阅读说明：本技术 一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌及其构建方法 (super-recombinant mycobacterium smegmatis producing nicotinic acid and construction method thereof ) 是由 詹玉心 吴泽承 周亚凤 王绪德 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌的构建方法,包括步骤：1)构建质粒pMHS-NrtR<Sub>ms</Sub>；2)构建质粒pHAGE-NrtR<Sub>ms</Sub>；3)制备重组TM4噬菌体；4)构建nrtR<Sub>ms</Sub>基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc<Sup>2</Sup>100；5)nudC基因的扩增及构建质粒pMV361-NudC<Sub>ms</Sub>；6)构建nrtR基因敲除/nudC基因过表达的超级重组耻垢分枝杆菌。本发明通过构建nrtR基因敲除且ncdC基因过表达制得超级重组耻垢分枝杆菌,通过本发明制备得到的工程菌可以一步直接获得烟酸,而不依赖于添加3-氰基吡啶,不仅避免了现有在烟酸化学合成过程中的各种缺点,而且生产条件简单,无污染,简便易行,易放大,成本低,适合于大规模工业化生产应用,有很大的推广应用的价值。(the invention provides a construction method of super-recombinant mycobacterium smegmatis for producing nicotinic acid, which comprises the steps of 1) constructing a plasmid pMHS-NrtR ms , 2) constructing a plasmid pHAGE-NrtR ms , 3) preparing a recombinant TM4 bacteriophage, 4) constructing nrtR ms gene deletion strain mycobacterium smegmatis mc 2 100, 5) amplifying a nucd gene and constructing a plasmid pMV361-NudC ms , and 6) constructing nrtR gene knockout/nucd gene overexpression super-recombinant mycobacterium smegmatis.)

一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及烟酸的生产技术领域，具体涉及一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌及其构建方法。

背景技术

烟酸即3-吡啶甲酸，也称作为维生素B3，属于维生素B族，是一种水溶性维生素，属于维生素B族，是人体必需的13种维生素之一。烟酸是机体组织中重要的递氢体和抗糙皮病的因子，有维持皮肤和神经健康，促进消化的作用。若其缺乏时，可产生糙皮病，表现为皮炎、舌炎、口咽、腹泻及烦躁、失眠感觉异常等症状。与烟酰胺统称维生素PP，用于抗糙皮病，亦可用作血扩张药。作为医药中间体，用于异烟肼、烟酰胺、尼可刹及烟酸肌醇酯等的生产。现烟酸也用于粮食制品，肉品添加剂和饲料添加剂以预防糙皮病。特别是饲料中添加烟酸后可提高畜禽的抗病能力，加快生长速度，提高饲料的利用率，可大量节省饲料，降低饲养成本。美国曾喂养用添加烟酸的饲料的喂养奶牛，与对照组相比，产奶量可提高15％-20％。另外烟酸还可作为形成活性污泥的生化激素、空气和废气的除臭剂。烟酸在染料工业、感光材料工业、染发助剂、洗涤剂等方面也有一定的应用。

烟酸的生产目前工业上应用的主要为化学法，合成方法主要有液相法(高锰酸钾氧化法和硝酸氧化法)和气相法(臭氧氧化法、氨氧化法和空气氧化法)，所用原料主要为3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、3-氰基吡啶以及哇琳等。最常用的方法是以3-甲基吡啶为原料用空气氧化法合成烟酸。将3-甲基吡啶、空气和氨气按比例通入流化床反应器中，在290～360℃、V₂O₅催化下反应生成烟腈；再于氢氧化钠水溶液中、160℃下高压水解生成烟酸钠，最后用盐酸酸化得烟酸。在这个合成过程中需要经过烟腈这一部中间产物，烟腈通过化学反应生成水解为烟酸需要高温高压、强酸强碱的条件，对设备具有一定的要求而且也会腐蚀设备，且对环境也不友好。清华紫光公司的专利CN114288A报道了用3-甲基吡啶一步催化生成烟酸，其过程为将3-甲基吡啶与硫酸反应生成甲基吡啶硫酸盐，然后在氧化剂硝酸的作用下氧化生成烟酸硫酸盐，烟酸硫酸盐加入碱溶液中可和制得烟酸，原料收率为90％左右。此过程中需要硫酸、硝酸、碱溶液等强酸强碱物质，污染严重。

在烟酸化学合成过程中，必须具备特定的高温高压环境或者采用强酸、强碱或化学催化剂处理，反应选择性不高，副产物多，产品的收率不高，环境污染大。相对而言，生物法制备烟酸具有底物选择性高、催化效率高、反应条件温和、环境污染小等特点。此外，生物法制备易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用。目前有报道用微生物枯草芽孢杆菌、玫瑰色红球菌、诺卡氏菌、茄病镰刀菌以及恶臭假单胞菌发酵来生物催化3-氰基吡啶制备烟酸。但是，生物催化法制备烟酸主要是依赖于微生物发酵产腈水解酶，通过此酶来催化3-氰基吡啶转化为烟酸，仍然需要添加原料3-氰基吡啶。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供了一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌的构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌的构建方法，包括以下步骤：

1)构建质粒pMHS-NrtR_ms：

1-1)以耻垢分枝杆菌mc²155基因组DNA为模板、SEQ ID No.1～4所示的引物对进行PCR扩增，电泳分离后经Van91I限制性内切酶酶切备用；

1-2)将含有pMHS质粒的大肠杆菌DH5α菌株扩大培养，然后收集菌体，抽提质粒，质粒经Van91I限制性内切酶酶切后电泳分离，回收1600bp区间和3600bp区间的DNA片段；

1-3)将步骤1-1与1-2所获得的DNA片段经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞扩大培养，抽提质粒后获得质粒pMHS-NrtR_ms；

2)构建质粒pHAGE-NrtR_ms：

2-1)分别扩大培养含有质粒pHAGE和质粒pMHS-NrtR_ms的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒，两个质粒经PacI限制性内切酶线性化后再用T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物使用包装试剂盒包装并转化至大肠杆菌HB101感受态细胞扩大培养，抽提质粒后获得质粒pHAGE-NrtR_ms；

3)制备重组TM4噬菌体：

3-1)扩大培养耻垢分枝杆菌mc²155，振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，用预冷的10％无菌甘油洗涤菌体，然后加入预冷的10％的甘油重悬菌体，-80℃冻存备用；

3-2)将质粒pHAGE-NrtR_ms转入耻垢分枝杆菌mc²155电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后电击转化，转化后加入7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜，将37℃放置后的菌液加到含有top agar的EP管中混匀并倾倒平铺在7H10固体平板上，平板置30℃培养箱培养2-3天，获得重组TM4噬菌体；

4)构建nrtR_ms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc²100：

7H9液体培养基培养耻垢分枝杆菌mc²155至对数生长期，离心收集菌体，用MPbuffer洗涤离心获得的菌体，然后用MP buffer重悬菌体，将重悬的耻垢分枝杆菌mc²155与滴度为10¹⁰PFU的重组TM4噬菌体1:1体积混合后培养箱孵育，然后离心收集菌体弃上清后用7H9液体培养基重悬，放置培养箱孵育过夜，再次离心收集菌体弃上清，菌体涂布7H10固体平板培养，获得分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌mc²100；

5)nudC基因的扩增及构建质粒pMV361-NudC_ms：

5-1)nudc基因的扩增：以耻垢分枝杆菌mc²155基因组DNA为模板，使用SEQ IDNo.9～10所示的引物对PCR扩增nudC基因ORF序列，PCR产物经电泳分离回收后使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切，回收酶切后的DNA备用；

5-2)酶切：LB培养含pMV361质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒后使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切，然后进行电泳分离，回收线性化的质粒；

5-3)连接：酶切回收的DNA片段和经同样酶切回收的线性化质粒pMV361经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜，获得质粒pMV361-NudC_ms，所述LB固体平板含100μg/ml硫酸卡那霉素；

6)构建nrtR基因敲除/nudC基因过表达的超级重组耻垢分枝杆菌：

6-1)制备突变耻垢分枝杆菌mc²100感受态细胞：7H9液体培养基培养突变耻垢分枝杆菌mc²100至对数生长期，离心收集菌体，将菌体用预冷的10％无菌甘油至少洗涤两次，最后加入适量预冷的10％的甘油，吹匀菌体后，分装置-80℃冻存备用；

6-2)转化突变耻垢分枝杆菌mc²100：将质粒pMV361-NudC_ms转入突变耻垢分枝杆菌mc²100电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后电击转化，然后加入7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜，然后取适量培养液涂布7H10固体平板，平板置37℃培养箱培养3～5天，获得产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌，所述7H10固体平板含50μg/mL硫酸卡那霉素。

其中，步骤1-2中的扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃过夜培养。

步骤1-3中的扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB固体平板培养基，37℃过夜培养，然后挑取平板上长出的单克隆菌落接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养。

步骤2-1中质粒pHAGE以含有氨苄抗性的LB培养基扩大培养，质粒pMHS-NrtR_ms以含有潮霉素B抗性的LB培养基扩大培养。

步骤2-1中连接产物转化后的大肠杆菌HB101感受态菌株经过扩大培养后再进行质粒抽提，所述扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB固体平板培养基，37℃过夜培养，然后挑取平板上长出的单克隆菌落接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养。

步骤3-1中的扩大培养耻垢分枝杆菌mc²155是将耻垢分枝杆菌mc²155接种于7H9液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至对数生长期，OD600为0.5～1.0；培养物以1:100的比例接种于新鲜的7H9液体培养基中，37℃过夜培养至OD600到0.6。

步骤3中收集菌体的离心条件为4℃，5000rpm离心10min；步骤4中收集菌体的离心条件为6000rpm离心10min；步骤6中收集菌体的离心条件为4℃，5000rpm离心10min。

步骤6-1中的7H9液体培养基培养突变耻垢分枝杆菌mc²100至对数生长期是将突变耻垢分枝杆菌mc²100菌落接种于5mL 7H9液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至对数生长期OD600为0.5～1.0，培养物以1:100的比例接种于新鲜的100mL 7H9液体培养基中，37℃过夜培养至OD600到0.6。

步骤3-2和步骤6-2中的电击转化参数均为电压2.5kV，电阻1000Ω，电容25μF。

步骤5-3后还包括步骤：

5-4)挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养，抽提质粒，获得的质粒使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切后经核酸凝胶电泳检测验证，验证nudC基因ORF序列连接到pMV361载体上，同时验证质粒序列无突变。

步骤6-2后还包括步骤：

6-3)挑取挑取平板上长出来的单克隆子，接种到5mL 7H9液体培养基中培养2-3天至对数生长期，离心收集菌体并提取基因组DNA为模板，使用SEQ ID No.13～14所示的引物对PCR验证pMV361-NudC_ms质粒转入突变耻垢分枝杆菌mc²100中。

本发明的有益效果为：本发明通过构建nrtR基因敲除且ncdC基因过表达制得超级重组耻垢分枝杆菌，通过本发明制备得到的工程菌可以一步直接获得烟酸，而不依赖于添加3-氰基吡啶，不仅避免了现有在烟酸化学合成过程中的各种缺点，而且生产条件简单，无污染，简便易行，易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用，有很大的推广应用的价值。

附图说明

图1为PCR扩增耻垢分枝杆菌mc²155基因电泳图；图1中泳道M：DNA marker；泳道1：如SEQ ID No.6所示的DNA片段；泳道2：如SEQ ID No.5所示的DNA片段；

图2为pMHS质粒酶切后电泳图；图2中泳道M：DNA marker；泳道1：箭头所指的是pMHS质粒酶切后1600bp和3600bp的DNA片段；

图3为pMV361-NudC_ms质粒经EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切后核酸凝胶电泳，M：DNA marker；1～3：阳性质粒；

图4为构建成功的pMV361-NudC_ms质粒图谱示意图；

图5为超级重组耻垢分枝杆菌基因组示意图和验证结果图；图5中A：超级重组耻垢分枝杆菌基因组示意图；图5中B：1：敲除菌株PCR验证图；2：野生型对照菌株；图5中C：PCR验证Pmv361-NudC_ms质粒转入突变耻垢分枝杆菌mc²100的验证图；

图6为野生菌和超级重组菌株培养液滤液及烟酸标准品经HPLC分离色谱图；A：超级重组菌株培养液滤液；B：对照菌株耻垢分枝杆菌mc²155培养液滤液；C：烟酸标准品。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1：构建质粒pMHS-NrtR_ms

1)以耻垢分枝杆菌mc²155基因组DNA为模板、SEQ ID No.1～4所示的引物对进行PCR扩增。如图1所示，PCR产物核酸凝胶电泳分离目的DNA片段，使用Omega公司胶回试剂盒回收如SEQ ID No.5～6所示的目的DNA片段，回收后的DNA均使用Van91I限制性内切酶酶切，并通过Omega公司Cycle-pure回收试剂盒回收酶切后的DNA备用；

2)将含有pMHS质粒的大肠杆菌DH5α菌株接种LB液体培养基(添加150μg/mL潮霉素B)，37℃过夜培养，然后收集菌体，使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的pMHS质粒经Van91I限制性内切酶酶切后进行核酸凝胶电泳，并使用Omega公司胶回收试剂盒回收1600bp和3600bp左右的两条DNA片段(如图2中箭头所示)；

3)将步骤1与2所获得的DNA片段经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布LB固体平板(含150μg/mL潮霉素B)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜后挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基(含150μg/mL潮霉素B)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒使Van91I限制性内切酶酶切后经核酸凝胶电泳检测验证目的DNA片段连接到pMHS载体上，获得阳性质粒pMHS-NrtR_ms。

同时验证正确的质粒pMHS-NrtR_ms经擎科公司测序验证序列无突变。

实施例2：构建质粒pHAGE-NrtR_ms

LB分别培养含有质粒pHAGE(氨苄抗性)和质粒pMHS-NrtR_ms(潮霉素B抗性)的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒，两个质粒经PacI限制性内切酶线性化后再用T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物使用包装试剂盒包装并转化至大肠杆菌HB101感受态细胞，然后涂布在LB固体平板上(含有150μg/mL潮霉素B)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜后挑取平板上长出来的单克隆子，接种LB液体培养基(含150μg/mL潮霉素B)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，抽提质粒后获得质粒pHAGE-NrtR_ms。

实施例3：制备重组TM4噬菌体

1)耻垢分枝杆菌mc²155接种于5mL 7H9液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至对数生长期OD600为0.5～1.0；培养物以1:100的比例接种于新鲜的100mL 7H9液体培养基中，37℃过夜培养至OD600到0.6左右，于4℃，5000rpm离心10min收集菌体，将菌体用预冷的10％无菌甘油至少洗涤两次，最后加入10mL(适量)预冷的10％的甘油，重悬菌体后，分装置-80℃冻存备用；

2)将质粒pHAGE-NrtR_ms转入耻垢分枝杆菌mc²155电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后转入2mm BTX电转杯中，擦净电转杯外壁上的水，然后使用BTX ECM630电转化仪电击，电击参数是：电压2.5kV，电阻1000Ω，电容25μF。电击完后，立即加入1mL 7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜，将37℃放置后的菌液加到含有4mL top agar(Top Agar100mL：Middlebrook 7H9broth 0.47g，Agar 0.75g)的5mL EP管中混匀并倾倒平铺在7H10固体平板上。平板置30℃培养箱培养2～3天，获得重组TM4噬菌体。

实施例4：构建nrtR_ms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc²100

7H9液体培养基培养耻垢分枝杆菌mc²155至对数生长期(OD 0.5-1.0)，6000rpm，10min离心收集菌体，用MP buffer洗涤离心获得的菌体，然后用MP buffer重悬菌体，将重悬的耻垢分枝杆菌mc²155与滴度为10¹⁰PFU的重组TM4噬菌体1：1体积混合后培养箱孵育，然后离心收集菌体弃上清后用7H9液体培养基重悬，放置培养箱孵育过夜，然后6000rpm，10min离心收集菌体弃上清，菌体涂布7H10固体平板培养(含有150μg/mL潮霉素B)，获得分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌mc²100。使用微生物基因组提取试剂盒(Omega)提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用如SEQ ID NO.7～8所示的引物对PCR验证，验证结果图如图5中的B所示。

实施例5：nudC基因的扩增及构建质粒pMV361-NudC_ms

1)nudc基因的扩增：以耻垢分枝杆菌mc²155基因组DNA为模板，使用SEQ ID No.9～10所示的引物对PCR扩增nudC基因ORF序列，PCR产物经核酸凝胶电泳分离目的DNA片段，使用Omega公司胶回试剂盒回收目的DNA片段，经过测序后得到nudc基因ORF序列如SEQ IDNO.11所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。回收后的DNA均使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切，通过Omega公司Cycle-pure回收试剂盒回收酶切后的DNA备用；

2)酶切：LB培养含pMV361质粒的大肠杆菌DH5α菌株，使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的pMV361质粒使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切，然后进行核酸凝胶电泳，最后使用Omega公司胶回收试剂盒回收线性化的质粒；

3)连接：酶切回收的DNA片段和经同样酶切回收的线性化质粒pMV361经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板(含100μg/mL硫酸卡那霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜，获得质粒pMV361-NudC_ms；

4)阳性质粒的筛选：挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养。然后使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切后经核酸凝胶电泳检测验证，nudC基因ORF序列连接到pMV361载体上，验证结果如图3所示。同时验证正确的质粒pMV361-NudC_ms经擎科公司测序验证序列无突变，构建成功的pMV361-NudC_ms质粒图谱示意图如图4所示。

实施例6：构建nrtR基因敲除/nudC基因过表达的超级重组耻垢分枝杆菌

1)制备突变耻垢分枝杆菌mc²100感受态细胞：挑取新鲜的突变耻垢分枝杆菌mc²100菌落接种于5mL 7H9液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至对数生长期(OD0.5～1.0)；培养物以1：100的比例接种于新鲜的100mL 7H9液体培养基中，37℃过夜培养至OD600到0.6左右，于4℃，5000rpm离心10min收集菌体，将菌体用预冷的10％无菌甘油至少洗涤两次，最后加入10mL(适量)预冷的10％的甘油，吹匀菌体后，分装置-80℃冻存备用；

2)转化突变耻垢分枝杆菌mc²100：取构建正确的阳性质粒pMV361-NudC_ms DNA加入200μL的突变耻垢分枝杆菌mc²100电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后转入2mm BTX电转杯中，擦净电转杯外壁上的水，然后使用BTX ECM630电转化仪电击，电击参数是：电压2.5kV，电阻1000Ω，电容25μF。电击完后，立即加入1mL 7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜后取适量培养液涂布7H10固体平板(含50μg/mL硫酸卡那霉素)，平板置37℃培养箱培养3～5天；

3)筛选阳性重组菌：挑取平板上长出来的单克隆子，接种到5mL 7H9液体培养基中培养2～3天至对数生长期，离心收集菌体并使用微生物基因组提取试剂盒(Omega)提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用如SEQ ID NO.13～14所示的引物对PCR验证pMV361-NudC_ms质粒转入突变耻垢分枝杆菌mc²100中，验证结果如图5中的C所示，PCR结果验证菌株已经成功导入。将验证正确的NudC_ms过表达的菌株命名为超级重组耻垢分枝杆菌，超级重组耻垢分枝杆菌基因组示意图如图5中的A所示。

实施例7：检测超级重组耻垢分枝杆菌分泌烟酸

比较分析野生型、nrtR基因敲除/nudC基因过表达的超级重组耻垢分枝杆菌2种菌的烟酸分泌水平。

将nrtR基因敲除/nudC基因过表达的超级重组耻垢分枝杆菌接种7H9液体培养基，37℃培养至对数生长期后，使用Millipore 0.22μm无菌滤器过滤培养液并收集过滤的滤液，然后使用Millipore 3-kDa超滤浓缩管去除滤液中的蛋白质等大分子并收集过滤后滤液。获取的滤液使用高效液相色谱仪(HPLC)分离并分析烟酸。

HPLC具体的条件：

设备型号：Thermo Fisher Scientific UltiMate 3000 ultrahigh-performanceliquid chromatography；

色谱柱：Thermo Fisher，Hypersil Gold aQ，150×4.6mm，3μm，柱温：30℃；

流动相：水相：去离子水(含0.1％甲酸)；

有机相：乙腈；

梯度洗脱：0min时，95％水相+5％有机相；

30min时，5％水相+95％有机相；

流速：0.3mL/min；

进样量：10μL；

波长：284nm；

HPLC结果如图6所示，显示NrtR基因敲除/nudC基因过表达的超级重组耻垢分枝杆菌培养液中含有烟酸。

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌及其构建方法

<130> 2019

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttttttttcc ataaattgga gcatgccacc ggtcgacag 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttttttttcc atttcttggg aacctggaac acgacggcg 39

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ttttttttcc atagattggg tcaccgacga gttcgctgc 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttttttttcc atcttttggt cagcagcacg ggtggattc 39

<210> 5

<211> 868

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

agcatgccac cggtcgacag gatcttgacg cggtcttcgg ggaccgcgcc ctcgcctgcg 60

aggtacagcg ccgacgtggc gcagccgcac tcggggtgca cgaacagctc ggcatcgggg 120

tgcgaacggg cctgggccgc gagttcgtcg ccgttgatgc cggcgtggac gtggcactca 180

ccggcccaca cgtgcatgtt cttgcggccc gtgacgcgcc ggacgtgggc gccgaggaac 240

tggtcggggc agaacagcac ctcgcggtcc tcggggatgg acgccacgac ctcgacggcg 300

ttggacgacg tgcagcagat gtcggtcagg gctttcaccg cggcggtggt gttgacgtag 360

gacacgacga ccgcccctgg atggtcgtcc ttccacgcct ggagttcctc ggcggtgatc 420

gaatcggcca gcgagcaccc ggcccgctga tccgggatca gcaccgtctt gtcggggctg 480

aggatcttgg cggtctcggc catgaagtgc acgccgcaga acacgatggt gtcctcgggc 540

gcctcggccg cgatgcggga cagcgcgagg gagtccccga cgtgatcggc gacgtcctgg 600

atggcaggca actggtagtt gtgcgccagc agcgtcgcgc cgcgcagctc gacgagccgg 660

cgcacttccg cggcccactg ctcgtcgccg tcgatgcccg aatagccgcc ggggccgtcc 720

acaatccggt ccgcgagggc ccctgcgggc gttccgttga gcacggtcac ggtggcctcc 780

tcatcgagtt caggttttcg acttataatc gaaaacatgc ccaatcgtag caccgcccac 840

gaagtgctcg ccgtcgtgtt ccaggttc 868

<210> 6

<211> 1099

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gtcaccgacg agttcgctgc gttgcgaccg cccgggtgag tcggctggac tcttagacct 60

ttcttaagca agaatgcccg gatggacttg tccagcgccg cgaaagccgc cgatgccgaa 120

tggatcgggc gcgcaccgca cgaggaactc gaccgcgacg cgcggccggg gctccccggt 180

gaagatccgt tctatctgcc gccggccggc taccaccacg ccgaacccgg aacggtgctg 240

cgcagccgcg acgtcgaact cgcgttcctc gggctggtcc cccaggccct gcacgccacc 300

cagctgctgt accgcaccac cgatcgcaac ggcgctcccg aggccgcggt caccacggtg 360

atcatgccgc ccgacgcgcg cgcgggctgc ccgatcgtgt cctaccagtg cgcgatcgac 420

gcgatctcgg ccacgtgctt cccgtcgtac gcgctgcgcc gtcacgccaa ggtcaccggt 480

ggcctcgccc agttcgagct cctgctgatc accgcggcgc tggccgaggg ctgggccgtc 540

tcggtgcccg accacgaagg cctcgacggc atgtggggcg cgccgtacga acccgggtac 600

cacgtgctcg acgggctgcg tgccgcgctg aactccgagc gcctgcccct gaccgacgcg 660

tcgcccatcg gcctgtgggg ctactcgggc ggcggtctgg caagtggctg ggccgcggag 720

atgagcggct cctacgcccc cgagctcaac atcgtcggcg ccgtactcgg ttcgccggtc 780

ggcgatctgg gccacacgtt ccggcggctc aacggcacgg tgttctcggg actgcccgca 840

ctcgtcgtcg ccgccctcgc cgacatctac ccgggcctca atcgggtcat cgccgagcac 900

gcgaccaccg agggccgcaa gctgctgcag cgcctgcaca agatgagcac catcgaggcc 960

gtgctgcggc tggcgcgcaa ggacatggac gacctggtcg acctgccgct cgaacagatc 1020

ctcgacagcc ccgaggtcac cgaggtcttc gacgacatca aactcggtgt ggcgacaccg 1080

aatccacccg tgctgctga 1099

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gacgaggcac cgcagcaa 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tcgaggagac cgagatcagc 20

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atcgggatcc atgagcgaac accgcacgt 29

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tgcaaagctt tcagtcgagt gcggcccagg 30

<210> 11

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

atgagcgaac accgcacgtt cgggctccgt aacgtcccgc tgctgtcccg ggtcggcgcc 60

gatcgcgccg ataccttgcg caccgacgtc gacgccgccc tggcgggctg gcccgacgcg 120

ctggtgctac gcgtggaccg ccgcaaccag gtgctcatcg ccaacggtca ggtggtgctc 180

ggtgaggccg gcgcactcgg agaccggccg cccgagcacg cggtgttcct gggacgtctg 240

caggacggca ggcacgtatg gggtatccgg gcggatctgg aggcgcccga ggatgccgac 300

ctggggaccg aggtgctcga cctgcgccgg gccgggcaga tcttcgacga caccagcgcc 360

cagttggtgg cgaccgccac ggcgctgctc aactggcatg acaacgcgcg gcacagcgcg 420

atcgacgggg cgccgacccg gcccgccaag ggcggctggt cgcgcgtcaa cccgctgacc 480

ggccacgagg agttcccgcg gatcgacccc gccatcatct gcctggtgca cgacgggcat 540

gaccgggcgg tgctggcccg tcagacgctg tggccggagc ggttgttctc gatcctggcc 600

ggcttcgtcg aggccggcga gtcgttcgag acatgcgtgc agcgcgagat cgccgaggag 660

atcgggctca cggtcaccga cgtgcagtac ctcggcagtc agccgtggcc gttcccgcgc 720

tcgctcatgg tgggattcca cgcgatcggc gacccggagc agccgttctc ctacaacgac 780

ggcgagatcg ccgaggccgc gtggttcacc cgcgatgaga tccgcgcggc actcgatcag 840

ggggactgga acagcgactc gccgtcacgg ctcctgctgc caggctccat ctcgatcgcc 900

cgcgagatca tcgaatcctg ggccgcactc gactga 936

<210> 12

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 12

Met Ser Glu His Arg Thr Phe Gly Leu Arg Asn Val Pro Leu Leu Ser

1 5 10 15

Arg Val Gly Ala Asp Arg Ala Asp Thr Leu Arg Thr Asp Val Asp Ala

20 25 30

Ala Leu Ala Gly Trp Pro Asp Ala Leu Val Leu Arg Val Asp Arg Arg

35 40 45

Asn Gln Val Leu Ile Ala Asn Gly Gln Val Val Leu Gly Glu Ala Gly

50 55 60

Ala Leu Gly Asp Arg Pro Pro Glu His Ala Val Phe Leu Gly Arg Leu

65 70 75 80

Gln Asp Gly Arg His Val Trp Gly Ile Arg Ala Asp Leu Glu Ala Pro

85 90 95

Glu Asp Ala Asp Leu Gly Thr Glu Val Leu Asp Leu Arg Arg Ala Gly

100 105 110

Gln Ile Phe Asp Asp Thr Ser Ala Gln Leu Val Ala Thr Ala Thr Ala

115 120 125

Leu Leu Asn Trp His Asp Asn Ala Arg His Ser Ala Ile Asp Gly Ala

130 135 140

Pro Thr Arg Pro Ala Lys Gly Gly Trp Ser Arg Val Asn Pro Leu Thr

145 150 155 160

Gly His Glu Glu Phe Pro Arg Ile Asp Pro Ala Ile Ile Cys Leu Val

165 170 175

His Asp Gly His Asp Arg Ala Val Leu Ala Arg Gln Thr Leu Trp Pro

180 185 190

Glu Arg Leu Phe Ser Ile Leu Ala Gly Phe Val Glu Ala Gly Glu Ser

195 200 205

Phe Glu Thr Cys Val Gln Arg Glu Ile Ala Glu Glu Ile Gly Leu Thr

210 215 220

Val Thr Asp Val Gln Tyr Leu Gly Ser Gln Pro Trp Pro Phe Pro Arg

225 230 235 240

Ser Leu Met Val Gly Phe His Ala Ile Gly Asp Pro Glu Gln Pro Phe

245 250 255

Ser Tyr Asn Asp Gly Glu Ile Ala Glu Ala Ala Trp Phe Thr Arg Asp

260 265 270

Glu Ile Arg Ala Ala Leu Asp Gln Gly Asp Trp Asn Ser Asp Ser Pro

275 280 285

Ser Arg Leu Leu Leu Pro Gly Ser Ile Ser Ile Ala Arg Glu Ile Ile

290 295 300

Glu Ser Trp Ala Ala Leu Asp

305 310

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gtggcagcga ggacaacttg 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gatgcctggc agtcgatcgt ac 22