阅读说明：本技术 一种应用sting蛋白亲合纯化环二核苷酸的方法 (Method for affinity purification of cyclic dinucleotide by using STING protein ) 是由 朱德裕 吕云 朱敬 于 2019-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种应用STING蛋白亲合纯化环二核苷酸的方法,属于微生物发酵提纯的技术领域。本发明是利用了镍螯合琼脂糖为固相载体,与C端带有组氨酸标签(His-tag)的人源干扰素基因刺激蛋白的配体结合结构域(STINGLBD,residues 149-341)相结合后,填入柱子中制成STING亲合柱。该亲合柱能够和环二核苷酸特异性结合,然后可通过含尿素溶液对所结合的配体进行专一的洗脱。本发明的有益效果为：1、解决了现有技术无法从复杂样品中直接提取环二核苷酸的难题；2、只需经过一步纯化即可从复杂样品中获得纯度＞80％的环二核苷酸；3、大大的降低了环二核苷酸的制备成本。(The invention discloses a method for affinity purification of cyclic dinucleotide by using STING protein, belonging to the technical field of microbial fermentation and purification. The invention uses nickel chelating agarose as a solid phase carrier, and after the nickel chelating agarose is combined with a ligand binding domain (STINGLBD, residues 149-341) of human interferon gene stimulating protein with histidine tag (His-tag) at the C end, the mixture is filled into a column to prepare the STING affinity column. The affinity column is capable of specifically binding to cyclic dinucleotides and then specifically eluting the bound ligands through a urea-containing solution. The invention has the beneficial effects that: 1. the problem that cyclic dinucleotide can not be directly extracted from a complex sample in the prior art is solved; 2. cyclic dinucleotide with purity of more than 80% can be obtained from a complex sample only by one-step purification; 3. greatly reduces the preparation cost of the cyclic dinucleotide.)

一种应用STING蛋白亲合纯化环二核苷酸的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵提纯的技术领域，具体涉及一种应用STING蛋白亲合纯化环二核苷酸的方法。

背景技术

环二核苷酸(CDNs)是细菌和哺乳动物细胞中广泛存在的重要第二信使分子。环二核苷酸家族包括c-di-GMP、c-di-AMP、2’,3’-cGAMP和3’,3’-cGAMP等，现广泛用于各种研究领域，如生物学、药学、和临床研究。目前，环二核苷酸的制备主要通过化学合成和酶合成等两方法制备，其原材料相对较贵或不利于环境，以及纯化前的样品要求相对较高，是导致环二核苷酸成本高的几个主要因素，目前市售环二核苷酸价格非常昂贵，价格大约为€150～440/mg。此外，现有的常用环二核苷酸纯化方法是利用反相高效液相色谱(Highperformance Liquid Chromatography,HPLC)，其对所需纯化的前体样品要求较高，主要适合纯化相对已经较纯的、且体积受限的环二核苷酸样品，不适用于从复杂成分中分离纯化环二核苷酸。同时，从复杂样品(如细胞)中提取环二核苷酸至今还缺乏一个简单且行之有效的方法。因此，探索环二核苷酸的高效，专一，简单的亲和性分离纯化方法是有必要的，且具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术中从复杂样品中提取环二核苷酸难度较大、制备纯化成本高等问题，本发明提供一种应用STING蛋白亲合纯化环二核苷酸的方法，以解决上述问题。

为实现上述目标，本发明的设计思路为：

亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力来分离纯化分子的技术方案，该方法广泛用于生物分子的分离纯化。人源干扰素刺激基因(STING是是天然免疫信号通路中重要接头蛋白,也是环二核苷酸(包括c-di-GMP、c-di-AMP、2’,3’-cGAMP和3’,3’-cGAMP)的共同受体。在本发明中，我们以快流速型镍螯合琼脂糖快速流动(Ni-Chelating SepharoseFast Flow)为固相载体，与C端带有组氨酸标签(His-tag)的人源干扰素基因刺激蛋白的配体结合结构域(STINGLBD,residues 149-341)相结合后，填入柱子中制成STING亲和柱。该亲和柱能够和环二核苷酸特异性结合，然后可通过含尿素溶液对所结合的配体进行专一的洗脱。

本发明的具体实施方案为：

(1)将人源干扰素基因刺激蛋白的配体结构域STING^LBD(氨基酸残基是149-341位)所对应的基因通过PCR扩增并构建到pet30a载体上，所用酶切位点是NdeI和XhoI，产生一个C端His tag。

(2)将重组质粒pet30a-STING^LBD转入E.coli BL21(DE3)中，并转移到含有50ug/ml卡那抗生素的固体LB培养板上，然后置于37℃过夜培养，出现菌落。

(3)挑单克隆接种到含有50ug/ml卡那抗生素的液体LB，37℃振荡培养过夜。取过夜培养菌1:100接种到LB液体培养基(卡那抗生素的浓度为50ug/ml)，37℃振荡培养至OD₆₀₀到0.7～0.8，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，18℃诱导16h。

(4)收菌，低温4℃离心，离心参数：转速3500rpm，时间30min。

(5)快流速型镍螯合琼脂糖预处理，取50ml快流速型琼脂糖装在长25cm，内径为2.2cm玻璃柱子里，先用300ml双蒸水冲洗，后用200ml 50mmol/L EDTA冲洗柱子，接着用双蒸水冲洗，再用1mmol/L NaOH浸泡半小时。接着用双蒸水冲洗柱子至中性，加入0.1mmol/LNiSO4,使Ni²⁺离子结合到基质上，再用双蒸水冲洗掉多余的Ni²⁺离子，制成镍螯合琼脂糖柱子。

(6)制备STING亲合柱。用重悬缓冲液平衡镍螯合琼脂糖柱子后，将步骤(4)所得上清样品，加入螯合琼脂糖柱子，使STING^LBD蛋白被镍螯合琼脂糖结合，然后用漂洗缓冲液冲洗柱子，再用1L重悬缓冲液冲洗柱子，接着用500ml 2mmol/L尿素冲洗柱子，最后再用500ml的重悬缓冲液冲洗柱子并存放在重悬缓冲液中，我们将这个柱子命名为STING亲和柱，存放于4-10℃中待用。

(7)取通过微生物发酵法所得的含有高浓度环二核苷酸的大肠杆菌菌体，加入重悬缓冲液重悬菌体，高压破碎后，低温4℃离心，离心参数：12000g，60min。

(8)取上清液，沸水浴15min，待冷却后，再次低温4℃离心，离心参数：12000g，60min。取上清液，用0.22～0.45μm的滤膜过滤，然后加入2倍体积的重悬缓冲液稀释样品，将样品加入已平衡好的STING亲合柱，流穿样品也被收集保留。上样结束后，用300mmol/L的醋酸钠冲洗柱子，流穿样品也被收集保留。待冲洗结束后，用0.1～1.5mmol/L尿素溶液洗脱环二核苷酸，直至核酸浓度小于5ng/ul，时停止收集洗脱液，核酸浓度用K5600微量分光光度计检测。然后用2mol/L尿素冲洗重生柱子，再用重悬缓冲液平衡柱子。将前面所得流穿样品合并加入STING亲合柱，按上述相同步骤进行冲洗和洗脱纯化环二核苷酸。样品的产率可达90％，HPLC液相紫外图谱显示已没有明显的杂峰，纯度>80％。

(9)洗脱结束后，用2mol/L尿素冲洗重生柱子，再用重悬缓冲液大量冲洗平衡柱子，存放于4～10℃度中待下次使用。

优选的，所述STING亲和柱的固相载体也可以是NHS活化琼脂糖凝胶或CNBr活化琼脂糖凝胶。

优选的，所述步骤(6)中重悬缓冲液为20mmol Tris-HCl，pH＝8.0，200mmol NaCl水溶液。

优选的，所述步骤(5)中快流速型镍螯合琼脂糖为IMAC，cat.no.17057502，GEHealthcare，United States。

优选的，所述步骤(6)中漂洗缓冲液为20mmol Tris-HCl，pH＝8.0，200mmol NaCl，20mmol/L咪唑水溶液。

优选的，经STING亲和柱初步纯化所得的环二核苷酸样品，可继续使用大孔吸附树脂SP207以及YMC-Pack C18 ODS-AQ半制备柱进行纯化，最后可以得到重量纯度在96.0～99.9％的环二核苷酸。

本发明的有益效果

(1)通过本发明证实了采用STING亲和柱提取分离环二核苷酸的方法是切实可行的。

(2)相比于现有技术中采用高效液相色谱进行提纯的方法，本发明通过采用STING亲和柱提取分离环二核苷酸，解决了现有技术无法从复杂样品(如细胞)中直接提取样品的难题。

(3)本发明采用STING亲和柱提取分离环二核苷酸，只需经过一步纯化即可从复杂样品(如细胞)中获得纯度＞80％的环二核苷酸，使得环二核苷酸的制备更加简单有效，易于后续鉴定和纯化，使我们从复杂样品中鉴定环二核苷酸变得更加简单和准确。

(4)本发明的STING亲和柱具有很好的重复使用性，可以重复使用达15次，这使得环二核苷酸的制备更加环保，可有效地降低环二核苷酸的生产成本。与本发明前期建立的环二核苷酸微生物发酵法相结合，采用STING亲和柱以及后续的纯化能有效、环保的制备高纯度的环二核苷酸。同时依据产率、原始耗材，可重复使用的材料以及操作时间成本，本发明的制备成本大约是$1/mg，远远低于其现行销售价格€150～440/mg。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1本发明c-di-GMP的化学结构式；

图2本发明c-di-AMP的化学结构式；

图3本发明3’,3’-cGAMP的化学结构式；

图4本发明2’,3’-cGAMP的化学结构式；

图5STING亲和柱纯化前c-di-GMP的高效液相紫外(UV254nm)图；

图6STING亲和柱纯化后c-di-GMP的高效液相紫外(UV254nm)图；

图7STING亲和柱纯化前3’3’-cGAMP的高效液相紫外(UV254nm)图；

图8STING亲和柱纯化后3’3’-cGAMP的高效液相紫外(UV254nm)图；

图9STING亲和柱纯化前2’3’-cGAMP的高效液相紫外(UV254nm)图；

图10STING亲和柱纯化后2’3’-cGAMP的高效液相紫外(UV254nm)图。

具体实施方式

实施例1

(1)将人源干扰素基因刺激蛋白的配体结构域STING^LBD(氨基酸残基是149-341位)所对应的基因通过PCR扩增并构建到pet30a载体上，所用酶切位点是NdeI和XhoI，产生一个C端His tag。

(2)将重组质粒pet30a-STING^LBD转入E.coli BL21(DE3)中，并转移到含有50ug/ml卡那抗生素的固体LB培养板上，然后置于37℃过夜培养，出现菌落。

(3)挑单克隆接种到含有50ug/ml卡那抗生素的液体LB，37℃振荡培养过夜。取过夜培养菌1:100接种到LB液体培养基(卡那抗生素的浓度为50ug/ml)，37℃振荡培养至OD₆₀₀到0.7～0.8，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，18℃诱导16h。

(4)收菌，低温4℃离心，离心参数：转速3500rpm，时间30min。

(5)快流速型镍螯合琼脂糖预处理，取50ml快流速型琼脂糖装在长25cm，内径为2.2cm玻璃柱子里，先用300ml双蒸水冲洗，后用200ml 50mmol/L EDTA冲洗柱子，接着用双蒸水冲洗，再用1mmol/L NaOH浸泡半小时。接着用双蒸水冲洗柱子至中性，加入0.1mmol/LNiSO4,使Ni²⁺离子结合到基质上，再用双蒸水冲洗掉多余的Ni²⁺离子，制成镍螯合琼脂糖柱子。

(6)制备STING亲合柱。用重悬缓冲液平衡镍螯合琼脂糖柱子后，将步骤(4)所得上清样品，加入螯合琼脂糖柱子，使STING^LBD蛋白被镍螯合琼脂糖结合，然后用漂洗缓冲液冲洗柱子，再用1L重悬缓冲液冲洗柱子，接着用500ml 2mmol/L尿素冲洗柱子，最后再用500ml的重悬缓冲液冲洗柱子并存放在重悬缓冲液中，我们将这个柱子命名为STING亲和柱，存放于4-10℃中待用。

(7)取通过微生物发酵法所得的含有高浓度c-di-GMP的大肠杆菌菌体，加入重悬缓冲液重悬菌体，高压破碎后，低温4℃离心，离心参数：12000g，60min。

(8)取上清液，沸水浴15min，待冷却后，再次低温4℃离心，离心参数：12000g，60min。取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，然后加入2倍体积的重悬缓冲液稀释样品，将样品加入已平衡好的STING亲合柱，流穿样品也被收集保留。上样结束后，用500毫升300mmol/L的醋酸钠冲洗柱子，流穿样品也被收集保留。待冲洗结束后，用150毫升0.1mmol/L尿素溶液洗脱c-di-GMP，直至核酸浓度小于5ng/ul，时停止收集洗脱液，核酸浓度用K5600微量分光光度计检测。然后用200毫升2mol/L尿素冲洗重生柱子，再用200毫升重悬缓冲液平衡柱子。将前面所得流穿样品合并加入STING亲合柱，按上述相同步骤进行冲洗和洗脱纯化c-di-GMP。样品的产率可达90％，HPLC液相紫外图谱显示已没有明显的杂峰，纯度>80％。

(9)洗脱结束后，用2mol/L尿素冲洗重生柱子，再用重悬缓冲液大量冲洗平衡柱子，存放于4～10℃度中待下次使用。

实施例2

(1)将人源干扰素基因刺激蛋白的配体结构域STING^LBD(氨基酸残基是149-341位)所对应的基因通过PCR扩增并构建到pet30a载体上，所用酶切位点是NdeI和XhoI，产生一个C端His tag。

(2)将重组质粒pet30a-STING^LBD转入E.coli BL21(DE3)中，并转移到含有50ug/ml卡那抗生素的固体LB培养板上，然后置于37℃过夜培养，出现菌落。

(3)挑单克隆接种到含有50ug/ml卡那抗生素的液体LB，37℃振荡培养过夜。取过夜培养菌1:100接种到LB液体培养基(卡那抗生素的浓度为50ug/ml)，37℃振荡培养至OD₆₀₀到0.7～0.8，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，18℃诱导16h。

(4)收菌，低温4℃离心，离心参数：转速3500rpm，时间30min。

(5)快流速型镍螯合琼脂糖预处理，取50ml快流速型琼脂糖装在长25cm，内径为2.2cm玻璃柱子里，先用300ml双蒸水冲洗，后用200ml 50mmol/L EDTA冲洗柱子，接着用双蒸水冲洗，再用1mmol/L NaOH浸泡半小时。接着用双蒸水冲洗柱子至中性，加入0.1mmol/LNiSO4,使Ni²⁺离子结合到基质上，再用双蒸水冲洗掉多余的Ni²⁺离子，制成镍螯合琼脂糖柱子。

(6)制备STING亲合柱。用重悬缓冲液平衡镍螯合琼脂糖柱子后，将步骤(4)所得上清样品，加入螯合琼脂糖柱子，使STING^LBD蛋白被镍螯合琼脂糖结合，然后用漂洗缓冲液冲洗柱子，再用1L重悬缓冲液冲洗柱子，接着用500ml 2mmol/L尿素冲洗柱子，最后再用500ml的重悬缓冲液冲洗柱子并存放在重悬缓冲液中，我们将这个柱子命名为STING亲和柱，存放于4-10℃中待用。

(7)取通过微生物发酵法所得的含有高浓度3’3’-cGAMP的大肠杆菌菌体，加入重悬缓冲液重悬菌体，高压破碎后，低温4℃离心，离心参数：12000g，60min。

(8)取上清液，沸水浴15min，待冷却后，再次低温4℃离心，离心参数：12000g，60min。取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，然后加入2倍体积的重悬缓冲液稀释样品，将样品加入已平衡好的STING亲合柱，流穿样品也被收集保留。上样结束后，用500毫升300mmol/L的醋酸钠冲洗柱子，流穿样品也被收集保留。待冲洗结束后，用150毫升0.1mmol/L尿素溶液洗脱3’3’-cGAMP，直至核酸浓度小于5ng/ul，时停止收集洗脱液，核酸浓度用K5600微量分光光度计检测。然后用200毫升2mol/L尿素冲洗重生柱子，再用200毫升重悬缓冲液平衡柱子。将前面所得流穿样品合并加入STING亲合柱，按上述相同步骤进行冲洗和洗脱纯化3’3’-cGAMP。样品的产率可达85％，HPLC液相紫外图谱显示已没有明显的杂峰，纯度>80％。

(9)洗脱结束后，用2mol/L尿素冲洗重生柱子，再用重悬缓冲液大量冲洗平衡柱子，存放于4～10℃度中待下次使用。

实施例3

(1)将人源干扰素基因刺激蛋白的配体结构域STING^LBD(氨基酸残基是149-341位)所对应的基因通过PCR扩增并构建到pet30a载体上，所用酶切位点是NdeI和XhoI，产生一个C端His tag。

(2)将重组质粒pet30a-STING^LBD转入E.coli BL21(DE3)中，并转移到含有50ug/ml卡那抗生素的固体LB培养板上，然后置于37℃过夜培养，出现菌落。

(3)挑单克隆接种到含有50ug/ml卡那抗生素的液体LB，37℃振荡培养过夜。取过夜培养菌1:100接种到LB液体培养基(卡那抗生素的浓度为50ug/ml)，37℃振荡培养至OD₆₀₀到0.7～0.8，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，18℃诱导16h。

(4)收菌，低温4℃离心，离心参数：转速3500rpm，时间30min。

(5)快流速型镍螯合琼脂糖预处理，取50ml快流速型琼脂糖装在长25cm，内径为2.2cm玻璃柱子里，先用300ml双蒸水冲洗，后用200ml 50mmol/L EDTA冲洗柱子，接着用双蒸水冲洗，再用1mmol/L NaOH浸泡半小时。接着用双蒸水冲洗柱子至中性，加入0.1mmol/LNiSO4,使Ni²⁺离子结合到基质上，再用双蒸水冲洗掉多余的Ni²⁺离子，制成镍螯合琼脂糖柱子。

(6)制备STING亲合柱。用重悬缓冲液平衡镍螯合琼脂糖柱子后，将步骤(4)所得上清样品，加入螯合琼脂糖柱子，使STING^LBD蛋白被镍螯合琼脂糖结合，然后用漂洗缓冲液冲洗柱子，再用1L重悬缓冲液冲洗柱子，接着用500ml 2mmol/L尿素冲洗柱子，最后再用500ml的重悬缓冲液冲洗柱子并存放在重悬缓冲液中，我们将这个柱子命名为STING亲和柱，存放于4-10℃中待用。

(7)取通过微生物发酵法所得的含有高浓度2’3’-cGAMP的大肠杆菌菌体，加入重悬缓冲液重悬菌体，高压破碎后，低温4℃离心，离心参数：12000g，60min。

(8)取上清液，沸水浴15min，待冷却后，再次低温4℃离心，离心参数：12000g，60min。取上清液，用0.45μm的滤膜过滤，然后加入2倍体积的重悬缓冲液稀释样品，将样品加入已平衡好的STING亲合柱，流穿样品也被收集保留。上样结束后，用500毫升300mmol/L的醋酸钠冲洗柱子，流穿样品也被收集保留。待冲洗结束后，用300毫升1.5mmol/L尿素溶液洗脱2’3’-cGAMP，直至核酸浓度小于5ng/ul，时停止收集洗脱液，核酸浓度用K5600微量分光光度计检测。然后用200毫升2mol/L尿素冲洗重生柱子，再用200毫升重悬缓冲液平衡柱子。将前面所得流穿样品合并加入STING亲合柱，按上述相同步骤进行冲洗和洗脱纯化2’3’-cGAMP。样品的产率可达90％，HPLC液相紫外图谱显示已没有明显的杂峰，纯度>80％。

(9)洗脱结束后，用2mol/L尿素冲洗重生柱子，再用重悬缓冲液大量冲洗平衡柱子，存放于4～10℃度中待下次使用。

尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。