3’,5’-环化腺苷酸钠的制备及其含量和相关物质的测定》一文中报道，采用3’,5’-环化腺苷酸中滴加氢氧化钠水溶液，用HCl溶液调pH值至7～8，用无水乙醇析出晶体的方法制备3’,5’-环化腺苷酸钠。

CN106589031A公开了一种二丁酰3’,5’-环化腺苷酸钠的制备方法，该方法采用向3’,5’-环化腺苷酸中滴加氢氧化钠水溶液，用HCl溶液调pH值至7～12，优选为8，用无水乙醇析出晶体的方法制备3’,5’-环化腺苷酸钠。

以上两种方法，为使3’,5’-环化腺苷酸充分成盐，加入了过量的NaOH，需要使用HCl溶液将反应溶液的pH值回调，反应液中会生成过量的NaCl。由于NaCl微溶于有机溶剂，故NaCl极有可能包埋于3’,5’-环化腺苷酸钠结晶内，与3’,5’-环化腺苷酸钠形成共沉淀现象，使3’,5’-环化腺苷酸钠中的钠离子超限。

CN106336439B公开了一种二丁酰环磷酸腺苷钙的制备方法，该方法采用环磷酸腺苷与氢氧化钙按摩尔比为1:1～1.2加入水中，使用乙醇析出晶体的方法制备3’,5’-环化腺苷酸钙。但由于氢氧化钙微溶于水，并在乙醇中难溶，溶解于水中的饱和氢氧化钙会在乙醇中全部析出，与3’,5’-环化腺苷酸钙形成共沉淀，导致该方法制备的3’,5’-环化腺苷酸钙中Ca²⁺离子超限。

CN102250179B公开了环磷腺苷盐的化合物实体及其用途，其中采用环磷腺苷与金属的氧化物或氢氧化物或其金属盐或有机碱按反应摩尔比反应的方法，制备环磷腺苷的盐的水合物。该方法按反应摩尔比确定反应物的用量，由于3’,5’-环化腺苷酸微溶于水，部分金属盐的溶解度也较低，易造成反应不完全，使得3’,5’-环化腺苷酸盐中的金属离子含量偏低，或产物纯度低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种3’,5’-环化腺苷酸盐的制备方法。本发明方法操作简单，所得3’,5’-环化腺苷酸盐，尤其是3’,5’-环化腺苷酸钙、3’,5’-环化腺苷酸钠，其金属离子含量适中，产品纯度高、收率高。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种3’,5’-环化腺苷酸盐的制备方法，包括以下步骤：

(1)将3′,5′-环化腺苷酸与水配成3′,5′-环化腺苷酸混悬液，在搅拌的条件下加入强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物，调节pH值；

(2)过滤，取清液，加入活性炭，搅拌；

(3)脱碳，除菌过滤，除去不溶物，得反应液；

(4)从反应液中析晶，固液分离，收集析出的湿晶；

(5)干燥，粉碎，过筛，混合，即成；

步骤(1)和步骤(4)中，所述调节pH值和析晶、固液分离采用如下方法：

方法A.

调节pH值：加强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物，直至pH值为6.0～7.0，优选6.5～6.9；

析晶、固液分离：采用蒸发溶剂、溶媒结晶或蒸发溶剂与溶媒结晶结合的方法；所述溶媒结晶采用有机溶剂；所述有机溶剂优选甲醇、四氢呋喃、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、异丁醇、***、石油醚中的一种或多种；醇类、酮类溶剂与醚类溶剂组合使用时，优选醇类、酮类溶剂的使用量占整个溶剂的使用量的1/5以上；醚类溶剂优选为与醇类、酮类酮溶剂组合使用；

或方法B.

调节pH值：加强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物，直至pH值为7.0以上，优选7.1～7.5；

析晶、固液分离：采用溶媒结晶或蒸发溶剂与溶媒结晶结合的方法；所述溶媒结晶采用有机溶剂，所述有机溶剂优选甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、异丁醇中的一种或多种；

或方法C.

调节pH值：加强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物，直至pH值为7.0以上，优选7.1～7.5；

析晶、固液分离：采用溶媒结晶或蒸发溶剂与溶媒结晶结合的方法；所述溶媒结晶采用有机溶剂，所述有机溶剂优选丙酮；

或方法D

调节pH值：加入强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物，至pH值为7.1以上，加入酸液，调pH值为6.0～7.0，优选6.5～6.9；

析晶、固液分离：采用溶媒结晶或蒸发溶剂与溶媒结晶结合的方法；所述溶媒结晶采用有机溶剂，所述有机溶剂优选甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、异丁醇中的一种或多种。

优选的，步骤(1)中，所述3′,5′-环化腺苷酸的纯度为98.5％以上，更优选99.5％以上。

优选的，步骤(1)中，所述水的温度为10℃～100℃，更优选40℃～60℃。

优选的，步骤(1)中，所述3′,5′-环化腺苷酸混悬液的质量百分浓度为5％～40％，更优选10％～20％。

优选的，步骤(1)中，所述强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物的纯度为98.0％以上，更优选99.0％以上。

优选的，步骤(1)中，方法D调节pH值使用的酸液为盐酸或硝酸；所述酸液的浓度，为1～6mol/L，更优选2～3mol/L。

优选的，步骤(1)中，加入强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物或酸液调节pH值时，每次加入后先搅拌5min以上，更优选10min～40min，进一步优选20min～30min，并测试pH值。3’,5’-环化腺苷酸微溶于水，部分强碱、强碱弱酸盐也不易溶于水，因此需要搅拌使反应物充分反应。

优选的，步骤(2)中，所述活性炭的加入量为清液总量的0.1wt％～1wt％(wt％表示质量百分数)，更优选为清液总量的0.3wt％～0.5wt％。

优选的，步骤(2)中，加入活性炭后搅拌的时间大于10min，更优选20min～30min。

优选的，步骤(3)中，所述除菌过滤采用孔径为0.22um～0.45um的过滤膜。

优选的，步骤(4)中，方法A蒸发溶剂的方法为减压浓缩、喷雾干燥或冷冻干燥；减压浓缩的步骤更优选为：取反应液，置于60℃～100℃水浴中，进一步优选90～95℃；减压浓缩至水分基本挥干后，析出的沉淀即为湿晶。

优选的，步骤(4)中，方法A或B或C或D，溶媒结晶的步骤为：将反应液冷却至室温，分次或一次性加入有机溶剂，反复振摇或充分搅拌，此时有大量白色晶体析出，再置于室温以下，更优选10℃以下，放置5min以上，更优选30min～2h，过滤，洗涤所得沉淀，即得湿晶；所述洗涤的次数大于一次，优选2～3次；溶媒结晶的有机溶剂的用量为反应液的1～40倍，更优选3～4倍。

优选的，步骤(4)中，方法A或B或C或D，蒸发溶剂与溶媒结晶结合的步骤为：取反应液，置于60℃～100℃水浴中，更优选90～95℃，减压浓缩至浓缩液的体积为原反应液体积的1/4～1/5时，移出浓缩液；用水或有机溶剂洗涤浓缩器的内壁，将浓缩器的内壁的物料残留清洗下来，得洗涤液；合并浓缩液与洗涤液，得合并液，加入有机溶剂，反复振摇或充分搅拌，有沉淀析出，过滤，洗涤所得沉淀，即得湿晶；所述洗涤的次数大于一次，更优选2～3次；向合并液中加入的有机溶剂的用量，为合并液的1～40倍，更优选3～4倍。

优选的，步骤(5)中，所述干燥的温度为40℃～130℃，干燥的时间为2h～20h，干燥在常压或减压条件下进行；干燥的次数≥2次。

优选的，步骤(5)中，所述过筛选用80目～120目的筛网；所述混合的时间为10min以上，更优选20min～30min。

优选的，步骤(5)中，干燥，粉碎，过筛后进行再干燥，再干燥的温度为40℃～130℃，再干燥的时间为2h～20h，再干燥在常压或减压条件下进行。

优选的，步骤(1)中，所述强碱或强碱弱酸盐为钠的碱或盐，加入混悬液中时的添加方式为固体加入或配成碱液加入，更优选配成浓度为1～6mol/L的碱液加入，进一步优选配成2～3mol/L的碱液加入。

优选的，步骤(1)中，所述强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物为钙的碱或盐或金属氧化物，加入混悬液中时的的添加方式为固体加入。

优选的，步骤(1)、(4)中，所述强碱弱酸盐为碳酸氢钠；调节pH值和析晶、固液分离采用方法A。

优选的，步骤(1)、(4)中，所述强碱弱酸盐为碳酸钠，调节pH值和析晶、固液分离采用方法A或方法B。

优选的，步骤(1)、(4)中，所述强碱为氢氧化钠，调节pH值和析晶、固液分离采用方法A或方法C。

优选的，步骤(1)、(4)中，所述强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物为氢氧化钙或碳酸氢钙或碳酸氢钙或氧化钙，调节pH值和析晶、固液分离采用方法A或方法D。

正确地选择酸性、碱性pH值调节剂，合理地控制反应液的pH值以及正确地选择有机溶剂，是实现本发明的关键。

控制产物中金属离子含量要求的生产精度较高，考虑到实际生产中原料可能有纯度不一致或吸潮的问题，本发明者选择通过调节成盐的溶液pH值来判断投料比是否合适。实际生产中，固定投料比难以获得稳定的产品，所得3’,5’-环化腺苷酸的成品中金属离子的含量往往偏高或偏低。

由于3’,5’-环化腺苷酸呈酸性，故选择的金属离子为钙、钠离子的盐应能与3’,5’-环化腺苷酸生成易溶于水的3’,5’-环化腺苷酸钠、3’,5’-环化腺苷酸钙，首先应排除在水溶液中不与3’,5’-环化腺苷酸成盐的金属离子为钙、钠离子的盐(见表3)，以及虽能与3’,5’-环化腺苷酸成盐，但成盐后，反应液的pH值偏酸性的金属离子为钙、钠离子的有机酸盐(见表4)。

表3.在水溶液中不与3’,5’-环化腺苷酸成盐的阳离子为钙、钠离子的强碱或强碱弱酸盐名称明细

表4.在水溶液中虽能与3’,5’-环化腺苷酸成盐，但反应液的pH值偏酸性的阳离子为钙、钠离子的部分有机酸盐名称明细

对部分金属离子为钠离子的固体碱在95％乙醇、95％丙酮中的溶解情况研究结果如表5、表6、表7所示：

表5. 8％碳酸氢钠水溶液、碳酸氢钠固体在95％乙醇中的溶解情况

根据表5的结果，说明碳酸氢钠在95％的乙醇、95％的丙酮中均不溶。

表6. 5％碳酸钠水溶液、固体碳酸钠在95％乙醇、95％丙酮中的溶解情况

根据表6的结果，尽管固体碳酸钠在95％乙醇、95％丙酮中均不溶，但5％的碳酸钠水溶液在95％乙醇、95％丙酮中均易溶。因此在反应中，即便加入过量，也可使用乙醇、丙酮作为溶剂除去，采用碳酸钠为反应物时，可加至反应液的pH值为7.0以上。

表7. 10％NaOH水溶液、NaOH固体在95％乙醇、95％丙酮中的溶解情况

根据表7的结果，说明10％的氢氧化钠水溶液在一定比例的95％乙醇中溶解，随着乙醇量的增大，溶解度反而降低；氢氧化钠水溶液在95％的丙酮中易溶。而氢氧化钠固体，在95％乙醇、95％的丙酮中均不溶。因此，若采用乙醇溶剂析晶时，易与3’,5’-环化腺苷酸钠盐形成共沉淀。另外，考虑到氢氧化钠在丙酮中易溶，为除去过量的氢氧化钠，优选丙酮作为溶剂。

需要注意的是，10％的氢氧化钠丙酮溶液放置一天后，溶液呈淡黄色。是因为在温度较高及延长反应时间的情况下，氢氧化钠易使丙酮生成缩酮，致使丙酮的颜色变黄。因此，当碱为氢氧化钠溶剂为丙酮时，应尽可能降低析晶温度、缩短析晶时间。

当选用易溶于水的金属离子为钠离子的强碱或强碱弱酸盐(如：碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠)若用酸(HCl、HNO₃)中和反应液中过量的前述的碱(pH值7.0以上)，则会生成在乙醇、丙酮等有机溶剂中均不溶或难溶的氯化钠、硝酸钠，极易与3’,5’-环化腺苷酸钠盐形成共沉淀，导致钠离子超标。因此，这一类碱，过量加入后，不得再用酸液回调反应液的方法制备3’,5’-环化腺苷酸钠盐。

根据相关文献，我们将碳酸氢钙、氢氧化钙、碳酸钙在水中的溶解情况汇总如下：

根据严西平等人在2019年第1期《中学化学教学参考》的《氢氧化钙溶解度随温度变化的实验探索》一文的数据，在25℃时100g水中溶解0.16g氢氧化钙，故氢氧化钙在水中微溶。

根据张毅凡在2017年第257期《文理导航》的《普适计算：碳酸氢钙饱和溶解度》一文的数据，100g水中能够溶解0.116g碳酸氢钙，故碳酸氢钙在水中微溶。

根据李永新在1999年第22卷1期的《安徽师范大学学报(自然科学版)》的《作图法求算碳酸钙水溶液的溶解度及pH值》一文的数据，碳酸钙在水中的溶解度为：9.3×10^-5mol/L，相当于9.3×10^-4g/100ml，故碳酸钙几乎不溶或难溶于水。

另据本发明者的试验，将碳酸氢钙、氢氧化钙在室温条件下，在95％乙醇中的溶解情况列表如下(表8)：

表8.室温条件下碳酸氢钙、氢氧化钙在95％乙醇中的溶解情况

可见以碳酸氢钙或氢氧化钙为钙源，以水或乙醇为溶剂，若加入的氢氧化钙量过量，则过量的氢氧化钙、碳酸氢钙会与3’,5’-环化腺苷酸钙形成共沉淀，导致3’,5’-环化腺苷酸中钙离子含量限度超标；若加入的氢氧化钙量不足，则与3’,5’-环化腺苷酸不能完全成盐。

另据本发明者的试验，氯化钙在95％乙醇、95％丙酮中的溶解情况研究结果如表9所示：

表9.氯化钙在95％乙醇、95％丙酮中的溶解度

项目	固体	固体	水溶液	水溶液
					名称	CaCl<sub>2</sub>	CaCl<sub>2</sub>	CaCl<sub>2</sub>	CaCl<sub>2</sub>
称样量(g)	0.1	0.1	0.1	0.1
					加水(ml)	-	-	1	1
所加的溶剂名称	95％乙醇	95％丙酮	95％乙醇	95％丙酮
					加溶剂体积(ml)	1	1	1	1
是否溶解	是	否	是	是

对于微溶于水的金属离子为钙离子的强碱或强碱弱酸盐(例如：氢氧化钙、氧化钙、碳酸氢钙)。这类碱在水中溶解困难，但若用酸(HCl、HNO₃)中和上述的成盐溶液中过量的碱(成盐溶液的pH值为7.0以上)，则可生成在乙醇、丙酮等有机溶剂中均易溶的CaCl₂、Ca(NO₃)₂。因此，为确保反应液中这类碱不过量，成盐溶液还需用酸液，中和成盐溶液中过量的碱，此时应控此成盐溶液的pH值为6.0～7.0，优选为6.5～6.9。再滤除不溶物后，加入乙醇、丙酮等有机溶剂萃取，即可除去CaCl₂、Ca(NO₃)₂杂质。

对于几乎不溶或难溶于水的金属离子为钙离子的强碱或强碱弱酸盐(如：碳酸钙)。在室温下，CaCO₃在水溶液中存在难溶电解质的电离平衡(20℃溶度积K_sp,CaCO₃＝8.7×10^-9；溶解度为0.00093g/100ml)，因此，若反应液中H⁺离子浓度高(指大部分的3’,5’-环化腺苷酸未成盐)，CaCO₃水解为OH^-的水解速度较快，与3’,5’-环化腺苷酸成盐速度也快。随着反应液中H⁺离子浓度的降低(即反应液中大部分的3’,5’-环化腺苷酸已成钠盐)，此时，CaCO₃水解为OH^-的速度明显下降。但cAMP在水中的溶解度仍远大于CaCO₃(25℃时，cAMP在水中的溶解度为0.4g/100ml)，因此，溶液中H⁺的浓度较高，故成盐溶液接近终点时的pH值呈弱酸性(pH值为6.1左右)。

因此，在室温下，为使CaCO₃在溶液中解离的OH^-离子能被cAMP解离的H⁺完全中和，须要确保成盐溶液被充分搅拌，搅拌时间应较长(20min以上)。

但当温度升至40℃以上时，cAMP在水中的溶解度为1.3％，随着水的温度提高，溶液中H⁺的浓度随着cAMP的溶解量增加而明显升高，因此，则可打破CaCO₃在水溶液中存在难溶电解质的电离平衡，使cAMP成钙盐的速度明显加快(即提高反应温度，则有助于cAMP成钙盐)，与室温下所得成盐溶液相比，该成盐溶液的将偏碱性。

本发明有益效果：本发明方法操作简单，所得产品纯度高、金属离子含量合适，收率高；所制备的3’,5’-环化腺苷酸钙，其纯度为99.5％以上，其钙离子含量为5.6％～5.9％，收率为93％以上；所制备的3’,5’-环化腺苷酸钠，其纯度为99.5％以上，其钠离子含量为6.4％～6.7％，收率为95％以上。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明各实施例使用的的3’,5’-环化腺苷酸钙、钠中钙、钠离子含量的测定方法如下。

钙离子含量限度的确定

根据2015年版中国药典，供试品中钙离子含量的常规测定方法为络合滴定，而络合滴定主要是通过滴定操作进行。考虑到测量误差不可避免，2010年版中国药品检验标准操作规范将滴定液的初标平均值和复标平均值的相对偏差不得大于±0.1％。

由于样品的称量误差为0.1％(十万分之一天平的误差为0.1％)；由于容量瓶的体积误差为0.1％，故溶液配制过程中的配制误差为0.1％；由于滴定管的容量误差为0.1％，故滴定误差为0.1％(以上均指A级的玻璃仪器)。因此，上述误差的矢量叠加后，实际滴定液的标定值，常常会大于0.1％。

而实际滴定液标定过程中的误差，往往还会更大。根据2015年版中国药典二部葡萄糖酸钙之标准的含量限度范围为99％～104％，并结合实际情况，暂将环磷腺钙中钙离子含量限度范围暂定为±5％。

结合实际情况，将本品中的钙离子的含量的偏差率定为±5％。由于3’,5’-环化腺苷酸钙中钙元素含量的理论值为5.75％，故本品中钙离子的理论值应为5.5％～6.0％。

钙离子含量测定方法

取本品0.3g，精密称定，置锥形瓶中，先用少量的水润湿，再加入2mmol盐酸3ml与水25ml，溶解后，加0.025％甲基红的乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加水25ml与氨-氯化铵缓冲液(pH 10.0)10ml，再加铬黑T指示剂适量，用本液滴定至溶液由***变为纯蓝色。并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于2.004mg的钙。

钠离子含量限度的确定

参照3’,5’-环化腺苷酸钠中钠离子含量的理论值6.55％，将偏差率定为±5％，即限度范围为：6.3％～6.9％。

钠离子含量的测定方法

钠单元素对照品溶液的制备

精密量取钠单元素标准溶液(1000μg/ml)2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

取供试品25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取3ml,置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

测定法精密量取对照品溶液4ml、5ml、6ml、7ml与8ml，分别置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，将此溶液与供试品溶液照原子吸收分光光度法(中国药典2015年版四部通则0406第一法)，在589nm的波长处测定，计算钠离子量。

下列实施例是便于本领域的技术人员对本发明的理解，而不应当认为是对本发明的权利要求书中所描述的内容的限制。

本发明实施例与对比例中投料均按折干计。

实施例1

溶解：取纯度为99.0％以上的3’,5’-环化腺苷酸1000g(FW_cAMP＝329.21，3.04mol)，加20L 60℃水，配成5％的3’,5’-环化腺苷酸混悬液。

在搅拌条件下，分次加入纯度为99.0％以上的碳酸钙粉末158g(即1.58mol)，每次加入后搅拌20min以上，加入完毕，此时pH值为6.8。继续搅拌30min，pH值为6.7，过滤，除去不溶物。

脱色、脱炭、除菌：再向上述反应液中加入为纯化水总量0.3wt％的活性炭，继续搅拌30min。再经脱炭过滤器，除去活性炭。再过孔径为0.45um的微孔滤膜除菌；

减压浓缩：将上述滤液置于100℃水浴中，减压浓缩至水分基本挥干；

收集、干燥：用小勺刮出上述水分基本挥干的3’,5’-环化腺苷酸钙湿晶(注：由于浓缩器内生成的3’,5’-环化腺苷酸钙大多呈团状物，因此，干燥前，需先将部分团状物捣成散状)，置于40℃的减压干燥箱中(放置有P₂O₅)，干燥20h；

粉碎、过筛、混合：将干燥后的3’,5’-环化腺苷酸钙粉成粉末，过100目的筛网，混合25min；

再干燥：取所得3’,5’-环化腺苷酸钠粉末，再次置于105℃的常压干燥箱中，放置6h，即成。

本实施例得3’,5’-环化腺苷酸钙成品938g，收率为93.8％，纯度为99.6％，pH为6.7钙离子含量为5.8％。

实施例2

溶解：取纯度为99.0％以上的3’,5’-环化腺苷酸1000g(FW_cAMP＝329.21，3.04mol)，加2.5L100℃水，配成40％的3’,5’-环化腺苷酸混悬液。

在搅拌条件下，分次加入纯度为99.0％以上的氢氧化钙粉末124g(1.67mol)，每次加入后搅拌10min，加入完毕，此时料液的pH值为10.2，继续搅拌30min，pH值为10.3，过滤，除去不溶物。

搅拌下，用2mol/L盐酸将反应溶液的pH值调节至6.8，再续继搅拌30min(经确认，此时，反应液的pH值为6.8)，再滤除不溶物；

脱色、脱炭、除菌：再向上述反应液中加入为纯化水总量0.3wt％的活性炭，继续搅拌30min。再经脱炭过滤器，除去活性炭。再过孔径为0.22um的微孔滤膜除菌；

析晶、收集：向上述反应液中加入4倍乙醇，此时，有大量的白色固体析出，继续搅拌20分钟后，过滤，滤除乙醇，即得3’,5’-环化腺苷酸钙湿晶；

干燥：取上述3’,5’-环化腺苷酸钙湿晶，置于130℃的减压或常压干燥箱中，干燥2h；

粉碎、过筛、混合：将干燥后的3’,5’-环化腺苷酸钙粉成粉末，过120目的筛网，混合20min，即成。

本实施例得3’,5’-环化腺苷酸钙成品950g，收率为95％，纯度为99.7％，pH值为6.7，钙离子含量为5.9％。

实施例3

溶解：取纯度为99.0％以上的3’,5’-环化腺苷酸1000g(FW_cAMP＝329.21，3.04mol)，加10L 40℃水，配成10％的3’,5’-环化腺苷酸混悬液；

取纯度为99.0％以上的氢氧化钠128g(3.2mol)与1.6L水，配成2mol/L的氢氧化钠溶液，在搅拌条件下将氢氧化钠溶液分次加入3’,5’-环化腺苷酸混悬液中，每次加入后搅拌20min，加入完毕，此时pH值为6.7，继续搅拌20min，pH值为6.6，过滤，除去不溶物。

脱色、脱炭、除菌：再向上述反应液中加入为纯化水总量0.3wt％的活性炭，继续搅拌30min。再经脱炭过滤器，除去活性炭。再过孔径为0.22um的微孔滤膜除菌；

析晶、收集：将上述滤液置于90℃水浴中，减压浓缩至浓缩液体积为浓缩前反应液体积的20％～25％左右则止；待上述浓缩液降至室温后，倒出浓缩液，并用少量的水洗涤浓缩器的内壁，合并浓缩液后。再向上述反应液中加入4倍量的95％乙醇，充分搅拌后，过滤，滤除乙醇，即得3’,5’-环化腺苷酸钠湿晶；

干燥：取上述湿晶，置于40℃的放置有P₂O₅的减压干燥箱中，干燥20h；

粉碎、过筛、混合：将干燥后的3’,5’-环化腺苷酸钙粉成粉末，过120目的筛网，混合20min，即成。

本实施例得3’,5’-环化腺苷酸钠成品960g，收率为96％，纯度为99.7％，pH值为6.6，钠离子含量为6.6％。

实施例4

溶解：取纯度为99.0％以上的3’,5’-环化腺苷酸1000g(FW_cAMP＝329.21，3.04mol)，加20L 100℃的水，配成5％的3’,5’-环化腺苷酸混悬液；

取纯度为99.0％以上的氢氧化钠128g(3.2mol)与1.6L水，配成2mol/L的氢氧化钠溶液，在搅拌条件下将氢氧化钠溶液分次加入3’,5’-环化腺苷酸混悬液中，每次加入后搅拌20min，加入完毕，此时pH值为7.5，继续搅拌20min，pH值为7.5，过滤，除去不溶物；

脱色、脱炭、除菌：再向上述料液，加入为纯化水总量0.1wt％的活性炭，继续搅拌30min以上；将上述溶液先经除炭，再经过孔径为0.45um的微孔滤膜除菌；

析晶、收集：搅拌下，向上述反应液中加入纯度为95％以上的丙酮溶液80L后，再继续搅拌30min，减压过滤，滤除丙酮；再加入10℃下丙酮溶液4L，充分搅拌后，析晶30min，减压过滤，滤除丙酮后，即得3’,5’-环化腺苷酸钠湿晶；

干燥：取上述3’,5’-环化腺苷酸钠湿晶，置于130℃的常压干燥箱中，放置2h；

粉碎、过筛、混合：将干燥后的3’,5’-环化腺苷酸钙粉成粉末，过120目的筛网，混合30min，即成。

本实施例得3’,5’-环化腺苷酸钠成品960g，收率为96％，纯度为99.7％，pH为6.9，钠离子含量为6.7％。

对比例1

CN106589031A中制备3’,5’-环化腺苷酸钠的方法，与霍婷等人在2015年第2期总第35卷《中国生化药物杂志》的《二丁酰3’,5’-环化腺苷酸钠的制备及其含量和相关物质的测定》的文章中采取的方法仅存在参数范围的区别，本对比例采用两者共同的方法制备3’,5’-环化腺苷酸钠。

在室温的条件下，向10％的3’,5’-环化腺苷酸中缓慢滴加浓度为3mol/L的氢氧化钠水溶液,至pH值为10.5，生成3’,5’-环化腺苷酸钠溶液，再用20％的HCl溶液调节pH值至7.6，再加入9倍量的无水乙醇，析出白色固体。再经过滤、干燥后，得白色的3’,5’-环化腺苷酸钠固体。

经检测，3’,5’-环化腺苷酸钠样品中钠离子的含量为8.8％，明显大于3’,5’-环化腺苷酸钠中钠元素含量限度应为6.2％～6.9％之规定。该3’,5’-环化腺苷酸钠盐的制备方法，易使3’,5’-环化腺苷酸钠中的钠离子超限。

这是由于NaOH过量，需用20％的HCl溶液将反应溶液的pH值回调至7～8，在用HCl溶液回调pH值过程中，反应液中会生成过量的NaCl，由于NaCl微溶于有机溶剂，NaCl极有可能包埋于3’,5’-环化腺苷酸钠结晶内，与3’,5’-环化腺苷酸钠形成共沉淀现象，使3’,5’-环化腺苷酸钠中的钠离子超限。

对比例2

本对比例采用CN106336439B中的方法制备3’,5’-环化腺苷酸钙。

将3’,5’-环化腺苷酸与氢氧化钙按照摩尔比为1.2倍，加入水中，环磷酸腺苷与水的质量比为1:6，反应30min，过滤去除不溶物(此时溶液的pH值为10.9)，向滤液中加入体积为滤液体积的3倍的乙醇，待3’,5’-环化腺苷酸钙析出后，过滤，在80℃下真空干燥，得到3’,5’-环化腺苷酸钙。

经检测，本对比例制得的3’,5’-环化腺苷酸钙样品的钙离子含量为7.4％，远大于本品中钙离子的限度范围。

尽管将上述3’,5’-环化腺苷酸钙反应液中过量的不溶于水的氢氧化钙滤除，但由于20℃时，氢氧化钙在水中的溶解度仍有0.16g/100ml，又由于氢氧化钙在乙醇中也难溶，故溶解于水中的饱和氢氧化钙会在乙醇中全部析出，与3’,5’-环化腺苷酸钙形成共沉淀，导致3’,5’-环化腺苷酸钙中Ca²⁺离子超限。

对比例3

本对比例采用CN102250179B中的方法制备3’,5’-环化腺苷酸钙。

由于氧化钙溶于水后，终产物为氢氧化钙，故选择氢氧化钙为原料进行试验。

在250ml三颈烧瓶中，加折纯后的3’,5’-环化腺苷酸32.921g(0.1mol)、水100ml，搅拌，加入0.05mol纯度为99.0％以上的折干后的氢氧化钙的固体(3.7g)，20℃下搅拌60分钟左右，使溶解，此时溶液的pH值为5.5，过滤，加5倍量的无水乙醇和异丙醇(1：1)，冷却到-4℃，放置24小时，待固体析出，过滤，50℃左右干燥6小时干燥，得类白色固体。

结果见表10。根据表10中的结果，说明制得的3’,5’-环化腺苷酸钙中Ca²⁺离子含量偏低。说明，即便按化学反应的摩尔比投料，部分3’,5’-环化腺苷酸并没有与氢氧化钙完全成钙盐。

由于3’,5’-环化腺苷酸(FW＝329.21)与氢氧化钙(FW＝74)均微溶于水(根据溶解度试验，20℃时，3’,5’-环化腺苷酸在水中的溶解度为0.4％；氢氧化钙在水中的溶解度为0.173g/100ml)，且上述二种物质均不溶于乙醇，故无论是哪一种物料的投料量过量，在水中观察到的现象均为白色混悬液。如果不合理调整投料量，极有可能出现3’,5’-环化腺苷酸并未完全成钙盐或氢氧化钙过量的现象。

对比例4

本对比例采用CN102250179B中的方法制备3’,5’-环化腺苷酸钙。

在250ml三颈烧瓶中，加折纯后的3’,5’-环化腺苷酸32.921g(0.1mol)、水100ml，搅拌，加入0.05mol纯度为99.0％以上的折干后的氢氧化钙的固体(3.7g)，60℃下搅拌60分钟左右，使溶解，此时溶液的pH值为5.6，过滤，加5倍量的无水乙醇和异丙醇(1：1)，冷却到-4℃，放置24小时，待固体析出，过滤，50℃左右减压干燥6小时干燥，得类白色固体。

结果见表10。根据表10的结果，说明制得的3’,5’-环化腺苷酸钙中Ca²⁺离子含量偏低。说明，即便按化学反应的摩尔比投料，部分3’,5’-环化腺苷酸并没有与氢氧化钙完全成钙盐。

表10.氢氧化钙与3’,5’-环化腺苷酸按化学反应的摩尔比投料后制得的3’,5’-环化腺苷酸钙中Ca²⁺离子含量测定结果

温度(℃)	20	60
			3’,5’-环化腺苷酸(mol)	0.1	0.1
称样量(g)	32.921	32.921
			水体积(ml)	100	100
氢氧化钙(mol)	0.05	0.05
			氢氧化钙(g)	3.7	3.7
溶液的pH	5.4	5.5
			3’,5’-环化腺苷酸钙中Ca离子的含量(％)	5.2	5.3

对比例5

本对比例采用CN102250179B中的方法制备3’,5’-环化腺苷酸钠。

称取纯度为99.0％以上的3’,5’-环化腺苷酸原料20g，加水400ml，搅拌，缓慢向反应瓶中加入与3’,5’-环化腺苷酸等摩尔的碳酸氢钠，搅拌，控制温度为20℃，反应30min，加溶液总重量0.2wt％的活性炭搅拌半小时，此时溶液的pH值为5.7，过滤，再用0.22微米微孔滤膜过滤，逐渐降温，冷冻到-40℃，然后升温至30℃，整个冻干时间为26h，真空度0.09MPa之间，得类白色固体，该固体易溶于水。

结果见表11。根据表11的结果，说明制得的3’,5’-环化腺苷酸钠中Na⁺离子含量偏低。说明即便按化学反应的摩尔比投料，部分3’,5’-环化腺苷酸并没有与碳酸氢钠完全成钠盐。

碳酸氢钠易溶于水，碱性较强，可与3’,5’-环化腺苷酸生成可溶性的3’,5’-环化腺苷酸钠，尽管可以到反应液由白色混悬液逐渐澄清的现象，但若不控制反应溶液的pH值，3’,5’-环化腺苷酸仍极有可能不能完全成钠盐。

表11.碳酸氢钠与3’,5’-环化腺苷酸按化学反应的摩尔比投料后制得的3’,5’-环化腺苷酸钠中Na⁺离子的含量测定结果

温度(℃)	20
		称样量(g)	20
3’,5’-环化腺苷酸摩尔数(mmol)	60.75
		水(g)	400
浓度(％)	5
		碳酸氢钠(mmol)	60.75
碳酸氢钠(g)	5.1
		白色固体完全溶解时pH	5.72
3’,5’-环化腺苷酸钠中Na离子的含量(％)	5.6

对比例6

溶解：取纯度为99.0％以上的3’,5’-环化腺苷酸10g(FW_cAMP＝329.21，30.38mmol)，加100ml 40℃水，配成10％的3’,5’-环化腺苷酸混悬液；

取纯度为99.0％以上的氢氧化钠1.215g(30.38mmol)与15ml水，配成2mol/L的氢氧化钠溶液，在搅拌条件下将氢氧化钠溶液分次加入3’,5’-环化腺苷酸混悬液中，每次加入后搅拌20min，加入完毕，此时pH值为5.7，继续搅拌20min，pH值为5.7，过滤，除去不溶物。

脱色、脱炭、除菌：再向上述反应液中加入为纯化水总量0.3wt％的活性炭，继续搅拌30min。再经脱炭过滤器，除去活性炭。再过孔径为0.22um的微孔滤膜除菌；

析晶、收集：将上述滤液置于90℃水浴中，减压浓缩至浓缩液体积为浓缩前反应液体积的20％～25％左右则止；待上述浓缩液降至室温后，倒出浓缩液，并用少量的水洗涤浓缩器的内壁，合并浓缩液后。再向上述反应液中加入4倍量的95％乙醇，充分搅拌后，过滤，滤除乙醇，即得3’,5’-环化腺苷酸钠湿晶；

干燥：取上述湿晶，置于40℃的放置有P₂O₅的减压干燥箱中，干燥20h；

粉碎、过筛：将干燥后的3’,5’-环化腺苷酸钙粉成粉末，过120目的筛网，即成。

本实施例得3’,5’-环化腺苷酸钠成品8.1g，收率为81％，纯度为99.6％，pH值为5.6，钠离子含量为5.6％。

根据表12中的结果，说明制得的3’,5’-环化腺苷酸钠中Na⁺离子含量偏低。说明即便按化学反应的摩尔比投料，部分3’,5’-环化腺苷酸并没有与碳酸氢钠完全成钠盐。

表12.氢氧化钠与3’,5’-环化腺苷酸按化学反应的摩尔比投料后制得的3’,5’-环化腺苷酸钠中Na⁺离子的含量测定结果(20℃)

金属离子为钠离子的碱	氢氧化钠
		化学式	NaOH
分子量FW	40
		3’,5’-环化腺苷酸称样量(g)	10
3’,5’-环化腺苷酸摩尔数(mmol)	30.38
		加水量(ml)	100
与3’,5’-环化腺苷酸的摩尔数之比	1
		碱的称样量(g)	1.22
3’,5’-环化腺苷酸的溶解情况	全部溶解
		溶液pH	5.7
3’,5’-环化腺苷酸钠中Na离子的含量(％)	5.6

对比例7

溶解：取纯度为99.0％以上的3’,5’-环化腺苷酸1000g(FW_cAMP＝329.21，3.04mol)，加20L室温条件下的纯化水，配成5％的3’,5’-环化腺苷酸混悬液，在搅拌条件下，分次加入纯度为99.0％以上的碳酸钙粉末152g(1.52mol),每次加入后搅拌30min，加入完毕，此时pH值为5.4，继续搅拌60min，pH值为5.3，过滤，除去不溶物；

脱色、脱炭、除菌：再向上述反应液中加入为纯化水总量0.3wt％的活性炭，继续搅拌30min。再经脱炭过滤器，除去活性炭。再过孔径为0.22um的微孔滤膜除菌；

减压浓缩：将上述滤液置于100℃水浴中，减压浓缩至水分基本挥干；

收集、干燥：用小勺刮出上述水分基本挥干的3’,5’-环化腺苷酸钙湿晶(注：由于浓缩器内生成的3’,5’-环化腺苷酸钙大多呈团状物，因此，干燥前，需先将部分团状物捣成散状)，置于40℃的减压干燥箱中(放置有P₂O₅)，干燥20h；

粉碎、过筛：将干燥后的3’,5’-环化腺苷酸钙粉成粉末，过120目的筛网；

再干燥：取上述3’,5’-环化腺苷酸钠粉末，再次置于105℃的常压干燥箱中，放置6h，即成。

结果见表13。表中的结果说明制得的3’,5’-环化腺苷酸钙中Ca²⁺离子含量偏低。说明，即便按化学反应的摩尔比投料，部分3’,5’-环化腺苷酸并没有与碳酸钙完全成钙盐。

对比例8

溶解：取纯度为99.0％以上的3’,5’-环化腺苷酸1000g(FW_cAMP＝329.21，3.04mol)，加20L室温条件下的纯化水，配成5％的3’,5’-环化腺苷酸混悬液，在搅拌条件下，分次加入纯度为99.0％以上的碳酸氢钙粉末243g(1.52mol),每次加入后搅拌30min，加入完毕，此时pH值为5.8，继续搅拌60min，pH值为5.7，过滤，除去不溶物；

脱色、脱炭、除菌：再向上述反应液中加入为纯化水总量0.3wt％的活性炭，继续搅拌30min。再经脱炭过滤器，除去活性炭。再过孔径为0.22um的微孔滤膜除菌；

减压浓缩：将上述滤液置于100℃水浴中，减压浓缩至水分基本挥干；

收集、干燥：用小勺刮出上述水分基本挥干的3’,5’-环化腺苷酸钙湿晶(注：由于浓缩器内生成的3’,5’-环化腺苷酸钙大多呈团状物，因此，干燥前，需先将部分团状物捣成散状)，置于40℃的减压干燥箱中(放置有P₂O₅)，干燥20h；

粉碎、过筛：将干燥后的3’,5’-环化腺苷酸钙粉成粉末，过120目的筛网；

再干燥：取上述3’,5’-环化腺苷酸钠粉末，再次置于105℃的常压干燥箱中，放置6h，即成。

结果见表13。表中的结果说明制得的3’,5’-环化腺苷酸钙中Ca²⁺离子含量偏低。说明，即便按化学反应的摩尔比投料，部分3’,5’-环化腺苷酸并没有与碳酸氢钙完全成钙盐。

表13.金属离子为钙离子的盐与3’,5’-环化腺苷酸按化学反应的摩尔比投料后制得的3’,5’-环化腺苷酸钙中Ca²⁺离子的含量测定结果(20℃)

通过对比例3～8可以说明，强碱或强碱弱酸盐或金属氧化物与3’,5’-环化腺苷酸按化学反应的摩尔比投料，成盐的溶液pH值通常为6以下，所得的3’,5’-环化腺苷酸的成品中金属离子的含量偏低。