阅读说明：本技术 棉花抗黄萎病相关基因GhCML41的应用 (Application of cotton verticillium wilt resistance-related gene GhCML41 ) 是由 冯鸿杰 赵沛 朱荷琴 赵丽红 冯自力 魏锋 师勇强 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于农业生物技术领域,具体涉及棉花抗黄萎病相关基因GhCML41的应用。棉花抗黄萎病相关基因GhCML41,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的基因GhCML41的表达与棉花抗黄萎病呈正相关,可通过基因工程用于选育棉花抗病品种。(The invention belongs to the technical field of agricultural biology, and particularly relates to application of a cotton verticillium wilt resistance related gene GhCML 41. The nucleotide sequence of the cotton verticillium wilt resistance related gene GhCML41 is shown in SEQ ID No.1, and the coded amino acid sequence is shown in SEQ ID No. 2. The expression of the gene GhCML41 of the invention is positively correlated with the verticillium wilt resistance of cotton, and can be used for breeding cotton disease-resistant varieties through genetic engineering.)

棉花抗黄萎病相关基因GhCML41的应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及棉花抗黄萎病相关基因GhCML41的应用。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物、纺织原材料，对民生和国家发展具有重要意义，然而，棉花黄萎病严重危害我国棉花产业的健康发展。棉花黄萎病作为一种土传病害，尚无理想的防治措施，筛选有效的抗病基因，通过基因工程手段改良棉花品种是防治棉花的黄萎病的有效手段。

病原菌与植物的侵染和抗侵染机制一直是研究热点，植物与病原物之间的PTI和ETI抗病机理，成为研究抗病育种的重点。在病原物胁迫下，植物体内激活一系列信号转导，以激发植物的抗性反应，以抵御病原菌的侵染。钙是植物信号网络中必不可少的第二信使，植物钙传感器多种多样，它们在各种信号转导通路之间相互联系，构成了一个严密的信号调控网络。钙信号又是重要的信号传递分子，在植物生理生化过程中发挥着至关重要的作用。在病原菌入侵植物细胞后，作为植物抗病反应的早期信号之一，植物体内会发生钙离子的流入，在植物面对逆境情况时，钙信号可通过钙离子浓度的变化将胞外信号传递到胞内，使植物作出相应的生理反应以应对逆境胁迫。

植物类钙调素蛋白CaM是进化上保守的真核Ca²⁺传感器，它与钙离子结合在它的四个EF-hand基序上。钙调蛋白是一种酸性蛋白，其Ca²⁺结合结构类似于“哑铃”形状，其中两个球形域，每个域包含一对EF-hand，由一个柔性中心螺旋区连接。CaM以正协同性结合Ca²⁺，诱导构象变化，暴露可以与下游目标蛋白相互作用的疏水区域。CMLs基因参与了许多植物发育和应激诱导相关的信号通路，尤其是CMLs在面对温度、水分和土壤质量的过度变化时，植物细胞感知的环境因子通过Ca²⁺离子、环核苷酸单磷酸盐、活性氧等小分子传递，促进生理或形态变化，在不利条件下达到植物生长和生产力的最佳状态。CML18与AtNHX1的相互作用依赖于pH降低其Na⁺/H⁺交换活性。因此，盐胁迫下液泡酸化可阻断CML18与AtNHX1的相互作用，促进盐胁迫下Na⁺的转运，降低对细胞的伤害。CML9幼苗对ABA高度敏感，在ABA不敏感突变体和ABA合成缺失的突变体中，盐对于CML9的诱导水平显著降低，推测CML9是ABA依赖性耐盐度的负调控因子。而水稻OsCML4基因在干旱条件下，过表达该基因的转基因植株相较野生型生长性能明显改善，具有更高的存活率，并且活性氧(ROS)和过氧化氢酶(CAT)的活性以及脯氨酸的浓度在转基因植物中显著增加。

发明内容

本发明的目的在于提供一种棉花抗黄萎病相关基因GhCML41的应用。

本发明的再一目的在于提供提高棉花黄萎病抗病性的方法。

根据本发明

具体实施方式

的基因GhCML41，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGGCAACTGCTAAAGTTTCCAAGGCTTCCAAATGGTTCTCTAACAAGAGCCTTAGGTTAAGCCTTCAACGTCGTGGATCAAAGTCTAGATCAACATCCTTAAGCTCTTCTCCTGGACCATCATCAACACCAATATCTCCTCGCACAATTCCTAATATGAGAACCAAAAGGCCTGAAGAAGACGAGATGAAGCAAGTCTTTGGCTATTTCGACGGGGATGGTGATGGCAAAATCTCTGCTCTTGAACTTAGGGCGTACTTTGGGTCCATCGGGGAGTACATGTCACATGAAGATGCTCAAGGGGTGATCAACGATCTTGACTCGGACGGGGATAGCATGCTGGACTATCAGGATTTCTTGAAGCTAATGAAAAGAGAACCCAGCAAGGATGATGAGGGAGATGATTATGATGATCTGAAGAAAGCGTTTGAGATGTTTGAACTGGAGAAAGGTTCGGGGTGCATAACACCCAAAGGGCTGCAAAGGATGTTGAATCGACTTGGGGATGCAAAATCATATGATGAATGCGTTGCCATGATTCGGGTATATGATATCGATGGTAATGGGGTGCTTGATTTTCATGAGTTCCATCAAATGATGGCTTAA

根据本发明具体实施方式的蛋白GhCML41属于类钙调素蛋白，其氨基酸序列如SEQID No.2所示：

本发明提供基因GhCML41在防治棉花黄萎病的应用，可以用于提高棉花抗性品种及感病品种对黄萎病的抗病性。

本发明还提供了一种提高棉花黄萎病抗病性的方法，所述方法中包括在棉花品种过表达基因GhCML41的步骤。

本发明的有益效果：

本发明构建了基因GhCML41的沉默载体，利用病毒介导的基因沉默技术，抑制了GhCML41在棉花中的表达。对基因沉默植株接种棉花黄萎病病原菌Vd080孢子悬浮液后，沉默植物表现更感病，通过机理研究发现，沉默植株中木质部和胼胝质的合成下降，NO含量减少，SA减少，JA含量上升，部分防御基因的下调。转GhCML41基因拟南芥显示出较强黄萎病抗性。因此，本发明基因GhCML41与棉花抗黄萎病呈正相关，基因GhCML41可应用于棉花抗病育种中。

附图说明

图1显示病原菌胁迫下基因GhCML41在抗/感病品种中的表达情况；

图2显示基因沉默后的棉花叶片的白化现象及发病情况；

图3显示基因沉默后植株木质部的积累情况；

图4显示基因沉默后植株叶片胼胝质的积累情况；

图5显示基因沉默后植株叶片水杨酸积累情况；

图6显示基因沉默后植株叶片茉莉酸积累情况；

图7显示基因沉默后植株叶片NO积累情况；

图8显示病菌处理后植株中相关防御基因的相对表达量的变化情况；

图9显示转GhCML41基因拟南芥的筛选；

图10显示转GhCML41基因拟南芥抗病性鉴定情况。

具体实施方式

实施例1获取棉花基因GhCML41

以抗病品种中植棉2号和感病品种冀棉11号为植物材料，接种棉花黄萎病病原菌Vd080后，提取棉花全蛋白，以不接种病原菌的棉花为空白对照。通过磷酸化蛋白组学分析发现，基因ID号为Gh_A11G1729的蛋白在接菌的棉花上发生了明显的磷酸化，而未接菌的棉花上则没有发生磷酸化，且在抗病品种的磷酸化水平为感病品种的1.5倍。经比对，将该基因命名为GhCML41。

实施例2病原菌处理后棉花中GhCML41的表达

在蛭石沙土纸钵中种植棉花抗病品种中植棉2号和感病品种冀棉11号，伤根后接种Vd080孢子悬浮液，不同时间段提取根部RNA。

根据GhCML41的基因序列和CDS序列设计其荧光定量的引物为：

GhCML41-F:GGACCATCATCAACACCA，

GhCML41-R:CGTCGAAATAGCCAAAGA。

检测在病原菌处理后，GhCML41基因的表达情况。

如图1中A所示，在抗病品种中，相较于未接菌的植株，接菌的植株中的GhCML41基因表达量显著提高，尤其在接菌后3h，表达量最大；如图1中B所示GhCML41基因在抗病品种中植棉2号中的表达水平显著高于感病品种冀棉11号，并且在接菌后6h，表达量最大，表明GhCML41基因在抗病品种中更容易被病原菌诱导表达，而在感病品种中则表达量较低，进一步说明其与棉花黄萎病抗病性相关。

实施例3利用病毒介导的基因沉默技术(VIGS)研究GhCML41的功能

1.棉花中GhCML41基因的沉默

根据VIGS引物设计原则设计GhCML41沉默载体的引物：

CML41-VIGS-F:CGGAATTCCTCCTGGACCATCATCAA，

CML41-VIGS-R:GCTCGAGATCATCCTTGCTGGGTTC。

以抗病品种中植棉2号的cDNA为模板扩增沉默片段并转化pYL-156载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序验证正确后，提取pYL-156-GhCML41质粒，并转化农杆菌GV3101感受态，菌落PCR验证正确后，扩大培养，以pYL-156空载为对照，以pYL-156-PDS为正对照(PDS基因被沉默后，叶片表现出白化现象)，与辅助质粒pYL-192为混合静置后，用无针头注射器注射中植棉2号棉花叶片。注射处理后暗培养24h，置于正常光照下22℃培养。待正对照出现白化表型时，利用荧光定量PCR检测沉默植株中GhCML41的表达量，选取沉默效果较好的植株进行进一步试验。

2.沉默植株的抗病性研究

选取沉默效果较好的植株，待一片真叶初现时，接种10mL大丽轮枝菌孢子液(浓度为2×10⁷CFU/mL)，置于25℃温室中正常光照生长。取接菌后1、3、6、12、24、48小时叶片，检测棉花叶片中水杨酸、茉莉酸、NO、H₂O₂含量。2d时，检测棉花茎秆木质部和叶片胼胝质的积累，20d时，调查植株发病情况。

如图2所示，统计病情后计算得沉默植株的病情指数为45.31±2.38，病株率为87.50±5.17％，而对照的病情指数为22.73±4.21，病株率为59.01±3.52％，沉默植株与对照之间的病情指数和病株率均存在极显著差异。

将棉花幼苗茎秆用间苯三酚染色，浓硫酸孵育后，在正视显微镜下观察。如图3所示，接菌后沉默植株的木质部的积累显著低于非沉默植株。

利用苯胺蓝染色棉花叶片，紫外激发光下观察胼胝质的积累量情况。如图4所示，沉默植株的胼胝质的积累量低于对照。

考察基因沉默后植株叶片水杨酸积累情况。如图5所示，TRV:GhCML41植株中水杨酸含量相较于TRV:00植株出现了下降，在接菌后3h达到了峰值。

考察基因沉默后植株叶片茉莉酸积累情况。如图6所示，在沉默GhCML41基因后，与抗病呈负相关的植物茉莉酸含量升高。

考察基因沉默后植株叶片NO积累情况。如图7所示，沉默GhCML41基因后，NO的含量明显小于对照TRV:00。

接菌后不同时间段取样提取沉默植株RNA用于表1中检测接种病菌后的不同时间段沉默植株中的防御酶基因或防御酶代谢基因的表达量，如多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟基化酶(C4H1)、病程相关基因(PR1)、过敏致病性蛋白诱导蛋白(HIN1)、病程相关基因非表达子(NPR1)和一氧化氮相关蛋白基因(NOA1)。

表1棉花防御相关基因的RT-qPCR引物

如图8所示，与对照相比，TRV:GhCML41植株中PAL、POD、PPO、C4H1、PR1、HIN1、NPR1和NOA1的表达都下调。其中，与木质素合成的相关基因(PAL、POD、PPO、C4H1)在抗病的关键时期6h表达量显著下降。此外，PR1在12h显著下调。HIN1在6h显著下调，NPR1在6h表达量下降，以及NOA1在6h显著下调。因此，在沉默GhCML41基因后，棉苗防御相关基因的表达量也相应降低，表明GhCML41基因参与棉株的防御体系信号的传递。

实施例4转GhCML41基因拟南芥的获得及抗病性鉴定

1.获得转GhCML41基因拟南芥

将扩增的GhCML41基因片段与pCAMBIA2300载体连接后转化大肠杆菌DH5α，挑斑摇菌送测序，提取测序正确的菌液质粒pCAMBIA2300-GhCML41，并转化农杆菌GV3101感受态，菌落PCR验证正确后，扩大培养，至OD600＝1.0-1.5，将菌液于6000rpm，离心10min，舍弃上清，收集菌体，用表2中重悬液重悬菌体，并加入1/3体积的Silwet，将拟南芥的花苞浸泡在重悬后的菌液中1min，避光处理24h，之后在22℃，正常光照下继续培养，直至收获种子。将经过蘸花法转化GhCML41基因的拟南芥作为T0代，其所收取的种子为T1代，用抗性MS培养基进行筛选，在人工培养箱中培养两周以后，将生长正常的绿色阳性T1代幼苗，移栽到土中继续生长，直到收获T2代种子，每颗拟南芥单独收取种子。按照上述方法，以此类推，直至收获T3代拟南芥种子。

表2重悬夜配方

2.转GhCML41基因拟南芥的抗病性鉴定

给野生型拟南芥WT以及转GhCML41基因的拟南芥根部接种大丽轮枝菌Vd080，三周后，观察转基因拟南芥发病情况。

如图9所示，阳性植株为绿色，而阴性植株为黄色。如图10所示，接菌的拟南芥叶片开始出现变黄、枯萎的症状，而转基因拟南芥相较于野生型，叶片萎蔫的程度较轻，发病程度轻，表明GhCML41基因增强了拟南芥对于棉花黄萎病的抗性。