阅读说明：本技术 一种提高粘质沙雷氏菌抗酸胁迫能力的方法 (Method for improving acid stress resistance of serratia marcescens ) 是由 饶志明 孙长皓 潘学玮 杨套伟 徐美娟 张显 邵明龙 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高粘质沙雷氏菌抗酸胁迫能力的方法,属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明通过在粘质沙雷氏菌中过量表达DNA结合蛋白XrpA显著提高了粘质沙雷氏菌的抗酸胁迫能力；将利用本发明的方法制备得到的重组粘质沙雷氏菌在pH为4.0的环境下培养12h后的存活率为野生型粘质沙雷氏菌的1.4倍。(The invention discloses a method for improving acid stress resistance of serratia marcescens, and belongs to the technical field of genetic engineering and microbial engineering. The acid stress resistance of the serratia marcescens is obviously improved by over-expressing the DNA binding protein XrpA in the serratia marcescens; the survival rate of the recombinant serratia marcescens prepared by the method of the invention after being cultured for 12 hours in the environment with pH of 4.0 is 1.4 times of that of wild serratia marcescens.)

一种提高粘质沙雷氏菌抗酸胁迫能力的方法

技术领域

本发明涉及一种提高粘质沙雷氏菌抗酸胁迫能力的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是一株重要的工业菌株，常常被用来生产灵菌红素和2，3-丁二醇等在制备食品、药品以及日化产品中具有广泛应用的发酵产品，具有广阔的市场前景。

但是，在粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的发酵生产过程中，不可避免的面临着来自外界环境的多种如酸胁迫、乙醇胁迫、氧胁迫、盐胁迫等的环境胁迫，这些环境胁迫均严重影响了粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的生理活性，进而严重限制了粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的发酵性能。

在粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)面临的众多环境胁迫中，酸胁迫最为严重。酸胁迫是由粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)分泌到胞外的乳酸、乙酸等有机酸积累造成的，由于胞内的pH通常较胞外的pH高，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质会通过被动扩散进入胞内，进入胞内的乳酸、乙酸等有机酸迅速解离，导致胞内pH快速降低，进而使得细胞面临严重的酸胁迫。

为维持粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的发酵性能，过去，工业上常常通过在粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵的过程中添加CaCO₃、NaOH等碱性物质来维持pH处于稳定的范围。

然而，碱性物质的添加往往会导致粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵过程中副产物的积累，这些副产物形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的生长与代谢。因此，急需找到效果更好的提高乳酸菌抗酸胁迫能力的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种提高粘质沙雷氏菌抗酸胁迫能力的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种提高粘质沙雷氏菌抗酸胁迫能力的方法，所述方法为在粘质沙雷氏菌中过量表达DNA结合蛋白XrpA；所述DNA结合蛋白XrpA是微生物细胞膜上用于识别和结合DNA的蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述DNA结合蛋白XrpA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述DNA结合蛋白XrpA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先将编码DNA结合蛋白XrpA的基因与表达载体连接以构建含有编码DNA结合蛋白XrpA的基因的重组质粒，再将重组质粒导入粘质沙雷氏菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pET-28a(+)质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先将编码DNA结合蛋白XrpA的基因与pET-28a(+)质粒用Ecor I、BamH I进行双酶切以得到酶切产物，然后将酶切产物进行连接以构建含有编码DNA结合蛋白XrpA的基因的重组质粒，最后将重组质粒导入粘质沙雷氏菌中

本发明还提供了一种重组粘质沙雷氏菌，所述重组粘质沙雷氏菌是利用上述一种提高粘质沙雷氏菌抗酸胁迫能力的方法制备得到的。

本发明还提供了一种生产灵菌红素的方法，所述方法为先将上述重组粘质沙雷氏菌接种至发酵培养基中进行培养，获得发酵液，然后从发酵液中提取获得灵菌红素。

本发明还提供了一种生产2，3-丁二醇的方法，其特征在于，所述方法为先将上述重组粘质沙雷氏菌接种至发酵培养基中进行培养，获得发酵液，然后从发酵液中提取获得2，3-丁二醇。

本发明还提供了上述一种提高粘质沙雷氏菌抗酸胁迫能力的方法或上述重组粘质沙雷氏菌或上述一种生产灵菌红素的方法或上述一种生产2，3-丁二醇的方法在制备食品、药品以及日化产品方面的应用。

[有益效果]

(1)本发明通过在粘质沙雷氏菌中过量表达DNA结合蛋白XrpA显著提高了粘质沙雷氏菌的抗酸胁迫能力；将利用本发明的方法制备得到的重组粘质沙雷氏菌在pH为4.0的环境下培养12h后的存活率为野生型粘质沙雷氏菌的1.4倍。

(2)本发明通过在粘质沙雷氏菌中过量表达DNA结合蛋白XrpA，得到了抗酸胁迫能力显著提高的重组粘质沙雷氏菌；将本发明的重组粘质沙雷氏菌在pH为4.0的环境下培养12h后的存活率为野生型粘质沙雷氏菌的1.4倍。

(3)利用本发明的方法提高粘质沙雷氏菌的抗酸胁迫能力效果好，且不会对粘质沙雷氏菌本身的生长性能造成任何的影响，适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1：重组质粒pET-28a-xrpA的质粒图谱。

图2：重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpB、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpC和重组粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens/pET-28a-xrpD的生长曲线。

图3：重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA在pH为4的条件下的菌体生长情况。

图4：重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA在pH为5的条件下的菌体生长情况。

图5：重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA在pH为6的条件下的菌体生长情况。

图6：重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA在pH为7的条件下的菌体生长情况。

图7：重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA在pH为4的条件下的生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的pET-28a(+)质粒购自Novagen公司；下述实施例中涉及的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)购自北纳生物，产品编号为BNCC336646。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠。

LB固体培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、20g/L琼脂。

实施例1：重组菌株的构建

具体步骤如下：

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的xrpA基因(xrpA基因是编码DNA结合蛋白XrpA的基因，DNA结合蛋白XrpA是微生物细胞膜上用于识别和结合DNA的蛋白，属于XRE家族)、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的xrpB基因(xrpB基因是编码XrpB的基因，XrpB是微生物细胞膜上用于识别和结合DNA的蛋白，属于XRE家族)、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的xrpC基因(xrpC基因是编码XrpC的基因，XrpC是微生物细胞膜上用于识别和结合DNA的蛋白，属于XRE家族)、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的xrpD基因(xrpD基因是编码XrpD的基因，XrpD是微生物细胞膜上用于识别和结合DNA的蛋白，属于LysR家族)；

(2)将合成得到的基因和pET-28a(+)质粒分别用表1中的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接；将获得的连接产物导入粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中；将转化后的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)划线于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，于30℃培养16h；挑取阳性转化子接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养12h，收集菌体，提取质粒，将质粒经表1中的限制性内切酶双酶切后进行电泳验证，并对质粒进行测序验证，验证正确，获得重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA(重组质粒pET-28a-xrpA的质粒图谱如图1所示)、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpB、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescenss/pET-28a-xrpC、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpD。

表1不同基因所使用的限制性内切酶

基因	限制性内切酶
		xrpA	Ecor I、BamH I
xrpB	Ecor I、BamH I
		xrpC	Ecor I、BamH I
xrpD	Ecor I、BamH I

实施例2：重组菌株的生长性能试验

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pET-28a(+)的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和实施例1得到的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpB、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescenss/pET-28a-xrpC、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpD分别划线于LB固体培养基上，于30℃培养16h；挑取阳性转化子接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养12h，获得种子液；将种子液分别接种于LB液体培养基中，控制起始OD₆₀₀＝0.1，于30℃、180rpm的条件下进行培养，每隔两小时从培养液中取样测定培养液的OD₆₀₀值，绘制生长曲线(见图2)。

结果如图2所示，经生长性能试验分析，重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescenss/pET-28a-xrpC的生物量和对照菌株没有太大差距，说明在粘质沙雷氏菌中过量表达XrpA和XrpC蛋白对菌株的生长性能没有影响，而重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpB、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpD的生物量明显低于对照菌株，说明在粘质沙雷氏菌中过量表达XrpB和XrpD蛋白会对菌株的生长造成抑制。

实施例3：重组菌株在酸胁迫条件下的耐受性试验

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pET-28a(+)的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和实施例1得到的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA、重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpC分别划线于LB固体培养基上，于30℃培养16h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养12h，获得种子液；将种子液按照1％(v/v)的接种量分别接种于LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养12h，获得培养液；收集部分培养液，离心收集细胞，将收集得到的细胞经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于与所收集的培养液等体积的pH为4.0(HCl调节)的LB液体培养基中，分别胁迫12h，获得菌悬液；收集部分菌悬液，离心收集细胞，将收集得到的细胞经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于与所收集的菌悬液等体积的生理盐水中，得到菌液；取200μL重悬液涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上测定活菌数和存活率(结果如表2所示)；

其中，存活率＝(N/N₀)×100％；

式中，N₀是未经酸胁迫处理的菌悬液在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上的活菌落数；N是胁迫12h后含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上长出的活菌落数。

由表2可知，经耐受性实验分析，在pH 4.0的LB液体培养基中胁迫12h后，重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA的存活率为对照的1.4倍，说明重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA对酸胁迫的耐受性显著提高；在pH 4.0的LB液体培养基中胁迫12h后，重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpC的的存活率仅为对照的0.9倍，说明重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpC对酸胁迫的耐受性未提高。这证明DNA结合蛋白XrpA能够调节细胞对渗透压胁迫的耐受能力，而其他蛋白不能。

表2酸胁迫对不同重组菌株存活率的影响

实施例4：重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA在酸胁迫条件下的生长性能试验

具体步骤如下：

1、平板实验

将仅含有空白质粒pET-28a(+)的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和实施例1得到的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA分别划线于LB固体培养基上，于30℃培养16h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养12h，获得一级种子液；将种子液按分别接种于LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养2h至对数生长期，获得二级种子液；测定二级种子液的菌体浓度并将二级种子液的OD₆₀₀值调节至0.8，以此为初始浓度，将OD600进行6次10倍梯度稀释，获得菌液；取1μL菌液分别点种在pH为4、5、6、7的LB固体培养基上，于30℃培养24h；24h后，观察菌体生长情况并拍照(菌体生长情况见图3-6)。

2、生长曲线

将仅含有空白质粒pET-28a(+)的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和实施例1得到的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA分别划线于LB固体培养基上，于30℃培养16h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养12h，获得种子液；将种子液接种至pH为4的LB液体培养基中，控制起始OD₆₀₀＝0.1，于30℃、180rpm的条件下进行培养，每隔两小时取样测定培养液中的OD₆₀₀值，绘制生长曲线(生长曲线见图7)。

由图3-7可知，在酸胁迫条件下，重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA的生长性能优于对照组，这进一步证明DNA结合蛋白XrpA能够调节细胞对渗透压胁迫的耐受能力。

实施例5：重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA在酸胁迫条件下的细胞活性

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pET-28a(+)的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和实施例1得到的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA分别划线于LB固体培养基上，于30℃培养16h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养12h，获得种子液；将种子液接种至pH为4的LB液体培养基中，控制起始OD₆₀₀＝0.1，于30℃、180rpm的条件下进行培养，每隔两小时取200μL涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，每个LB固体培养基上的菌落数控制在30～300个，于30℃培养12～24h，对形成的菌落计数并计算细胞活性(细胞活性见表3)；

细胞活性＝(M/M₀)×100％；

式中，M₀是在pH为4.0的LB液体培养基中培养0h后在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上的活菌落数；M是在pH为4.0的LB液体培养基中培养不同时间后在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上长出的活菌落数。

由表3可知，在酸胁迫条件下培养不同时间后，重组粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens/pET-28a-xrpA的细胞活性均优于对照组，说明，酸胁迫导致了粘质沙雷氏菌细胞活性的降低，而DNA结合蛋白XrpA能够提高酸胁迫下粘质沙雷氏菌的细胞活性。

表3不同重组粘质沙雷氏菌在pH为4的条件下胁迫不同时间后的细胞活性

实施例6：重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA在酸胁迫条件下的细胞膜完整性

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pET-28a(+)的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和实施例1得到的重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA分别划线于LB固体培养基上，于30℃培养16h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养12h，获得种子液；将种子液分别接种至LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养至OD₆₀₀＝1，得到培养液；将培养液离心收集细胞，用PBS缓冲液(NaCl 8.0g/L、KH₂PO₄0.2g/L、Na₂HPO₄·H₂O 2.9g/L、KCl 0.2g/L)清洗2次，分别重悬至等体积的LB液体培养基或pH为4.0的LB液体培养基中处理4h，得到待测菌液；将待测菌液的OD₆₀₀调节到0.8，吸取500μL，用PBS缓冲液洗涤2次，收集菌体后再用500μLPBS缓冲液重悬，得到重悬液A；向重悬液A中加入5μLPI染液立即避光反应5min，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2次，收集菌体后再用500μLPBS缓冲液重悬，得到重悬液B；重悬液B用流式细胞仪检测，在低流速下分析样品中的10000个细胞，用FlowJo软件进行数据分析细胞的细胞膜完整性。

分析发现：

(1)在LB液体培养基中，重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-Vector(对照)和重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA的细胞膜完整性分别为93.6％、96.1％，说明，在正常条件下两株菌的细胞完整性没有受到破坏；

(2)在pH为4.0的LB液体培养基中，重组粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens/pET-28a-Vector(对照)和重组粘质沙雷氏菌Serratia marcescens/pET-28a-xrpA的细胞膜完整性分别为81.6％、87.9％，说明，酸胁迫导致了粘质沙雷氏菌细胞膜完整性的降低，而DNA结合蛋白XrpA能够提高酸胁迫下细胞膜完整性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种提高粘质沙雷氏菌抗酸胁迫能力的方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Ser Arg Asn Pro Asp Trp His Pro Ala Asp Ile Ile Ala Ala

1 5 10 15

Leu Arg Lys Gln Gly Thr Thr Leu Ala Ala Val Ser Arg Lys Ala Gly

20 25 30

Leu Ser Ser Ser Thr Leu Ala Asn Ala Leu Ser Arg Pro Trp Pro Lys

35 40 45

Gly Glu Trp Leu Ile Ala Glu Ala Ile Gly Ile His Pro Ser Glu Ile

50 55 60

Trp Pro Ser Arg Tyr Tyr Asp Pro His Ser Asp Cys Leu Leu Asp Arg

65 70 75 80

Lys Ala Arg Ile Lys Ser

85

<210> 2

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaattcaa ggaacccaga ttggcatccg gcagatatca tcgcggcgct acgcaagcag 60

ggcaccacgc tggcggcagt gtcgcgcaag gccggattaa gctcatcgac gctggccaat 120

gcgctgtcgc gcccgtggcc gaagggggaa tggctgatcg ccgaagcgat aggcatccac 180

ccttcggaga tctggccaag ccgctattac gatccgcaca gcgattgcct gctggatcgc 240

aaagcacgta tcaaatcgtg a 261

<210> 3

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggataacg gtttggagac tgccgacctg aggttggcgc agcggctggc ggatttgcgc 60

cagcagcggg cgtggtcgct ggaggagttg gcgcagcgca ccggccttag ccgggcgacg 120

ctctcgcggg tggagcgcgc cgagaccagc ccgacggcat cgttgctgaa ccggctgtgc 180

gccgcctacg ggttaaccat gtcgcgcctg ttgagcgaaa tcgaagacga accgccggag 240

ctgctgcggc cgccgcaaca accggtgtgg gtcgatcgcg ccagcggttt tcaccgtcgc 300

tccgtttccc cgcctgccgc gctgtataag gccgagttta tcgaagcccg gcttgatgcc 360

ggcgcgcaga tcgattacga cctgccgtcg attccggcgc tggaacatca cctttggttg 420

ctgtccgggc agttggaatt gaccctggaa gggcgcgttt tccggctgtc ggccggcgac 480

tgcctgcgct accgcctgtt cggcgcctcc cgtttccatg tccccggcga tgagccggcc 540

cattacaccc tcgttatctg caggccatag 570

<210> 4

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgggcagaa cgttggaaca gcttattgcg gatgaaaagc ccgaggtcgt ggccaaagcg 60

caggcgctgg cggcggacat catgctgaac attcaccttg ccgagctgcg tgaaaaagta 120

cagaaaacgc aggttgaaat ggcgcaggcg ctggggatta ggcagccgac cgttgccgtg 180

atggaaaaac cgggccgcga tctgaaactg tcttcgctta aacgctatgt tgaggcggcc 240

ggcggcaaac tgcgcctgga cattgaactg ccggacggct ctcactacga gtttgtgctg 300

taa 303

<210> 5

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcagccccct tgcatatagc gccgcggcgt ggtgccggtg aactggcgga aaaacgcgat 60

aaacgcactg tcgctggaaa accccaaccg ctgcgccacc gcgctgaccg acggcaacga 120

cgccagcagt tcgatcgcgc gcatcagccg ccactgctgg caccactgct gatagctcag 180

gccggtttcc cgctgaaaca gccgcgtcag cgttttggcg tgcaggtgca agcgctgcgc 240

caacgccgcc aacgccggca actcgtcgct ctccggcagc gtcgccagcc aggcggcaag 300

acgcttatcc tgcggcagcc gcaactgggt attctcgcgc tgcgcctcgc ccaactcatt 360

gatcagcacc gccagcaaat cgcgcgcgtg gggctgtgcc aacgcatagt ccagcggcca 420

gtgcgcgatg cgctcgacga tcgccgccaa cagcgggttt accgccagca ccgttgcctg 480

tggcggcatg gcgggcgtca gcgccggatc gaaatacagc gagcgatacg cgacgcggcc 540

gcgcagctgc acccgatgcg caatgccgcc cggtatccag acgctgcgcg tcggcggcag 600

aatcagccac tgctgcgcca acgtgaccgt catgcacccc tgcggcgcat acagcagctg 660

cgaacgctga tgccaatgca gcccggagtc gtgatccgcc agtgccgccg cgatgccgag 720

agccggtgcc ggcagccgat ccgggtcgaa cgggtgatgc tgttgaatca gcgccat 777