阅读说明：本技术 小疣刺参促***短肽及其编码基因与应用 (Ovulation-promoting short peptide of stichopus parviflora as well as coding gene and application thereof ) 是由 陈廷 任春华 吴菲菲 称楚航 江晓 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了小疣刺参促排卵短肽及其编码基因与应用。本发明首次从小疣刺参卵巢克隆到小疣刺参cubifrin基因的开放读码框,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其编码cubifrin前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。其编码的3种衍生NG小肽NGIWY、NGFWY和NGLWY的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。NGIWY、NGFWY和NGLWY可作为刺激小疣刺参雌参排卵的短肽应用于小疣刺参人工育苗。(The invention discloses an ovulation-promoting short peptide of stichopus parviflora and a coding gene and application thereof. The invention clones the open reading frame of the cubifrin gene from the ovary of the stichopus parvitus for the first time, the nucleotide sequence of the open reading frame is shown as SEQ ID NO.1, and the amino acid sequence of the encoded cubifrin precursor protein is shown as SEQ ID NO. 2. The amino acid sequences of the 3 kinds of derived NG small peptides NGIWY, NGFWY and NGLWY coded by the polypeptide are shown in SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 and SEQ ID NO. 5. NGIWY, NGFWY and NGLWY can be used as short peptide for stimulating ovulation of Stichopus japonicus selenka for artificial breeding of Stichopus japonicus selenka.)

小疣刺参促***短肽及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小疣刺参促***短肽及其编码基因与应用。

背景技术

小疣刺参(Stichopus monotuberculatus)俗称“黄肉参”，是我国热带海参中具有代表性的高经济价值种类，不仅可食用，亦可作为化妆品和医药的原料。

小疣刺参的人工育苗近几年获得初步成功，主要是采用阴干流水法进行催产，该方法对小疣刺参雄参的催产效果较好，但采用该方法雌参的***比例较低，再加上小疣刺参******存在月相规律，即仅在每年阴历5-8月初一左右的一两天可催产成功，阻碍了小疣海参的产业化人工养殖。因此，迫切需要一种高效的小疣刺参催产方法。

棘皮动物NGIWYamide(NG小肽)最初是从仿刺参的放射状神经索和神经环中分离获得的，是一种结构上类似于脊椎动物NG肽的神经肽，它可诱导仿刺参的体壁和肠道肌肉收缩，刺激海星的管足活动和紫海胆的管足和食道收缩。由于注射NG小肽后会使仿刺参头部发生摆动，因此将其前体蛋白命名为cubifrin。研究发现，注射NG小肽，可以刺激仿刺参***的发生和成熟。然而，目前尚无小疣刺参cubifrin基因序列及其衍生小肽的相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种小疣刺参促***短肽及其编码基因与应用。

为实现上述发明目的，本发明以本课题组构建的小疣刺参卵巢转录组文库中cubifrin基因的转录本序列为基础，通过RT-PCR扩增获得cubifrin基因的开放读码框(ORF)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码cubifrin前体蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。该基因的前体蛋白包含5个NG小肽(NGIWY、NGFWY、NGIWY、NGIWY和NGLWY)(图1)，翻译后可加工形成3种衍生NG小肽：NGIWY、NGFWY和NGLWY，其氨基酸序列如分别如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。由于cubifrin基因的NG小肽可刺激海参***的发生和成熟，因此，NGIWY、NGFWY和NGLWY可作为刺激小疣刺参雌参***的短肽应用于小疣刺参人工育苗。

本发明还提供了一种重组表达载体，其含有上述的小疣刺参cubifrin基因，所述的小疣刺参cubifrin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的重组表达载体。

本发明还提供了一种刺激小疣刺参雌参***的试剂，其包含有上述的衍生NG小肽中的NGIWY、NGFWY和/或NGLWY。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明首次披露了小疣刺参cubifrin基因序列及其编码蛋白和衍生NG小肽的相关研究，发现小疣刺参cubifrin基因的前体蛋白包含5个NG小肽(NGIWY、NGFWY、NGIWY、NGIWY和NGLWY)，翻译后可加工形成3种衍生NG小肽：NGIWY、NGFWY和NGLWY。与仿刺参、糙海参和玉足海参的cubifrin基因的NG小肽相比，NGFWY和NGLWY为小疣刺参所特有。所述的NGIWY、NGFWY和NGLWY可作为刺激小疣刺参雌参***的短肽应用于小疣刺参人工育苗。

附图说明

图1为小疣刺参cubifrin基因的核苷酸序列及其编码蛋白。

图2为四种海参cubifrin前体蛋白翻译后加工形成的衍生NG小肽序列比对。

图3为小疣刺参cubifrin前体蛋白3个衍生NG小肽对对小疣刺参***的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1：小疣刺参cubifrin基因的cDNA克隆及测序

1、小疣刺参卵巢总RNA的提取及第一链cDNA的合成

以小疣刺参卵巢组织为材料，采用Trizol法(Invitrogen)提取总RNA。以总RNA为模板，使用PrimeScript^TMRT Kit(TaKaRa)进行反转录PCR，获得第一链cDNA。

2、小疣刺参cubifrin基因的cDNA克隆及NG小肽分析

2.1小疣刺参cubifrin基因的cDNA克隆

2.1.1引物设计

以已构建的小疣刺参卵巢转录组文库中的cubifrin转录本序列为基础，设计上游引物(5’-ATGGCGGTAGAAGCAAAG-3’)和下游引物(5’-TTACATCACCTCGTCTGT-3’)。

2.1.2 PCR扩增

以第一链cDNA为模板，使用上述上游引物和下游引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：rTaq mixture(TaKaRa)12.5μL，cDNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，灭菌水9.5μL，共25μL；PCR反应程序为：94℃3分钟预变性；30个循环：94℃15秒变性，56℃15秒复性，72℃1分钟延伸；72℃3分钟最后延伸。

2.1.3 cubifrin cDNA扩增片段的克隆及测序

将2.1.2PCR扩增获得的产物(cubifrin cDNA扩增片段)在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物)对琼脂糖凝胶电泳中的目的条带进行回收，使用pMD18-T Ligation Kit(TaKaRa)对cubifrin cDNA扩增片段进行TA克隆。使用热休克法用上述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，扩大培养并提取质粒进行测序。

结果显示，小疣刺参的cubifrin基因的开放读码框(ORF)为723bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码240个氨基酸(图1)，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.2小疣刺参cubifrin基因的NG小肽分析

对小疣刺参cubifrin基因的氨基酸序列进行分析，结果显示，小疣刺参cubifrin基因的前体蛋白包含5个NG小肽(NGIWY、NGFWY、NGIWY、NGIWY和NGLWY)(图1)，通过NeuroPred software(http://stagbeetle.animal.uiuc.edu/cgi-bin/neuropred.py)预测，cubifrin基因翻译后可加工形成3种衍生NG小肽：NGIWY、NGFWY和NGLWY，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。与仿刺参、糙海参和玉足海参的cubifrin基因的NG小肽相比，NGFWY和NGLWY为小疣刺参所特有(图2)。

3.小疣刺参cubifrin 3个衍生NG小肽对小疣刺参雌参***作用的影响实验

小疣刺参cubifrin 3个衍生NG小肽NGIWY、NGFWY和NGLWY由上海生工公司合成，并溶解于0.9％生理盐水。将150头小疣刺参随机分为5组(30头海参/组)，即对照组、阴干流水法处理组、NGIWY注射组、NGFWY注射组和NGLWY注射组，其中3个NG小肽组的注射量均为6.5ng/g体重，而对照组和阴干流水法处理组均注射0.9％生理盐水。采用1mL常规注射器，将100μL生理盐水或NG小肽穿过体表，注射到海参体腔中。注射后将海参放置于1m³海水缸，观察48小时，统计***个体数量。如图3所示，不催产、阴干流水法、NGIWY注射、NGFWY注射和NGLWY注射组小疣海参***比例分别为0％、3.3％、13.3％、26.7％和10％(图3)。结果表明，注射NGIWY、NGFWY、NGLWY均能刺激小疣刺参***，可作为刺激小疣刺参雌参***的短肽应用于小疣刺参人工育苗。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 小疣刺参促***短肽及其编码基因与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 723

<212> DNA

<213> 小疣刺参(Stichopus monotuberculatus)

<400> 1

atggcggtag aagcaaagat attcagctgt atagtttgta tatggttaac atcaacggta 60

tattgtcaaa cgatcacagg gagacctcat gactacggag aactttctaa ggcagtggac 120

aggtttttga atatactcat agaagaagaa gactttgata atgatgatag taaactagaa 180

tcttgggaaa ctttactaaa agaggatata aatccaaagt tgaaaatact tgcccacgtg 240

atgagatcac tcagttcaac aacgcaggat acgtcatcat tacgtgagca agtacttccg 300

aatggctaca tttctaggta tcttcaagcc tttctaacag actacgaaca gcctttctgg 360

gaggactcat catcaaaaca acttccatcc ttgcaaagcc cagaacttga tcaaataatg 420

acaggggaga ggaataattt ttggtctgat actttccatg aaatccccga cgaactgtcg 480

gccacgggag gcgaaagcga aaagaggaac ggcatctggt acgggaagag ggcgccgtcc 540

gataacacgg cggaagaaca gatgaagcgg aacggtttct ggtatggcaa acggagtagt 600

cccgcagata aacggaacgg tatctggtac ggtaagagga acggtatctg gtacgggaag 660

agaaatggcc tctggtatgg gaaaagggat gacggtagct tgtatacaga cgaggtgatg 720

taa 723

<210> 2

<211> 240

<212> PRT

<213> 小疣刺参(Stichopus monotuberculatus)

<400> 2

Met Ala Val Glu Ala Lys Ile Phe Ser Cys Ile Val Cys Ile Trp Leu

1 5 10 15

Thr Ser Thr Val Tyr Cys Gln Thr Ile Thr Gly Arg Pro His Asp Tyr

20 25 30

Gly Glu Leu Ser Lys Ala Val Asp Arg Phe Leu Asn Ile Leu Ile Glu

35 40 45

Glu Glu Asp Phe Asp Asn Asp Asp Ser Lys Leu Glu Ser Trp Glu Thr

50 55 60

Leu Leu Lys Glu Asp Ile Asn Pro Lys Leu Lys Ile Leu Ala His Val

65 70 75 80

Met Arg Ser Leu Ser Ser Thr Thr Gln Asp Thr Ser Ser Leu Arg Glu

85 90 95

Gln Val Leu Pro Asn Gly Tyr Ile Ser Arg Tyr Leu Gln Ala Phe Leu

100 105 110

Thr Asp Tyr Glu Gln Pro Phe Trp Glu Asp Ser Ser Ser Lys Gln Leu

115 120 125

Pro Ser Leu Gln Ser Pro Glu Leu Asp Gln Ile Met Thr Gly Glu Arg

130 135 140

Asn Asn Phe Trp Ser Asp Thr Phe His Glu Ile Pro Asp Glu Leu Ser

145 150 155 160

Ala Thr Gly Gly Glu Ser Glu Lys Arg Asn Gly Ile Trp Tyr Gly Lys

165 170 175

Arg Ala Pro Ser Asp Asn Thr Ala Glu Glu Gln Met Lys Arg Asn Gly

180 185 190

Phe Trp Tyr Gly Lys Arg Ser Ser Pro Ala Asp Lys Arg Asn Gly Ile

195 200 205

Trp Tyr Gly Lys Arg Asn Gly Ile Trp Tyr Gly Lys Arg Asn Gly Leu

210 215 220

Trp Tyr Gly Lys Arg Asp Asp Gly Ser Leu Tyr Thr Asp Glu Val Met

225 230 235 240

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 小疣刺参(Stichopus monotuberculatus)

<400> 3

Asn Gly Ile Trp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 小疣刺参(Stichopus monotuberculatus)

<400> 4

Asn Gly Phe Trp Tyr

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 小疣刺参(Stichopus monotuberculatus)

<400> 5

Asn Gly Leu Trp Tyr

1 5