一种环状rna的检测方法及其在成体神经干细胞鉴定中的应用
阅读说明：本技术 一种环状rna的检测方法及其在成体神经干细胞鉴定中的应用 (Detection method of circular RNA and application of circular RNA in adult neural stem cell identification ) 是由 王雪 谢方 钱令嘉 赵云 宋子甜 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：一种环状RNA的检测方法及其在成体神经干细胞鉴定中的应用。本发明提供一种circ-NSC基因、该基因制备鉴定成体干细胞的试剂中的应用及检测该基因的试剂盒,其中,所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；所述试剂盒包括：DNA聚合酶、缓冲液、去离子水、扩增引物对,所述扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。本发明通过高通量RNA测序技术,鉴定出在SVZ区表达的circRNAs,获得circRNAs的全长序列,通过功能预测发现circ-NSC序列上存在2个miR-138-5p的可能结合位点,提示该circRNA可能通过竞争性结合miR-138-5p发挥NSC调控作用,根据circ-NSC的序列设计了特异性扩增引物对,通过PCR实验验证了circ-NSC在SVZ中特异性表达,提示其在NSC的鉴定中具有一定应用价值。(A method for detecting circular RNA and application thereof in adult neural stem cell identification. The invention provides a circ-NSC gene, application of the gene in preparing a reagent for identifying adult stem cells and a kit for detecting the gene, wherein the cDNA sequence of the gene is shown as SEQ ID NO. 1; the kit comprises: DNA polymerase, buffer solution, deionized water and an amplification primer pair, wherein the nucleotide sequence of the amplification primer pair is shown as SEQ ID NO. 2 and SEQ ID NO. 3. According to the invention, the circRNAs expressed in the SVZ region are identified by a high-throughput RNA sequencing technology, the full-length sequence of the circRNAs is obtained, 2 possible binding sites of miR-138-5p exist on the circ-NSC sequence through function prediction, the circRNA is prompted to play an NSC regulation function by competitively binding miR-138-5p, a specific amplification primer pair is designed according to the sequence of the circ-NSC, the specific expression of the circ-NSC in the SVZ is verified through a PCR experiment, and the circ-NSC is prompted to have a certain application value in the identification of the NSC.)
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种环状RNA的检测方法及其在成体神经干细胞鉴定中的应用。
背景技术
神经干细胞(neuron stem cell,NSC)是指具有长期自我更新和多向分化潜能的极少量的一群细胞。1992年，Reynolds和Richards先后从成年鼠的纹状体和海马中分离出神经干细胞，并证实其可以分化成为神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞。后续研究发现，成年哺乳动物大脑中神经干细胞主要存在于脑室下区(subventricular zone,SVZ)和海马齿状回颗粒下区(subgranular zone,SGZ)。国内外研究表明，在脑损伤后，SVZ等区域的NSC会被激活，增殖并迁移到损伤部位，并分化成相应的神经细胞，以实现结构和功能的代偿。近年来，NSC移植在神经系统疾病的治疗中引起了越来越广泛的关注，即将病人自身的体细胞在体外通过重编程形成NSC，再移植回病人脑内，从而达到治疗目的。目前，已有较多的动物和临床前实验探究了NSC移植在帕金森病、阿尔兹海默病、缺血性脑卒中等神经系统疾病中的应用价值。因此，准确有效的鉴定NSC显得尤为重要。NSC在形态上与其他细胞没有明显差异，目前主要通过生物标志物对NSC进行鉴定，常用标志物有CD133、Nestin、Sox2等。这些分子虽然在NSC中高表达，但在其他神经细胞或其他组织干细胞中也有表达，特异性较弱。因此发现新的NSC特异性标志物对NSC的鉴定具有关键作用。
环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类特殊的非编码RNA，单链RNA分子通过共价结合形成环状结构，不具有5’末端帽子和3’末端polyA尾结构。circRNA广泛存在于真核细胞中，部分circRNA的表达水平甚至比mRNA高10倍以上。circRNA的环状结构使其不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定。此外，circRNA还具有高度保守性和组织特异性。最初，circRNA被认为是错误剪接或剪接过程中产生的副产物，不具有生物学学功能。但近年来的研究表明circRNA可以通过结合miRNA或蛋白质，在转录或转录后水平发挥重要调控作用，参与多种生理病理过程。有研究发现circRNA在神经系统疾病的发生发展中发挥了重要功能。而且，我们前期通过RNA测序发现在NSC中存在特异性表达的circRNA。目前鉴定NSC常用的生物标志物CD133、Nestin、Sox2等，具有特异性较弱的缺点，相比之下circRNA具有高表达、高保守、高稳定和高度组织特异性等特征，可能成为理想的NSC鉴定的生物标志物。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种circ-NSC基因，该基因可作为鉴定成体神经干细胞的生物标志物。
本发明首先提供一种circ-NSC基因，其特征在于，所述基因的cDNA序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明还提供上述circ-NSC基因用于制备鉴定成体干细胞的试剂中的应用。
此外，本发明还提供一种检测上述circ-NSC基因的试剂盒，所述试剂盒包括：DNA聚合酶、缓冲液、去离子水、扩增引物对，所述扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示。
在本发明中，我们通过高通量RNA测序技术，鉴定出在SVZ区表达的circRNAs，获得circRNAs的全长序列。通过功能预测，发现rat_circ:chr15:9915223-9915671的序列上存在2个miR-138-5p的可能结合位点，提示该circRNA可能通过竞争性结合miR-138-5p发挥NSC调控作用，并将其命名为circ-NSC。我们还根据circ-NSC的序列设计了特异性扩增引物对，通过PCR实验验证了circ-NSC在SVZ中特异性表达，提示其在NSC的鉴定中具有一定应用价值。
附图说明
图1：SVZ特异性circRNA在SVZ中的表达水平(P<0.05)；
图2：RNA测序结果中circ-NSC在不同脑区中的表达水平；
图3：PCR检测circ-NSC在不同脑区中的表达。
具体实施方式
下面结合附图，对实施例作详细说明。
实施例1：大鼠脑组织取材
(1)采用重140-180g的雄性成年SD大鼠。
(2)配置1％戊巴比妥钠溶液，按照50mg/kg对大鼠进行腹腔麻醉，等待其进入深麻醉状态，并且对伤害性夹持无反应后，使用眼科剪环颈部剪开皮肤，并使用组织剪迅速离断头部后配合咬骨钳自枕骨大孔处剪开颅骨，暴露脑组织，使用玻璃分针离断视神经后小心将脑取出。
(3)脑室下区(subventricular zone,SVZ)为成年哺乳动物神经干细胞主要富集区，分离大鼠脑内此区域。将大脑约1/2处横断，保留前脑(近嗅球端)，沿中线分为两半。将半脑外侧面朝下，用一只镊子固定，另一只镊子去除剩余的海马、SVZ内侧壁，见SVZ外侧壁呈月牙型，上下侧与白质相连，界限清晰。分离之，去除四周的白质纤维，取出置于无菌的2mL冻存管中。另外，在皮层区(cortex,CTX)取一小块组织作为阴性对照。组织置于-80度冰箱保存。
实施例2：RNA提取
(1)组织经液氮速冻后砸碎，放入1.5mL Eppendorf管中，加入1mL Trizol，4℃旋转裂解过夜。
(2)加入200μL三氯甲烷，用力摇晃15sec，静置3min。
(3)离心，4℃，12,000g×15min。
(4)轻轻吸取最上层至新的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，轻轻摇晃，静置10min。
(5)离心，4℃，12,000g×10min。
(6)弃去上清，加入1mL 75％乙醇洗涤，将沉淀轻轻吹起，勿吹散。
(7)离心，4℃，12,000g×5min。
(8)吸去上清，干燥RNA 5～10min至沉淀透明，加入适量DEPC水，溶解RNA。
(9)取2μL RNA利用超微量分光光度计检进行RNA定量和质检，A260/A280＞1.8；电泳检测，未降解，则RNA质量合格。
实施例3：RNA测序测序平台为illumina X-ten，测序方式为PE150。简要操作流程如下：
(1)对抽提的总RNA，利用去核糖体试剂盒将核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)去除，其次使用RNase R去除样品中的线性RNA，最后为标准的双末端文库制备，即片段化RNA后，反转录合成cDNA，末端修复并加接头引物后使用PCR扩增后纯化，再质检筛选出合适大小的文库，最后上机测序。
(2)获得原始测序数据(Raw Data)后，首先需要对数据进行过滤、去接头序列以及对低质量reads进行处理，再对测序质量进行评估，以及核糖体RNA去除，获得高质量数据(Clean Data)。并将Clean Data与参考基因组进行不包含融合基金(unfusion)比对，得到无法直接比对到基因组上的unmapped reads。再将unmapped reads与参考基因组进行融合基因(fusion)比对，从fusion比对结果筛选出符合外显子环状RNA结构的候选的剪接位置的Black-Splicedjunction reads，过滤掉不符合剪接位点序列特征的结果，从而鉴定环状RNA。接下来对环状RNA进行注释、预测序列、计算表达水平并绘制热图、进行聚类等后续分析。
实施例4：筛选NSC特异表达circRNA
(1)首先分析了circRNA的表达值。circRNA表达值是以预测的circRNA序列为基础，并通过统计circRNA反向剪接位点的junction reads数，并计算其SRPBM得到。SRPBM值的计算公式为：
(2)为进一步找出NSC中特异表达的circRNA，我们比较了SVZ和CTX中的circRNA的表达水平。结果显示有41个circRNA仅在SVZ中检测到表达，在CTX中无表达(图1&图2)。其中仅5个circRNA的SRPBM值大于1。
(3)已有研究表明，“微小RNA海绵(microRNA sponge)”是circRNA发挥生物学功能的最主要的机制，即circRNA通过竞争性结合microRNA，拮抗microRNA的作用，进而调控下游基因表达。分析circRNA可能结合的microRNA，对circRNA的生物学功能具有重要提示作用。于是我们对在SVZ中特异表达、序列长度<1000nt且SRPBM>1的circRNA进行microRNA结合位点预测分析，结果显示rat_circ:chr15:9941508-9942116和rat_circ:chr15:9915223-9915671分别含有多个microRNA可能结合的位点(表1)。其中，rat_circ:chr15:9915223-9915671的序列上存在2个miR-138-5p的结合位点。已有研究发现miR-138-5p能够抑制NSC的增殖并促进其分化，在NSC调控中发挥了重要作用。以上结果提示此circRNA可能通过竞争性结合miR-138-5p发挥NSC调控作用。我们将rat_circ:chr15:9915223-9915671命名为circ-NSC。
表1.circRNA与microRNA的预测结合位点
实施例5：circ-NSC在成体神经干细胞体外鉴定中的应用
(1)提取NSC的RNA(步骤同实施例2：RNA提取)。
(2)逆转录获得cDNA，具体步骤如下：
a.按下述体系配制反应溶液I：
b.在冰上配制反应溶液II，下述体系为单个反转录体系用量。
c.利用PCR仪或水浴锅进行逆转录反应。将溶液I置于70℃反应5min，立即放入冰水混合物，静止2min。
d.待溶液I完全冷却后，加入溶液II，轻轻混匀。置于37℃反应60min，70℃反应10min，获得cDNA。
(3)利用circRNA-NSC特异性引物进行PCR反应：
a.根据circ-NSC序列及接口位置设计PCR引物。
circ-NSC的RNA序列SEQ ID NO:1：
>rat_circ:chr15:9915223-915671
GATTAACAGCACTGGATTTGGAGATGACCGCTGCCCCAGAACCCTAAGCTGAGCAGCTGACCAACCCCAGCATCCTTCCTGTTATCTGCAAAGCAAAATGGGAGACAGAGAGCCCCTGCTGGGAGGAAGCCAGGTCAGCAGGTGAACCTGCTTGCTTTCGACAGGACCTTATTCAGCCTGTTTGCCCGCACCTGTCCCCTTCCGTGTGCTTCTGGACCTGTAGTGATGTGTGTCCGCCCTGGAGCACTTGCCCTTCAGTGAAGCCTGAAGCATGAGCAGCAGCAGCCACGCATGCCCAGTCCCGGCAGTGCGTGGACACATGACTCACTACCCAGCTGCCCCCTACCCATTGCTGTTCCCACCTGTCATTGGAGGACTCTCCCTGCCACCACTCCATGGGCTCCATGGCCACCCACCTCCCAGTGGATGCAGCACCCCATCACCAGCCAPCR所用引物序列：
SEQ ID NO:2:
rat circ-NSC forward primer:5’-ACCCCATCACCAGCCAGATT-3’
SEQ ID NO:3:
rat circ-NSC reverse primer:5’-GTCGAAAGCAAGCAGGTTCAC-3’
产物长度：178bp
退火温度60℃
b.以逆转录获得的cDNA为模板，按下述体系配置PCR反应溶液：
c.在PCR仪中按如下程序进行PCR反应：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共进行40个循环；最后72℃反应10min。PCR产物置于-20度冰箱保存。
(4)利用琼脂糖凝胶电泳检测NSC中circ-NSC的表达：
a.称取2g琼脂糖放入锥形瓶，并倒入100mL 1×TAE缓冲液，放入微波炉中加热至沸腾，拿出锥形瓶轻轻摇晃，再次加热至沸腾，重复2～3次，至琼脂糖完全溶解，配置浓度为2％的DNA凝胶。
b.用流动水冲洗瓶身，加速溶液冷却。待溶液冷却至60℃左右，加入10μL溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)，轻轻晃动，使EB均匀分散在溶液中，且避免产生气泡。
c.在胶槽一侧***小孔梳子，从另一侧轻轻倒入配好的溶液，迅速去除气泡。
d.室温放置15～30min，待凝胶完全凝固后，慢慢拔下梳子，取出凝胶放入DNA电泳槽，有孔一侧朝向负极。
e.电泳槽中加入适量1×TAE溶液，没过凝胶，将孔中的气泡轻轻赶出。用微量移液器向孔中加入上述PCR产物10μL/孔、DNA marker 5μL/孔。
f.接通电源，以120V电压至溴酚蓝跑至凝胶2/3处，停止电泳。通过凝胶成像仪在紫外光源下观察条带并记录(图3)。
此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种环状RNA的检测方法及其在成体神经干细胞鉴定中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 449
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 1
gattaacagc actggatttg gagatgaccg ctgccccaga accctaagct gagcagctga 60
ccaaccccag catccttcct gttatctgca aagcaaaatg ggagacagag agcccctgct 120
gggaggaagc caggtcagca ggtgaacctg cttgctttcg acaggacctt attcagcctg 180
tttgcccgca cctgtcccct tccgtgtgct tctggacctg tagtgatgtg tgtccgccct 240
ggagcacttg cccttcagtg aagcctgaag catgagcagc agcagccacg catgcccagt 300
cccggcagtg cgtggacaca tgactcacta cccagctgcc ccctacccat tgctgttccc 360
acctgtcatt ggaggactct ccctgccacc actccatggg ctccatggcc acccacctcc 420
cagtggatgc agcaccccat caccagcca 449
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accccatcac cagccagatt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgaaagca agcaggttca c 21